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Neuroscience

जल्दी जन्मोत्तर माउस दिमाग में न्यूरॉन अग्रदूतों के Homochronic ट्रांसप्लांटेशन

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57723
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Kavli Institute for Systems Neuroscience and Centre for Neural Computation, Norwegian University of Science and Technology, 2Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health

Summary

नए मस्तिष्क क्षेत्रों में युवा ंयूरॉंस को चुनौती देने में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रकट कर सकते है कैसे वातावरण ंयूरॉन भाग्य और परिपक्वता । इस प्रोटोकॉल एक प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से ंयूरॉन अग्रदूतों फसल और उंहें या तो homotopically या heterotopically जन्मोत्तर पिल्ले के मस्तिष्क में प्रत्यारोपण ।

Abstract

ंयूरॉन भाग्य दृढ़ संकल्प और परिपक्वता आनुवंशिक कार्यक्रमों और पर्यावरण संकेतों के बीच एक जटिल पुनरावृत्ति की आवश्यकता है । हालांकि, आंतरिक बनाम बाह्य तंत्र है कि इस भेदभाव की प्रक्रिया को विनियमित की भूमिकाएं विरूद्ध सभी विकासात्मक neurobiologists के लिए एक पहेली है । इस मुद्दे GABAergic ंयूरॉंस के लिए बढ़ाया है, एक अविश्वसनीय रूप से विषम कोशिका आबादी है कि क्षणिक भ्रूण संरचनाओं से पैदा होता है और एक लंबी प्रवासी दौर से गुजरना telencephalon भर में फैलाने के लिए । कैसे अलग मस्तिष्क वातावरण न्यूरॉन भाग्य और परिपक्वता को प्रभावित करने का पता लगाने के लिए, हम फ्लोरोसेंट में नवजात चूहों (P0-P2) विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से अपरिपक्व ंयूरॉन के अग्रदूतों लेबल कटाई के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है । इस उम्र में, न्यूरॉन प्रवास लगभग पूरा हो गया है और इन कोशिकाओं को अपेक्षाकृत कम synaptic एकीकरण के साथ अपने अंतिम विश्राम के वातावरण में रह रहे हैं. फ्लो cytometry के माध्यम से एकल कोशिका समाधान के बाद संग्रह, इन न्यूरॉन पुरोगामी P0-P2 wildtype जन्मोत्तर पिल्ले में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. दोनों homotopic प्रदर्शन करके (जैसे, प्रांतस्था-to-प्रांतस्था) या heterotopic (जैसे, प्रांतस्था-to-हिप्पोकैम्पस) प्रत्यारोपण, एक का आकलन कर सकते हैं कैसे चुनौतीपूर्ण नए मस्तिष्क वातावरण में अपरिपक्व न्यूरॉन्स उनके भाग्य को प्रभावित करता है, परिपक्वता, और सर्किट एकीकरण. दिमाग वयस्क चूहों में काटा जा सकता है और immunohistochemical, electrophysiological और transcriptional profiling सहित, भ्रष्टाचारी कोशिकाओं पर posthoc विश्लेषण की एक विस्तृत विविधता के साथ परख की । यह सामांय दृष्टिकोण परख कैसे अलग मस्तिष्क वातावरण ंयूरॉन विकास के कई पहलुओं को प्रभावित कर सकते है और अगर विशिष्ट ंयूरॉंस विशेषताओं मुख्य रूप से hardwired आनुवंशिक कार्यक्रमों द्वारा संचालित कर रहे है की पहचान के लिए एक रणनीति के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है या पर्यावरणीय cues ।

Introduction

उचित cortical समारोह उत्तेजक प्रक्षेपण ंयूरॉंस और निरोधात्मक GABAergic न्यूरॉन्स, विशिष्ट morphologies, electrophysiological गुण, संपर्क और neurochemical के साथ एक अत्यंत विषम जनसंख्या के बीच एक संतुलन की आवश्यकता है मार्करों. असामान्य विकास और न्यूरॉन्स के समारोह (और विशिष्ट न्यूरॉन उपसमूहों) इस तरह के एक प्रकार का पागलपन के रूप में मनोरोग विकारों के pathobiology से जोड़ा गया है, आत्मकेंद्रित और मिर्गी1,2,3. इसके अलावा, इन मस्तिष्क विकारों में फंसा कई जीन दृढ़ता से युवा ंयूरॉंस में समृद्ध कर रहे है4। इस प्रकार, तंत्र की एक बड़ी समझ है कि ंयूरॉन भाग्य निर्धारण और परिपक्वता को विनियमित करने के लिए सामांय विकास और कई मस्तिष्क रोगों के संभावित etiologies समझ की जरूरत है ।

