Summary
Utfordrende unge nerveceller i nye områder av hjernen kan avsløre viktig innsikt i hvordan miljøet sculpts neuronal skjebne og modning. Denne protokollen beskriver en prosedyre for å høste interneuron forløpere fra bestemte hjernen regioner og transplantere dem enten homotopically eller heterotopically i hjernen av postnatal pups.
Abstract
Neuronal skjebne besluttsomhet og modning krever en intrikat samspill mellom genetiske programmer og Miljøsignaler. Men er disentangling rollene iboende vs ytre mekanismer som regulerer differensiering prosessen en gåte for alle utviklingsmessige neurobiologists. Dette problemet er forstørret for GABAergic interneurons, en utrolig heterogene celle befolkningen som er født fra forbigående embryonale strukturer og gjennomgå en langvarig vandrende fase å spre gjennom telencephalon. For å utforske hvordan ulike hjernen miljøer påvirker interneuron skjebne og modning, utviklet vi en protokoll for høsting fluorescently merket umodne interneuron forløpere fra bestemte hjernen regioner i nyfødte mus (P0-P2). I denne alderen, interneuron overføringen er nesten fullført og disse cellene er bosatt i sin siste hvile miljøer med relativt liten synaptic integrering. Følgende samling av enkeltcelle løsninger via flowcytometri, disse interneuron prekursorer er transplanted inn i P0-P2 wildtype postnatal pups. Ved å utføre både homotopic (f.eks cortex-til-cortex) eller heterotopic (f.eks cortex-til-hippocampus) transplantasjoner, man kan vurdere hvordan utfordrende umodne interneurons i nye hjernen miljøer påvirker deres skjebne, modning og krets integrering. Hjernen kan høstes i voksen mus og assayed med et bredt utvalg av posthoc analyse på podet cellene, inkludert immunohistochemical, elektrofysiologiske og transcriptional profilering. Denne generelle tilnærmingen gir etterforskerne med en strategi for å analysen hvordan forskjellige hjernen miljøer kan påvirke mange aspekter av nervecellen utvikling og identifisere om spesifikke neuronal egenskaper er hovedsakelig drevet av fastkoblet genetiske programmer eller miljømessige signaler.
Introduction
Riktig kortikale funksjon krever en balanse mellom eksitatoriske projeksjon neurons og hemmende GABAergic interneurons, en svært heterogen befolkning med forskjellige morphologies, elektrofysiologiske egenskaper, tilkobling og nevrokjemiske markører. Unormal utvikling og funksjon av interneurons (og bestemte interneuron undergrupper) har vært knyttet til pathobiology av psykiske lidelser som schizofreni, autisme og epilepsi1,2,3. Videre er mange gener involvert i disse hjernen lidelser sterkt beriket i unge interneurons4. Dermed er større forståelse av mekanismer som regulerer interneuron skjebne besluttsomhet og modning nødvendig å forstå normal utvikling og potensielle etiologies av mange brain sykdommer.
Forebrain interneurons er født hovedsakelig fra to forbigående embryonale strukturer, de mediale og caudal ganglionic eminences (MGE og CGE, henholdsvis). Disse postmitotic cellene (interneuron forløpere) deretter gjennomgå en langvarig tangentiell migrasjon fase å spre gjennom telencephalon der de integrere i en rekke kretser. MGE-avledet interneurons består av tre i stor grad ikke-overlappende, neurochemically definert undergrupper: rask skyter parvalbumin (PV+) interneurons, ikke-fast skyter somatostatin (SST+) interneurons, og sent skyter neuronal nitrat oksid syntase (nNOS+) interneurons som utgjør hippocampus neurogliaform og ivy celler. Mange labs har identifisert flere mekanismer i MGE som regulerer første skjebne beslutninger i PV+ eller SST + interneurons, inkludert romlige graderinger av morphogens, fødselsdato av interneuron prekursorer og modus for neurogenic divisjon 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. det har blitt foreslått at interneurons først skille ut "kardinal klasser" og deretter gradvis moden til "definitive klasser" når de samhandler med deres miljø11. Nyere bevis indikerer at noen eldre interneuron undertyper kan Hardwired genetisk som disse cellene blir postmitotic i de ganglionic eminences, som indikerer at tidlig definerte iboende genetiske programmer kan spille en større rolle enn tidligere verdsatt12,13. Viktige spørsmålet om hvordan de iboende genetiske programmene samhandler med miljømessige signaler til stasjonen differensiering inn forskjellige interneuron subtyper imidlertid stort sett uutforsket.