Forebrain न्यूरॉन्स मुख्य रूप से दो क्षणिक भ्रूण संरचनाओं से पैदा होते हैं, औसत दर्जे का और caudal ganglionic eminences (MGE और CGE, क्रमशः). इन postmitotic कोशिकाओं (न्यूरॉन पुरोगामी) तो एक लंबी telencephalon भर में फैलाने के लिए जहां वे सर्किट की एक विस्तृत विविधता में एकीकृत से गुजरना स्पर्श प्रवास के चरण से गुज़रना । MGE-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स तीन बड़े पैमाने पर गैर अतिव्यापी, neurochemically परिभाषित उपसमूह से मिलकर बनता है: फास्ट spiking parvalbumin (पीवी+) न्यूरॉन्स, गैर तेजी से spiking सोमेटोस्टैटिन (एसएसटी+) न्यूरॉन्स, और देर से spiking न्यूरॉन्स नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (nNOS+) न्यूरॉन्स कि हिप्पोकैम्पस neurogliaform और आइवी कोशिकाओं का गठन. कई प्रयोगशालाओं MGE के भीतर कई तंत्र की पहचान की है कि PV+ या एसएसटी में प्रारंभिक भाग्य फैसलों को विनियमित + न्यूरॉन्स, morphogens के स्थानिक ढाल सहित, न्यूरॉन पुरोगामी की जन्मतिथि, और तंत्रिकाजन्य विभाजन के मोड 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. यह प्रस्तावित किया गया है कि न्यूरॉन्स शुरू में ' कार्डिनल वर्गों ' में अंतर और फिर उत्तरोत्तर ' निश्चित वर्गों ' में परिपक्व के रूप में वे अपने11पर्यावरण के साथ बातचीत. हाल ही में सबूत इंगित करता है कि कुछ परिपक्व न्यूरॉन उपप्रकार आनुवंशिक रूप से hardwired के रूप में इन कोशिकाओं ganglionic eminences में postmitotic हो सकता है, यह दर्शाता है कि जल्दी परिभाषित आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों से पहले एक बड़ी भूमिका निभा सकता है 12,13की सराहना की । हालांकि, कैसे आंतरिक आनुवंशिक कार्यक्रमों पर्यावरण cues के साथ बातचीत करने के लिए अलग न्यूरॉन उपप्रकार में भेदभाव ड्राइव के प्रमुख सवाल काफी हद तक बेरोज़गार रहता है ।

कई अध्ययनों से भ्रूण MGE कोशिकाओं प्रत्यारोपण किया है सीधे मस्तिष्क क्षेत्रों की एक किस्म में, आम सहमति परिणामों के साथ कि भ्रष्टाचारी कोशिकाओं परिपक्व और रिलीज गाबा आम तौर पर स्थानीय अंतर्जात सर्किट को बाधित करने के लिए14,15, 16,17,18,19. इन आशाजनक टिप्पणियों ने मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hIPSC) का उपयोग करने में महत्वपूर्ण रुचि उत्पन्न की है-मस्तिष्क रोगों की एक किस्म का इलाज करने के लिए न्यूरॉन्स व्युत्पंन. हालांकि, इन अध्ययनों से बहुत कुछ अगर इन भ्रष्टाचारी कोशिकाओं परिपक्व न्यूरॉन्स, एक महत्वपूर्ण घटक है जब एक शोधों के दृष्टिकोण के बारे में सोचता है की उंमीद प्रकार में परिपक्व का आकलन ।

पता करने के लिए कैसे पर्यावरण ंयूरॉन भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित करता है, एक रणनीति को नए दिमाग के वातावरण में अपरिपक्व ंयूरॉन अग्रदूतों प्रत्यारोपण के लिए तैयार किया गया था ताकि जांच के लिए कि भ्रष्टाचारी न्यूरॉन्स मेजबान की सुविधाओं को अपनाने पर्यावरण या दाता पर्यावरण20से सुविधाओं को बनाए रखने । MGE प्रत्यारोपण उपयुक्त इस सवाल का पता नहीं है क्योंकि MGE ंयूरॉन और GABAergic प्रक्षेपण कोशिकाओं है कि कई मस्तिष्क क्षेत्रों21भर में फैलाने की एक मिश्रित जनसंख्या शामिल हैं । जाने बिना जहां इन MGE कोशिकाओं चले गए होंगे, एक पूरी तरह से आकलन नहीं कर सकते है कि कैसे इन प्रत्यारोपण मस्तिष्क पर्यावरण से प्रभावित हैं । जल्दी जन्मोत्तर timepoints में न्यूरॉन पुरोगामी की कटाई करके, इस समस्या को अपरिपक्व कोशिकाओं है कि उनके प्रवास को पूरा कर लिया है और उनके लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र पर पहुंच गया है, लेकिन पर्यावरण के साथ ंयूनतम बातचीत प्राप्त करने से दरकिनार कर दिया है । अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच अंतर व्यक्त कर रहे हैं कि न्यूरॉन्स की विशिष्ट सुविधाओं पर ध्यान केंद्रित करके, एक तो यह निर्धारित कर सकते हैं कि कैसे मेजबान वातावरण न्यूरॉन गुण बदलता है. सामांय दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित किसी भी अंवेषक है कि कैसे युवा ंयूरॉंस व्यवहार जब एक नए वातावरण में चुनौती दी जांच करना चाहता है के लिए लागू होना चाहिए ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं के अनुसार स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ आयोजित किया गया और niched पशु देखभाल और उपयोग समिति (ACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया । प्रोटोकॉल का उपयोग नीचे वर्णित nkx 2.1-CreC/ Ai9+/- पिल्ले फसल के लिए MGE-व्युत्पंन ंयूरॉंस, लेकिन किसी भी वांछित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइन पर किया जा सकता है । दोनों पुरुष और महिला जल्दी जन्मोत्तर चूहों (P0-P2) दाता और मेजबान ऊतक के लिए धड़ल्ले से इस्तेमाल किया गया ।

1. समाधान तैयारी

  1. सुक्रोज कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (sACSF) निम्नलिखित नुस्खा के अनुसार तैयार करें (मिमी में इकाई): ८७ NaCl, 26 NaHCO3, २.५ KCl, १.२५ णः2पो4, ०.५ CaCl2, 7 MgCl2, 10 ग्लूकोज, ७५ सुक्रोज संतृप्त के साथ ९५% हे 2, 5% सह पीएच में2 = 7.4 ।
  2. ३५० मिलीलीटर शुद्ध ddH2के साथ एक चोंच भरें O अंतिम वांछित मात्रा के आधार पर (sACSF के ५०० मिलीलीटर 1-2 कूड़े के लिए पर्याप्त होना चाहिए), एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें और हलचल प्लेट पर चोंच जगह है ।
  3. वजन सभी लवण (NaCl, NaHCO3, KCl,2पीओ4, ग्लूकोज, सुक्रोज), एक समय में एक और निम्न तालिका के अनुसार पानी के लिए जोड़ सकते हैं । मात्रा अंतिम वांछित मात्रा के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।
    अभिकर्मक आण्विक वजन एकाग्रता (मिमी) ग्राम 500 मिलीलीटर/
    सोडियम क्लोराइड ५८.४४ ८७ २.५४
    सोडियम बिकारबोनिट ८४.०१ 26 १.०९
    पोटेशियम क्लोराइड ७४.५५ २.५ ०.०९
    सोडियम फॉस्फेट monobasic ११९.९८ १.२५ ०.०८
    ग्लूकोज १८०.१६ 10 ०.९
    Sucrose ३४२.३ ७५ १२.८४
  4. ९५% ओ2के साथ समाधान बुलबुला, 5% सह2 (carboxygen) CaCl2 (०.२५ मिलीलीटर के लिए एक 1 मीटर समाधान से ५०० मिलीलीटर sACSF) और MgCl2 (३.५ एमएल के लिए एक 1 एम समाधान से ५०० मिलीलीटर sACSF की उचित मात्रा जोड़ने से पहले कम से 20-30 मिनट के लिए) .
  5. एक मानक पीएच मीटर का उपयोग कर पीएच की जांच करें । सही ढंग से तैयार है, तो समाधान pH = ७.४ होना चाहिए ।
  6. एक एेसे सिलेंडर में शुद्ध ddH2ओ के साथ ५०० मिलीलीटर के अंतिम खंड के समाधान लाओ ।
  7. sACSF को आगे 1-2 दिन तक तैयार किया जा सकता है । उपयोग करने से पहले, बर्फ और carboxygen के साथ बुलबुले पर जगह से कम 15 मिनट के लिए विच्छेदन के शुरू होने से पहले, और विच्छेदन भर bubbling sACSF की बोतल रखो ।