Tallrike studier har transplantert embryonale MGE celler direkte inn i forskjellige områder av hjernen, med konsensus resultater som podet celler modne og slipp GABA å hemme generelt lokale endogene krets14,15, 16,17,18,19. Dette lovende observasjoner har generert betydelig interesse i å bruke menneskelige indusert pluripotent stilk cellen (hIPSC)-avledet interneurons for å behandle en rekke brain sykdommer. Men tenker svært få av disse studiene vurdere om disse podet cellene eldre inn i forventet typer av eldre interneurons, en kritisk komponent når man på translasjonsforskning tilnærminger.
For å løse hvordan miljø påvirker interneuron differensiering og modning, var en strategi konstruert for å transplantere umodne interneuron forløpere til nye hjernen miljøer for å undersøke om podet interneurons vedta funksjoner av verten miljø eller beholde funksjoner fra donor miljø20. MGE transplantasjoner er ikke egnet til å løse dette spørsmålet fordi MGE inneholder en blandet befolkning av interneuron og GABAergic projeksjon celler som spre seg gjennom mange hjernen regioner21. Uten å vite hvor disse MGE cellene ville har migrert, kan en ikke fullt ut vurdere hvordan disse transplantasjoner påvirkes av hjernen miljøet. Ved å høste interneuron forløpere på tidlig postnatal timepoints, problemet er circumvented ved å skaffe umodne celler som har fullført sine og nådde målet hjernen regionen, men har minimal interaksjon med miljøet. Ved å fokusere på bestemte funksjoner i interneurons som er ulikt uttrykt mellom forskjellige hjernen, kan en så bestemme hvordan vertsmiljøet endrer interneuron egenskaper. Den generelle tilnærmingen i denne protokollen skal gjelder for en etterforsker at ønsker å undersøke hvordan unge neurons oppføre seg når utfordret i et nytt miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til National Institutes of Health veiledning og ble godkjent av NICHD Animal Care og bruk Committee (ACUC). Protokollen beskrevet nedenfor benytter Nkx2.1-grobunnC / +; Ai9+ / pups for å høste MGE-avledet interneuron forløpere, men kan utføres på ønsket fluorescerende reporter musen linjer. Både mannlige og kvinnelige tidlig postnatal mus (P0-P2) ble brukt ukritisk giver og vert vev.
1. løsning forberedelse
- Forberede sukrose kunstig cerebrospinalvæske (sACSF) i henhold til følgende oppskrift (enhet i mM): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glukose, 75 sukrose mettet med 95% O 2, 5% CO2 ved pH = 7.4.
- Fyll et beaker med 350 mL ren ddH2O basert på endelige ønsket (500 mL sACSF bør være nok for 1-2 kull), legger en magnetic røre bar og begeret på rør platen.
- Vekt alle salter (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glukose, sukrose), en samtidig og legge til vannet i henhold til følgende tabell. Beløp kan justeres avhengig endelige ønsket.
Reagens Molekylvekt Konsentrasjon (mM) Gram/500 mL Natriumklorid 58.44 87 2,54 Natriumbikarbonat 84.01 26 1.09 Kalium klorid 74.55 2.5 0.09 Natrium fosfat monobasic 119.98 1.25 0,08 Glukose 180.16 10 0,9 Sukrose 342.3 75 12.84 - Boble løsningen med 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) i minst 20-30 minutter før du legger til riktig mengde CaCl2 (0,25 mL fra en 1 M løsning for 500 mL sACSF) og MgCl2 (3,5 mL fra en 1 M løsning for 500 mL sACSF) .
- Sjekk pH bruker en standard pH-meter. Hvis forberedt riktig, løsningen bør ha pH = 7.4.
- Få løsningen til siste bind i 500 mL med ren ddH2O i en uteksaminert sylinder.
- sACSF kan være forberedt til 1-2 dager fremover. Før bruk, plasser på is og boble med carboxygen i minst 15 minutter før starten av disseksjon, og holde flaske sACSF boblende gjennom dissection.