2. विच्छेदन तैयारी

  1. निम्नलिखित उपकरणों को निष्फल किया जाना चाहिए/autoclaved: एक छोटा सा ठीक तेज कैंची, 2 ठीक संदंश (शैली #5), घुमावदार ठीक संदंश, मस्तिष्क अनुभाग matrice मोल्ड और कई उस्तरा ब्लेड. खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के लिए एक छोटा सा रंग वैकल्पिक है ।
  2. पेट्री व्यंजन (9 सेमी और 4 सेमी व्यास), ५० एमएल शंकु प्लास्टिक ट्यूब अलग मस्तिष्क क्षेत्रों और बड़े बोर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट, सभी बर्फ पर रखा इकट्ठा करने के लिए के साथ विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के पास काम स्टेशन सेट करें । कई ५० मिलीलीटर बर्फ पर carboxygenated sACSF से भरा ट्यूब तैयार । यदि एक से अधिक मस्तिष्क क्षेत्र विदारक, ठीक से और स्पष्ट रूप से दोनों संग्रह ट्यूबों लेबल और हस्तांतरण पिपेट के लिए संदूषण से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
  3. हाइपोथर्मिया के माध्यम से पिल्ले की बर्फ संज्ञाहरण के लिए एक अतिरिक्त बर्फ बाल्टी है, और एक उचित खतरनाक अपशिष्ट बैग लावे के निपटान के लिए ।
  4. टिशू trituration के लिए आग-पॉलिश्ड ग् पाश्चर पिपेट तैयार करें । एक bunsen बर्नर का उपयोग करने के लिए बंध्याकरण और पिपेट की नोक आकार । विभिंन बोर उद्घाटन के साथ कई पिपेट तैयार: बड़े (~ ६०० µm), मध्यम (~ ३०० µm) और छोटे (~ १०० µm) । अलग trituration गति सुनिश्चित करने के लिए पानी का उपयोग कर सुझावों के माध्यम से बाहर का परीक्षण । प्रत्येक प्रकार के कम से एक पिपेट प्रत्येक पृथक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए आवश्यक है, लेकिन प्रत्येक आकार के लिए कई अतिरिक्त होने कॉलेस्ट्रॉल या तोड़ने के सुझावों के मामले में सिफारिश की है ।

3. रोपाई की तैयारी

  1. ठीक-इत्तला दे दी ग्लास micropipettes तैयार करने के लिए एक इलेक्ट्रोड खींचने का उपयोग करें । तोड़ या बेवल टिप एक तेज angled बिंदु बनाने के लिए, टिप के साथ ~ 20-40 µm । नेत्रहीन एक खुर्दबीन के साथ सुझावों का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई धूल या अवशिष्ट कांच कणों एपर्चर निरोधक हैं ।
  2. एक ठीक सुई सिरिंज का प्रयोग, पूरी तरह से खनिज तेल के साथ कांच micropipette भरें । Nanoject उपकरण (या अंय microinjection डिवाइस) में micropipette संमिलित करें । Nanoject III के लिए, निम्न प्रोग्राम सेट करें: वॉल्यूम = ६० nL, दर = 30, चक्र = 25, विलंब = 1 s.
  3. एक चुंबकीय आधार से जुड़ा है कि जोड़तोड़ करने के लिए Nanoject सुरक्षित है, और Nanoject सीधे नीचे इशारा कर रहा है कि इतना जोड़ तोड़, एक्स या वाई धुरी के साथ झुका नहीं है कि जोड़तोड़ समायोजित करें ।
  4. कुछ चिपकने वाला पुटी (~ 1-2 सेमी P0-P2 पिल्ले के लिए) एक पेट्री एक ऊंचा सतह बनाने के लिए पर है पिल्ला सिर आराम के कवर के शीर्ष करने के लिए संलग्न ।
  5. कट ~ 6-8 सेमी लैब टेप की लंबी धारियों और बीच में एक हीरे के आकार का छेद करते हैं । टेप प्रक्रिया के दौरान पिल्ला के सिर को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि भी त्वचा खींच और स्थलों की आसान दृश्य और लक्षित क्षेत्र की अनुमति ।
  6. इंजेक्शन स्टेशन के बगल में एक हीटिंग पैड तैयार करें, और इंजेक्शन शुरू करने से पहले ' कम ' सेटिंग चालू करें । पैड यह कुछ कागज तौलिए या एक डायपर पैड के साथ कवर ।
  7. यदि कई प्रत्यारोपण की स्थिति प्रदर्शन, एक छोटे से पैर की अंगुली के लिए अलग इंजेक्शन प्राप्त पिल्ले टैग करने के लिए तैयार कैंची है ।