2. disseksjon forberedelse
- Følgende verktøy skal steriliseres/autoklaveres: minst en liten fin skarp saks, 2 fine tang (stil #5), buet fine tang, hjernen snitting matrisen mugg og flere barberblad. En liten spatel fjerne hjernen fra skallen er valgfritt.
- Definert arbeider stasjonen ved disseksjon mikroskop med petri retter (9 cm og 4 cm diameter) 50 mL konisk plastrør samle regionene isolert hjernen store bar plast overføring Pipetter, alle holdt på is. Forbered flere 50 mL rør full av carboxygenated sACSF på is. Hvis dissekere flere hjernen regionen, pass på å riktig og klart etiketten både samling rør og overføre Pipetter å unngå forurensning.
- Har en ekstra isen bøtte for is anestesi av pups via nedkjøling og en skikkelig spesialavfall bag av skrotter.
- Forberede brann-polert glass Pasteur Pipetter vev føden. Bruk en bunsen brenner å sterilisere og forme spissen av pipette. Forbered flere Pipetter med forskjellige bar åpninger: store (~ 600 µm), medium (~ 300 µm) og små (~ 100 µm). Teste ut flyt gjennom tips med vann for å sikre forskjellige føden hastigheter. Minst en pipette for hver type kreves for hver isolert hjernen regionen, men har flere ekstra for hver størrelse anbefales ved tilstopping eller bryte tips.
3. transplantasjon forberedelse
- Bruk en elektrode avtrekker for å forberede tynn glass Mikropipetter. Bryte eller skråkant spissen for å gjøre en skarp vinklet punkt, spissen har en diameter på ~ 20-40 µm. visuelt inspisere tips med et mikroskop for å sikre at ingen støv eller rester glass partikler hindre blenderåpning.
- Bruker en tynn nål sprøyte, fylle glass brønnene med mineralolje. Sett inn brønnene i Nanoject apparatet (eller andre microinjection enheter). Nanoject III, satt opp følgende program: volum = 60 nL, Rate = 30, sykluser = 25, forsinkelse = 1 s.
- Sikre Nanoject til manipulatoren som er knyttet til en magnetisk basis, og justere manipulatoren slik at Nanoject peker rett ned, ikke vippet langs x- eller y aksen.
- Feste en selvklebende putty (~ 1-2 cm til P0-P2 pups) til toppen av forsiden av en Petriskål oppretter en opphøyd overflate å hvile det pup hode på.
- Kutt ~ 6-8 cm lang striper av lab tape og lage en diamant-formet hull i midten. Båndet skal brukes til å stabilisere leder av pup under inngrepet, samtidig strekk huden og gir enkel visualisering landemerker og målrettet regionen.
- Forberede en varmeputen injeksjon ligger, og slå på 'lav' innstilling før du starter injeksjoner. Dekke puten med noen papirhåndklær eller en bleie pad.
- Hvis utfører flere transplantasjon betingelser, har en liten saks klar til å utføre pups toe/hale klipping merke mottar annerledes innsprøytninger.
4. fjerning av P0-P2 musen hjernen
- Rett før du starter prosedyren, fyll flere petri retter med kaldt, carboxygenated sACSF. Også fylle samlingen lysrør med ~ 25 mL sACSF.
- Pakk en P0-P2 pup i noen parafilm eller en hanske og sted den godt dekket under isen. Angi en tidtaker i 5 minutter og starte den. Etter fjerner pup og sjekke at det ikke svarer til klyper i hindpaw.
- Halshugge pup og samle hodet i en Petriskål fylt med sACSF. Kuttet huden langs midtlinjen å avsløre skallen.
- Finn åpningen i skallen på hindbrain/ryggmargen og stikk den ene enden av pinsett langs dorsal del av skallen. Forsiktig ta tak skallen på midtlinjen og skrelle bort stykker sidelengs for å avsløre hjernen, være forsiktig med å skade hjernen.
- Ved fjerning av den rygg og laterale delen av skallen, bruk tang eller spatula Fjern hjernen fra skallen av scooping under ventrale overflaten av hjernen, prøver ikke å skade et område. Plass hjernen i en Petriskål fylt med carboxygenated sACSF.
Merk: Vi presenterer to forskjellige strategier for dissekere ut hippocampus, striatum og cortex. Første strategi (trinn 5.1-5.10) er nyttig for alle mus linje mens den andre strategien (trinn 6.1-6,7) må fluorescerende reporter mus rent skille striatum fra globus pallidus og andre hjernen strukturer. Hvis striatum ikke er ønskelig, deretter ignorere striatum-spesifikke delene av to teknikker
Figur 1 : Skjematisk og bilder for hjernen disseksjon, teknikken #1
Disseksjon teknikken beskrevet i trinnene 5.1-5.10. Hvis striatal vev, plass P1 hjernen i hjernen matriser ventral side opp. Plasser barberblad i matrisen sporene gjennom fremre hjernen å få framskaffet gjennom striatum. Fjern striatal stykker fra begge halvkuler, Gjenta for alle inndelingene som inneholder striatum som fremre hippocampus. Hvis striatal vev ikke er ønskelig, bare hemisect hjernen, plasser halvkuler mediale siden opp i retten, og fjerne det ventrale-mediale hjerne strukturen (thalamus, Basalgangliene, etc.) for å avsløre hippocampus. Bruke pinsett for å klype hippocampus, deretter snu halvkule og bruke pinsett for å analysere ut en del av kortikale vev. De vertikale svarte linjene gjennom skjematisk halvkuler hvor kutt vil være å fjerne delene striatal. Skala bar = 500μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. høste Striatum, Hippocampus og Cortex, teknikken #1
- Plassere hele hjernen på snitting matrisen mold, ventral side opp. Sted 1 barberblad gjennom mest fremre delen av hjernen (gjennom fremre olfactory luftveiene).
- Sett inn en annen barberblad bare bakre for det første å generere en 0,5 mm skive, og Plasser en ekstra barberblad bakre til denne.
- Overføre disse sektorene til en Petriskål med carboxygenated sACSF og plasser resten av hjernen til en egen rett med sACSF. Overføre striatal skiver til et dissecting område å visualisere striatum. Disse skiver bør inneholde store deler av den fremre striatum og mangler hippocampus. Bruke en fluorescerende dissekere omfang med Nkx2.1-grobunn+/-; Ai9+/- skiver å skille svak striatal tdTomato signal fra sterke tdTomato signalet fra globus pallidus.
- Med eller uten fluorescens, klemme ut striatum fra begge halvkuler på alle inndelingene og overføre striatal biter til riktig merket 50 mL tube med sACSF, lagre på is.
- Hemisect hjernen langs midtlinjen tang eller et barberblad, og legge halvkulen slik at mediale overflaten vender.
- Fjerne ventrale hjernevev (thalamus, Basalgangliene, etc) ved klemming av dette vevet med tang. Når fullført, hippocampus (en pølse formet struktur som strekker seg over anteroposterior aksen langs dorsal cortex) og ventrikkel side av cortex skal være synlig.
- Fjerne hippocampus, sette inn tips av Tang foran fremre hippocampus og forsiktig skille hippocampus fra cortex ved å flytte tang posteriorly og knipe langs hippocampus-kortikale grensen. Overføre isolert hippocampus til riktig merket 50 mL tube med sACSF, lagre på is.
- Hvis du vil analysere cortex, plass hemisected cortex mediale siden. Deretter bruke pinsett for å klemme den mest dorsal, ventral, fremre og bakre del av cortex å forlate en firkantet del av mediale somatosensory cortex, ~ 2 mm x 2 mm. Vend cortex så medial side opp og ren av eventuelle overskytende ikke-kortikale vev (thalamus Basalgangliene, etc.) på medial overflaten om nødvendig. Overføre cortex delen til riktig merket 50 mL tube med sACSF, lagre på is.
- Gjenta med den andre halvkulen samle både hippocampi og cortex regioner.
- Gjenta dette for alle pups, sørge for å erstatte sACSF i petri retter mellom pups å sikre at sACSF forblir kald og frisk.