4. P0-P2 माउस मस्तिष्क को हटाने

  1. सही प्रक्रिया शुरू करने से पहले, ठंडा, carboxygenated sACSF के साथ कई पेट्री व्यंजन भरें । इसके अलावा संग्रह ट्यूब (ओं) के साथ ~ 25 मिलीलीटर sACSF भरें ।
  2. कुछ parafilm या एक दस्ताने में एक P0 P2 पिल्ला लपेटें और यह अच्छी तरह से बर्फ के नीचे कवर जगह है । 5 मिनट के लिए एक टाइमर सेट और इसे शुरू करते हैं । उस समय के बाद, पिल्ला निकालें और जांच करें कि यह hindpaw की चुटकी के लिए जवाब नहीं है ।
  3. Decapitate पिल्ला और sACSF से भरा एक पेट्री पकवान में सिर इकट्ठा । खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए midline के साथ त्वचा में कटौती ।
  4. hindbrain/रीढ़ की हड्डी में खोपड़ी में खोलने का पता लगाने और खोपड़ी के पृष्ठीय भाग के साथ संदंश के एक छोर डालें । धीरे midline पर खोपड़ी समझ और ' छील दूर टुकड़े बाद में मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए, मस्तिष्क को नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है ।
  5. खोपड़ी के पृष्ठीय और पार्श्व भागों को हटाने पर, संदंश या रंग का उपयोग करने के लिए धीरे मस्तिष्क की ventral सतह के नीचे स्कूप द्वारा खोपड़ी से मस्तिष्क को दूर करने के लिए, किसी भी क्षेत्र को नुकसान नहीं की कोशिश कर रहा । carboxygenated sACSF से भरी एक और पेट्री डिश में ब्रेन प्लेस ।
     
    नोट: हम हिप्पोकैम्पस, striatum और प्रांतस्था बाहर विदारक के लिए दो अलग रणनीति पेश करते हैं । पहली रणनीति (5.1 कदम-5.10) दूसरी रणनीति जबकि किसी भी माउस लाइन के लिए उपयोगी है (कदम 6.1-6.7) एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस की आवश्यकता को साफ globus pallidus और अंय मस्तिष्क संरचनाओं से striatum अलग होगा । यदि striatum वांछित नहीं है, तो दो तकनीकों के striatum-विशिष्ट भागों पर ध्यान न दें

Figure 1
चित्रा 1 : योजनाबद्ध और मस्तिष्क विच्छेदन, तकनीक #1 के लिए छवियां
विच्छेदन तकनीक चरण 5.1-5.10 में वर्णित है । यदि striatal ऊतक वांछित है, मस्तिष्क मैट्रिक्स ventral पक्ष में P1 मस्तिष्क जगह है । striatum के माध्यम से राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए पूर्वकाल मस्तिष्क के माध्यम से matrice स्लॉट में उस्तरा ब्लेड प्लेस । दोनों गोलार्द्धों से striatal टुकड़ों को निकालें, striatum वाले सभी वर्गों के लिए दोहराएँ जो हिप्पोकैम्पस के लिए पूर्वकाल हैं. यदि striatal ऊतक वांछित नहीं है, बस मस्तिष्क hemisect, गोलार्द्धों औसत पक्ष की ओर पकवान में जगह है, और ventral-औसत दर्जे का मस्तिष्क संरचनाओं (thalamus, बेसल गैंग्लिया, आदि) को हटाने के लिए हिप्पोकैम्पस को बेनकाब । हिप्पोकैम्पस की चुटकी के लिए चिमटी का प्रयोग करें, तो गोलार्द्ध पर फ्लिप और cortical ऊतक का एक हिस्सा बाहर काटना करने के लिए चिमटी का उपयोग करें । योजनाबद्ध गोलार्द्धों के माध्यम से ऊर्ध्वाधर काले लाइनों जहां कटौती striatal वर्गों को दूर करने के लिए किया जाएगा । स्केल बार = ५०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. फसल Striatum, हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था, तकनीक #1