Figur 2 : Skjematisk og bilder for hjernen disseksjon, teknikken #2
Disseksjon teknikken beskrevet i trinnene 6.1-6.7. Feste hjernen på en dissecting parabolen dorsal side opp. Etter peeling cortex fremover, hippocampus og striatum er synlige og kan fjernes, så en del av cortex kan fjernes som beskrevet i forrige teknikk. Avhengig av transgene musen linje, kan striatum renses fjerne globus pallidus og annet vev. I Nkx2.1Cre; Ai9 mus linje, globus pallidus har en betydelig høyere tetthet av tomat + celler sammenlignet striatum. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. høste Striatum, Hippocampus og Cortex, teknikken #2
- Plasser siden hjernen ventrale ned i en sylgard-belagt Petriskål som inneholder sACSF og feste det gjennom lillehjernen og fremre cortex eller olfactory pærer.
- Starter med en halvkule, bruke buede tang forsiktig skille bakre cortex fra underliggende hippocampus og annet vev. Forsiktig Legg skrelles cortex flatt på Petriskål. Gjenta for andre halvkule. Hippocampi og striatum skal være synlig i utsatte hjernen.
- Bruk tang til å klemme en hippocampus på midtlinjen og Skrell hippocampus sidelengs å fjerne. Plasser i samlingen hetteglass på is og gjenta med andre hippocampus.
- For striatum, forsiktig skrape rundt kantene av striatum å løsne det fra de omkringliggende vev. Deretter fjerne striatum ved å klemme den av fra under og legge til samling rør på is. Gjenta for andre striatum.
- Kortikale inndelinger kan høstes som beskrevet i trinn 5,8.
- Hvis bruker en transgene reporter musen linje (f.eks Nkx2.1-grobunn; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), overføre striatum til en Petriskål med sACSF og se under fluorescerende dissekere omfang. Bruke pinsett fjerne alle ikke-striatal vev fra striatum (i Nkx2.1-grobunn; Ai9 mus, fjerne alle 'lys' vev, som globus pallidus har mye høyere MGE-avledet, tdTomato + celle kompakthet sammenlignet striatum). Gjenta for alle striatum.
- Gjenta dette for alle pups, sørge for å erstatte sACSF i petri retter mellom pups å sikre at sACSF forblir kald og frisk.
7. generere enkeltcelle Dissociations
- Etter dissection er ferdig, Forbered en 1 mg/mL Pronase løsning av veier 10 mg Pronase og oppløses i 10 mL carboxygenated sACSF.
- Overføring vev fra 50 mL samling hetteglass til 5 mL rundt bunnen rør som inneholder 2 mL av Pronase-sACSF løsning. Inkuber vevet etter 20 min i romtemperatur, risting/flicking røret 3 - 4 ganger med fingeren under inkubasjonen å blande prøvene.
- Under denne inkubasjon forberede rekonstituering løsning: 1% FBS (100 μL) + DNAse (1 μL 1:10,000 lager DNAse) i 10 mL carboxygenated sACSF.
- Etter 20 minutter, nøye fjerne den pronase løsningen å ikke forstyrre vevet nederst, og erstatte den med 1-2 mL rekonstituering løsningen (totalt volum er avhengig starter mengden vev).
- Mekanisk distansere vev av triturating vev med tidligere forberedt på brann-polert Pasteur pipetter. Starter med store bar (~ 600 µm) pipette, Sug opp og utvise vev løsningen minst ti ganger for å bryte opp vev. Ikke innføre bobler i løsningen. Gjenta denne prosessen for mediet bar pipette og små bar pipette. Løsningen skal skyet og ingen klart del av skal vises i samling rør.
- Pipetter celle lysate løsningen gjennom et 50 µm filter i 5 mL konisk rør for å fjerne en celle grupperer. Fortsette med disse enkeltcelle løsninger på flow cytometri (eller potensielt direkte til celle teller hvis ingen sortering er nødvendig).
8. forberedelser FACS-renset celle løsninger for transplantasjon
- Ved mottak celle løsningene fra flyt cytometer, overføre løsningen til en (eller flere) 1.5 mL konisk rør og spinne cellene på 500 g i 5 min på 4oC. Etter sentrifugering, fjerne media slik at ~ 20-40 µL forblir i røret. Rekonstituer celler i denne gjenværende media (og kombinere løsning hvis flere rør var nødvendig).
- På et lite stykke parafilm, bland sammen 2 µL av cell løsningen + 8 µL sACSF + 10 µL av trypan blå flekken. Pipetter 10 µL i en hemocytometer med Skyv dekselet.
- Teller antallet lever celler i hver av de 4 x 4 firkantet rutenettene i hjørnene av hemocytometer ved hjelp av en standard laboratorium hånd telleapparat teller (død celler blir blå fra fargebad), og gjennomsnittlig disse 4 teller. Multipliser dette tallet med 100 for å bestemme antall celler per µL.
- Hvis nødvendig, Juster volumet slik at cellene er i en konsentrasjon av 10000-30000 celler/µL i rekonstituering løsning. Siste konsentrasjonen er avhengig av antall celler og ønsket antall transplantasjoner. Holde celler på is transplantasjon
9. transplantasjon i P0-2 WT Pups
- Pakk en WT pup i noen parafilm eller en hanske og sted den godt dekket under isen. Still et tidsur for 5 min og starte den. Etter fjerner pup og sjekke at det ikke svarer til klyper i hindpaw.
- Mens pup er på is, blande celle løsningen av pipettering det flere ganger å sikre celle suspensjon er godt blandet før lasting (blande cellene før lasting brønnene for hver injeksjon). Deretter tomme brønnene av mineralolje og fylle det helt med cellen suspensjon.
- Plass bedøvet pup på Petriskål med hodet liggende på selvklebende putty slik at toppen av hodet er relativt flatt. Plass båndet med diamant hullet i hodet av det pup, trekke det stram å sikre huden strekkes og hodet er fast, men at musen er komfortabel og pustende godt. Lambda skal vises gjennom diamant hullet.
Figur 3 : Skjematisk og bilder for transplantasjon
(A) bilder av injeksjon oppsett. Merk at lambda er tydelig gjennom det pup skallen og bør brukes for nullstilling av brønnene. Skala bar = 1 tomme. (B) skjematisk viser injeksjon prosedyren for å målrette hippocampus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Flytte sikret pup under Nanoject og lavere i brønnene slik at spissen av brønnene er rett over lambda. Spille inn x-og y-koordinater på manipulatoren.
- Justere manipulator knottene til å flytte brønnene til ønsket koordinatene langs mediolateral og anteroposterior aksen av hodet: S1 Cortex → 1.0 mm fremre og 1.0 mm lateral, Hippocampus → 0,75-1.0 mm fremre og 1.0-1.2 mm lateral, Striatum → 2.0-2,2 mm fremre og 1,5 mm lateral. Koordinatene kan justeres litt for å kompensere for alderen av pup (f.eks P0 vs P2) eller belastningen av mus (f.eks CD1 mus er større enn og C57/B6 på P2).
- Senk brønnene til den danner en liten concavity på huden. Slå deretter z manipulator knotten bestemt, men forsiktig å kjøre brønnene gjennom huden og kraniet angi hjernen. Når brønnene kommer til hjernen, trykket på skallen frigis og concavity vil forsvinne.
- Trekke i brønnene litt til spissen er omgitt av en membran av huden, formet som et telt. Avlese koordinatene langs z-akser: Dette blir det z null-punktet.
- Lavere brønnene til ønsket dybde: Cortex → 0,75-1.0 mm, Hippocampus → 1.2-1,5 mm, Striatum → 2.0-2.5 mm. dybde kan justeres litt for å kompensere for alder eller stamme av valp.
- Sette inn cellen suspensjon bruke programmet Nanoject III som beskrevet ovenfor. Etter injeksjon programmet er fullført, vente 15-20 s før sakte trekke brønnene mulig løsning lekker ut av injeksjonsstedet.
- Hvis utføre bilaterale injeksjoner, nytt null brønnene over lambda og flytter til de riktige koordinatene i den andre halvkulen. Alternativt kan man gjøre to injeksjoner i cortex av samme halvkule ved å flytte brønnene 1 mm fremre av første injeksjon.
- Når transplantasjon er fullført, Fjern båndet og overføre pup på oppvarming pad. Hvis nødvendig, tag pup av hale eller toe klipping. Når valpen har reacquired en rød farge og beveger seg, sett den tilbake i buret med mor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen demonstrerer hvordan du høste bestemte hjernen regioner fra tidlig postnatal hjerner (figur 1-2), samle enkelt celle dissociations av interneuron prekursorer og transplantere disse cellene i ulike områder av hjernen i naiv WT Postnatal pups (Figur 3). For posthoc analyse, ble hjernen som fikk interneuron forløper grafts høstet mellom P30-35 å karakterisere celle morfologi, nevrokjemiske markører og elektrofysiologiske egenskaper. Slike analyser er ofte utført mellom P21-P30 i normal mus, men siden modning av transplantert celler kan være litt forsinket på grunn av disseksjon/dissosiasjon prosedyren, venter ytterligere 5-10 dager anbefales å kompensere for dette forsinket kjønnsmodning. Typen analyse utført vil diktere riktig strategi å høste hjernen. Spesielt observerer vi ikke fortrinnsrett celledød av bestemte interneuron undergrupper som kunne lede for eller mot visse subtyper20.