  1. matrice मोल्ड, ventral पक्ष ऊपर की ओर पूरे मस्तिष्क प्लेस । (पूर्वकाल घ्राण पथ के माध्यम से) मस्तिष्क के सबसे पूर्वकाल भाग के माध्यम से 1 उस्तरा ब्लेड प्लेस ।
  2. एक और उस्तरा ब्लेड डालें बस पहले एक को ०.५ mm टुकड़ा उत्पंन करने के पीछे, और एक अतिरिक्त उस्तरा ब्लेड इस एक के पीछे जगह है ।
  3. इन स्लाइस को carboxygenated sACSF के साथ एक पेट्री डिश में ट्रांसफर करें और बाकी ब्रेन को sACSF के साथ एक अलग डिश में लगाएं । striatum को विज़ुअलाइज़ करने के लिए striatal स्लाइस को एक विदारक दायरे में स्थानांतरित करें. इन स्लाइस पूर्वकाल striatum और कमी हिप्पोकैम्पस के बड़े हिस्से को शामिल करना चाहिए । nkx के साथ एक फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश का प्रयोग करें 2.1-Cre+/ Ai9+/- स्लाइस से कमजोर striatal tdTomato सिग्नल को globus pallidus के मजबूत tdTomato सिग्नल से अलग करें ।
  4. के साथ या प्रतिदीप्ति के बिना, सभी वर्गों पर दोनों गोलार्द्धों से striatum बाहर चुटकी और ठीक से sACSF, बर्फ पर स्टोर के साथ ५० मिलीलीटर ट्यूब लेबल के लिए striatal हिस्सा हस्तांतरण ।
  5. संदंश या एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग midline के साथ मस्तिष्क Hemisect, और इतना है कि औसत दर्जे का सतह का सामना करना पड़ रहा है गोलार्द्ध करना ।
  6. संदंश के साथ इस ऊतक बंद चुटकी द्वारा ventral मस्तिष्क ऊतक (thalamus, बेसल गैंग्लिया, आदि) निकालें । जब पूरा, हिप्पोकैम्पस (एक सॉसेज आकार का anteroposterior अक्ष पृष्ठीय प्रांतस्था के साथ फैले संरचना) और प्रांतस्था के वेंट्रिकुलर पक्ष स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए ।
  7. हिप्पोकैम्पस को हटाने के लिए, पूर्वकाल हिप्पोकैम्पस के सामने संदंश के सुझावों को डालें और प्रांतस्था को पीछे की ओर ले जाकर संदंश से हिप्पोकैम्पस को धीरे से अलग करें और हिप्पोकैम्पस-cortical बॉर्डर पर चुटकी लें । sACSF के साथ ठीक से लेबल ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए अलग हिप्पोकैम्पस स्थानांतरण, बर्फ पर स्टोर ।
  8. प्रांतस्था को काटना करने के लिए, hemisected प्रांतस्था औसत दर्जे की ओर नीचे रखें । तो संदंश का प्रयोग सबसे पृष्ठीय, ventral, पूर्वकाल और प्रांतस्था के पीछे भागों चुटकी के लिए औसत दर्जे का somatosensory प्रांतस्था का एक चौकोर हिस्सा छोड़, ~ 2 मिमी x 2 मिमी । प्रांतस्था तो औसत दर्जे का पक्ष ऊपर है और किसी भी अतिरिक्त गैर के साफ-cortical ऊतक (thalamus , बेसल गैंग्लिया, आदि) औसत दर्जे की सतह पर यदि आवश्यक हो । प्रांतस्था खंड sACSF के साथ ठीक से लेबल ५० मिलीलीटर ट्यूब, बर्फ पर स्टोर स्थानांतरण ।
  9. hippocampi और प्रांतस्था दोनों क्षेत्रों को एकत्र करने के लिए अन्य गोलार्द्ध के साथ प्रक्रिया को दोहराएँ.
  10. सभी पिल्ले के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ, सुनिश्चित करें कि sACSF ठंडा और ताजा रहता है के लिए पिल्ले के बीच पेट्री व्यंजन में sACSF की जगह सुनिश्चित कर.

Figure 2
चित्रा 2 : योजनाबद्ध और मस्तिष्क विच्छेदन, तकनीक #2 के लिए छवियां
विच्छेदन तकनीक चरण 6.1-6.7 में वर्णित है । एक विच्छेदन डिश पृष्ठीय ओर ऊपर पर मस्तिष्क पिन । प्रांतस्था आगे छीलने के बाद, हिप्पोकैम्पस और striatum दिखाई दे रहे है और हटाया जा सकता है, तो प्रांतस्था के एक खंड के रूप में पिछली तकनीक में वर्णित हटाया जा सकता है । ट्रांसजेनिक माउस लाइन पर निर्भर करता है, striatum globus pallidus और अन्य ऊतक को दूर करने के लिए साफ किया जा सकता है । nkx में 2.1 cre; Ai9 माउस लाइन, globus pallidus टमाटर की एक काफी उच्च घनत्व + कोशिकाओं striatum की तुलना में है । स्केल बार = ५०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

6. फसल Striatum, हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था, तकनीक #2