For immunohistochemical analyse, mus var parfyme med 4% paraformaldehyde og hjernen ble fjernet. 50 μm vibratome skiver var forberedt gjennom målrettet hjernen regionen og lagret i frostvæske løsning og/eller behandlet for immunostaining som beskrevet tidligere20. Noen hjernen inneholder tomat + celler, som kan være upassende målretting (f.eks injeksjon for dypt i ventrikkel), celler mistet eller gjennomgår apoptose under pode prosedyren, eller avvisning av transplantert celler av verten. Basert på siste celletall, det anslås at bare 2-5% av podet celler overleve20, som er i tråd med andre transplantasjon prosedyrer22,23.
Ikke overraskende, var det betydelig variasjon i antall tomat + celler i vellykket transplantasjon, alt fra dusinvis til flere tusen tomat + celler (figur 4A). Podet celler ble lokalisert i riktig regioner, med mange interneuron morphologies og godt karakterisert interneuron nevrokjemiske markører (figur 4B). Lignende cellen overlevelse tallene og modning profiler ble observert selv når celler ble podet inn i nye miljøer i heterotopic transplantasjoner (figur 4C).
I tillegg til immunohistochemical analyse, ble elektrofysiologiske analyse på podet celler gjennomført for å bekrefte at de har integrert i hjernen krets og vise forventede iboende og skyte. Hjernen ble høstet fra P30-35 mus og skiver forberedte fysiologiske innspillinger som tidligere beskrevet20. Podet interneurons presentert voksen-lignende fysiologiske egenskaper og distinkte avfyring mønstre kan være preget som var representant for godt karakterisert interneuron undertyper (figur 5A), tyder på at podet interneurons kunne riktig modne i vertsmiljøet. For å bekrefte at transplantert celler ble integrert i nevrale nettverk, var sEPSCs også registrert (figur 5B). I tillegg et delsett av transplantasjon ble utført med interneurons uttrykke ChR2 etterfulgt av opptak fra pyramideformet celler lokalisert nær transplantert interneurons. Disse dataene vist at postsynaptic GABAergic strøm er fremkalt av blått lys (figur 5C-D).
Figur 4 : Podet interneuron forløpere fylle host hjernen regioner representant inndelinger fra P30 WT mus som ble transplantert med tomat + interneuron forløpere på P1. (A) i homotopic cortex-til-cortex transplantasjoner, podet cellene fylle alle kortikale lag og vise morphologies som etterligner endogene interneurons. Valgte bilder markere variasjon i cellen tallene fra forskjellige transplantasjon, med venstre bildet har en mye større antall tomat + celler per seksjon sammenlignet transplantasjon på høyre side. (B) lav forstørrelse (venstre) og forstørring (høyre) representant fra homotopic hippocampus til hippocampus grafts. Merk at fleste av tomat + celler i stratum oriens (så) express SST (sannsynligvis O-LM celler) mens mange tomat + celler i stratum pyramidale (SP) express PV (sannsynligvis kurv celler), ligner på endogene hippocampus interneurons. (C) eksempel på en heterotopic transplantasjon (Cortex-til-Striatum) med tomat + i striatum. Skalere barer = 200 μm i A i lav mag-panelet i B, 50 μm i C og høy effekt mag i B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Podet interneurons er electrophysiologically modne og integrere i vert nevrale nettverk
(A) Representative eksempler på de høyeste avfyring frekvensene registreres fra podet interneurons. Venstre, rask skyter interneuron fra en Hip-til-Ctx pode, injisert gjeldende trinn:-100 pA og 520 pA; høyre, ikke-Fast skyter interneuron fra en Ctx til Ctx pode, injisert gjeldende trinn:-100 pA og 360 pA. (B) eksempel på sEPSCs registrert i en sent skyter interneuron fra en hofte til hofte transplantasjon. (C) representativt bilde viser Nkx2.1-grobunn; Ai32 celler (YFP) fra en Ctx-til-Ctx transplantasjon med en biocytin fylt (rød) pyramideformet celle. Skala bar = 50 μm. (D) eksempel på en GABAergic postsynaptic strøm fremkalt av blå lyspulser registrert i pyramideformet celler, med en [145 mM] Cl-. I svart, gjennomsnittlig spor; i rødt, gjennomsnittlig responstid registrert i nærvær av Gabazine. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En viktig del av denne protokollen er maksimere survivability av cellene. Sikre at vev og celler er alltid i iskalde carboxygenated sACSF er nødvendig for å fremme cellen overlevelse. Dette krever en effektiv disseksjon og dissosiasjon strategi for å minimere tiden cellene bruker ulike løsning og utenfor hjernen miljøet. Hvor mange områder av hjernen er dissekert og transplantert, kan det være gunstig å ha en partner hjelpe i disseksjon og/eller transplantasjon trinnene å redusere lengden på eksperimentet. For å sikre helse og overlevelse av pup, er det også viktig å minimere is anestesi tiden (< 4 min) og holde pup oppvarmet med lys under transplantasjon prosedyren.
Det kan være betydelig variasjon i transplantert hjernen, noen kan ikke inneholde podet celler mens andre hjernen vil inneholde tusenvis. Kombinere flere P0-P2 kull for disseksjon kan øke antall celler høstet for pode, som gjør det mulig å enten øke transplantasjon celle tetthet og/eller øke antall podet pups, begge vil øke sannsynligheten for vellykket transplantasjoner. Hvis du vil målrette riktig hjernen regionen, er det avgjørende at det pup hode er stabilisert og flyttes ikke når senking av brønnene i hjernen. Enhver forskyvning av hodet eller bøye av brønnene akselen kan resultere i mistargeting og unøyaktig injeksjoner (for eksempel tap av celler i laterale ventrikkel). Utfører flere injeksjon områder per pup (ensidig eller bilateralt) kan også forbedre suksessrate i tilfelle en injeksjonsstedet er mistargeted. I fremtiden, ville det være optimalt å utvikle en mer effektiv stereotaxic strategi for å stabilisere pup og gir mer nøyaktig og konsekvent injeksjoner.
Th P0-P2 tidsramme ble valgt både vitenskapelige og tekniske grunner. I denne alderen, de fleste interneuron forløpere har migrert til sine terminal nettsteder, men har minimal miljømessige interaksjoner. Denne tidsrammen kan ikke gjelder for andre nevrale celletyper og områder av hjernen, så en kan du justere disse timepoints for deres spesifikke formål. For eksempel det ville være interessant å sammenligne terapeutiske potensialet i disse P0-P2 høstet interneuron forløpere med MGE-høstet celler: en alder kan ha flere fordeler og/eller mindre uønskede bivirkninger enn de andre. I tillegg kan det være interessant å utføre heterochronic transplantasjon (f.eks samle celler på P0-P2 og transplantere inn i P7-10 hjerner, eller vice versa) til å identifisere hvor tidsmessige endringer i miljøet kan påvirke celle skjebne og modning. Fordelen med å utføre injeksjoner på P0-2 er at skallen er relativt spinkle og kan lett gjennomsyret med skarpe brønnene. Alle injeksjoner over P5 må fjerne eller tynning skallen.
Analysen beskrevet i denne protokollen er begrenset til bestemte kjennetegner interneuron undertypene som uttrykkes ulikt mellom områder av hjernen. I fremtiden, kan en benytte kraften i enkeltcelle sekvensering å karakterisere den fulle transcriptome av podet celler. Denne upartiske tilnærming kan identifisere bestemte gener (eller større signalnettverk cascades) som er sterkt beriket eller oppbrukt i transplantert celler sammenlignet med kontroller, som vil gi innsikt i kandidat miljømessige signaler som vil påvirke skjebnen bestemmelse eller modning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health (K99MH104595) og NICHD intramural forskningsprogrammet til T.J.P. Vi takker Gord Fishell, i lab der denne tilnærmingen ble opprinnelig etablert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