  1. मस्तिष्क ventral एक sylgard-लेपित पेट्री sACSF युक्त पकवान में नीचे की ओर रखें और यह सेरिबैलम और पूर्वकाल प्रांतस्था या घ्राण बल्ब के माध्यम से नीचे पिन ।
  2. एक गोलार्द्ध के साथ शुरू, घुमावदार संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे अंतर्निहित हिप्पोकैम्पस और अन्य ऊतक से पीछे प्रांतस्था अलग. धीरे से पेट्री डिश पर खुली प्रांतस्था फ्लैट रखना । अंय गोलार्द्ध के लिए दोहराएं । Hippocampi और striatum उजागर मस्तिष्क में स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए ।
  3. संदंश का उपयोग करने के लिए एक हिप्पोकैम्पस चुटकी midline और छील हिप्पोकैम्पस बाद में हटाने के लिए । बर्फ पर संग्रह शीशी में जगह और अंय हिप्पोकैम्पस के साथ दोहराएं ।
  4. striatum के लिए, धीरे striatum के किनारों के आसपास परिमार्जन करने के लिए यह आसपास के ऊतकों से ढीला । तो नीचे से इसे बंद चुटकी से striatum निकालें और बर्फ पर संग्रह ट्यूब को जोड़ने । अंय striatum के लिए दोहराएं ।
  5. Cortical अनुभागों को चरण ५.८ में वर्णित के रूप में काटा जा सकता है ।
  6. यदि ट्रांसजेनिक रिपोर्टर माउस लाइन का उपयोग कर रहा है (उदा., nkx 2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, आदि), पेट्री और फ्लोरोसेंट विदारक गुंजाइश के तहत देखने के साथ एक sACSF डिश के लिए striatum हस्तांतरण । striatum से किसी भी गैर-striatal ऊतक को निकालने के लिए संदंश का उपयोग करें ( nkx 2.1-Cre में; Ai9 चूहों, सभी ' उज्ज्वल ' ऊतक निकालें, के रूप में globus pallidus बहुत अधिक है MGE-व्युत्पंन, tdTomato + सेल घनत्व striatum की तुलना में) । सभी striatum के लिए दोहराएँ ।
  7. सभी पिल्ले के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ, सुनिश्चित करें कि sACSF ठंडा और ताजा रहता है के लिए पिल्ले के बीच पेट्री व्यंजन में sACSF की जगह सुनिश्चित कर.

7. उत्पादन एकल सेल Dissociations

  1. विच्छेदन पूर्ण होने के बाद, 10 मिलीग्राम Pronase वजनी और 10 मिलीलीटर carboxygenated sACSF में भंग करके एक 1 मिलीग्राम/एमएल Pronase समाधान तैयार करें ।
  2. Pronase-sACSF समाधान के 2 मिलीलीटर युक्त 5 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूबों के लिए ५० मिलीलीटर संग्रह शीशियों से ऊतक स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ऊतक की मशीन, मिलाते हुए/ट्यूब झाड़ना के लिए अपनी उंगली के साथ 3-4 बार गर्मी के लिए नमूने मिश्रण ।
  3. इस मशीन के दौरान, पुनर्गठन समाधान तैयार: 1% FBS (१०० μL) + DNAse (1 μL: 10000 स्टॉक DNAse) में 10 मिलीलीटर carboxygenated sACSF ।
  4. 20 मिनट के बाद, ध्यान से नीचे ऊतक परेशान नहीं करने के लिए pronase समाधान निकालें, और यह पुनर्गठन समाधान (कुल मात्रा ऊतक की राशि शुरू करने पर निर्भर है की 1-2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित) ।
  5. टिशू को पहले से तैयार आग-पॉलिश्ड पाश्चर पिपेट से triturating करके टिश्यू अलग कर देना । बड़े बोर के साथ शुरू (~ ६०० µm) पिपेट, महाप्राण और ऊतक समाधान को निष्कासित करने के लिए नीचे ऊतक को तोड़ने के लिए दस गुना कम । समाधान में बुलबुले परिचय नहीं है । मध्यम बोर पिपेट और छोटे बोर पिपेट के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ । समाधान बादल होना चाहिए और ऊतक का कोई स्पष्ट टुकड़ा संग्रह ट्यूबों में दिखाई जानी चाहिए ।
  6. प्लास्टिक सेल lysate समाधान एक ५० µm फिल्टर के माध्यम से 5 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में किसी भी कोशिका के झुरमुट को हटाने के लिए । इन एकल सेल समाधान के साथ आगे बढ़ना cytometry प्रवाह (या संभावित सीधे सेल गिनती के लिए अगर कोई छंटाई की जरूरत है) ।

8. तैयारी FACS-शुद्ध कोशिका प्रत्यारोपण के लिए समाधान

  1. प्रवाह cytometer से सेल समाधान प्राप्त करने पर, एक (या एकाधिक) १.५ एमएल शंकु ट्यूबों के लिए समाधान हस्तांतरण और ५०० जी पर 5 मिनट के लिए 4ओसी में कोशिकाओं स्पिन । केंद्रापसारक के बाद, मीडिया को हटा इतना है कि ~ 20-40 µ एल ट्यूब में रहते हैं । इस शेष मीडिया में कोशिकाओं का पुनर्गठन (और एकाधिक ट्यूबों की जरूरत थी अगर समाधान गठबंधन) ।
  2. parafilm के एक छोटे से टुकड़े पर, एक साथ मिश्रण 2 µ l के सेल सॉल्यूशन + 8 µ l sACSF + 10 µ l के trypan नीला दाग. प्लास्टिक स्लाइड कवर के साथ एक hemocytometer में 10 µ एल ।
  3. एक मानक प्रयोगशाला हाथ टैली काउंटर का उपयोग कर hemocytometer के कोनों में 4 x 4 वर्ग ग्रिड में से प्रत्येक में जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनती (मृत कोशिकाओं डाई से नीला हो जाएगा), और औसत इन 4 मायने रखता है. प्रति µ कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए १०० द्वारा इस संख्या गुणा l
  4. यदि आवश्यक हो, तो मात्रा समायोजित कोशिकाओं 10000-30000 कोशिकाओं की एकाग्रता में है/µ एल पुनर्गठन समाधान में । अंतिम एकाग्रता कोशिकाओं की कुल राशि और प्रत्यारोपण की वांछित संख्या पर निर्भर है । प्रत्यारोपण के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें

9. P0 में ट्रांसप्लांटेशन-2 WT पिल्ले

  1. कुछ parafilm या एक दस्ताने में एक WT पिल्ला लपेटें और यह अच्छी तरह से बर्फ के नीचे कवर जगह है । 5 मिनट के लिए एक टाइमर सेट और इसे शुरू करते हैं । उस समय के बाद, पिल्ला निकालें और जांच करें कि यह hindpaw की चुटकी के लिए जवाब नहीं है ।
  2. जबकि पिल्ला बर्फ पर है, यह कई बार सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए pipetting द्वारा सेल समाधान मिश्रण अच्छी तरह से लोड करने से पहले मिश्रित है (हर इंजेक्शन के लिए micropipette लदान से पहले कोशिकाओं मिश्रण) । इसके बाद खनिज तेल की micropipette को खाली कर उसे पूरी तरह से सेल सस्पेंशन के साथ भरें ।
  3. अपने सिर के साथ चिपकने वाला पुटी पर झूठ बोल रही है कि सिर के ऊपर अपेक्षाकृत सपाट है पेट्री डिश पर anesthetized पिल्ला प्लेस । पिल्ला के सिर भर में हीरे की छेद के साथ टेप रखें, यह त्वचा को सुनिश्चित करने के लिए तना हुआ खींच रहा है और सिर फर्म है, लेकिन है कि माउस आरामदायक और अच्छी तरह से श्वास है । लैंब्डा को डायमंड होल के जरिए दिखाना चाहिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : योजनाबद्ध और ट्रांसप्लांटेशन के लिए छवियां
(क) इंजेक्शन सेटअप के चित्र । ध्यान दें कि लैंब्डा पिल्ला खोपड़ी के माध्यम से स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और micropipette शूंय के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । स्केल बार = 1 इंच । (ख) हिप्पोकैम्पस को लक्षित करने के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया का चित्रण योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. Nanoject के तहत सुरक्षित पिल्ला हटो और कम micropipette इतना है कि micropipette की नोक लैंब्डा ऊपर सीधे पर है । रिकॉर्ड एक्स-वाई जोड़तोड़ पर निर्देशांक ।
  2. mediolateral और सिर के anteroposterior अक्ष के साथ वांछित निर्देशांक करने के लिए micropipette स्थानांतरित करने के लिए जोड़तोड़ knobs को समायोजित करें: s प्रांतस्था → १.० mm पूर्वकाल और १.० mm पार्श्व, हिप्पोकैम्पस → 0.75-1.0 mm पूर्वकाल और 1.0-1.2 mm पार्श्व, Striatum → 2.0-2.2 मिमी पूर्वकाल और १.५ मिमी पार्श्व । निर्देशांक थोड़ा (जैसे, P0 बनाम p2) पिल्ला की उम्र के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए समायोजित किया जा सकता है या चूहों के तनाव (जैसे, CD1 चूहों से बड़े हैं और C57/
  3. micropipette कम जब तक यह त्वचा पर एक छोटे से गुहा रूपों । तो फिर जेड अक्ष जोड़ तोड़ घुंडी मजबूती से बारी है, लेकिन धीरे त्वचा और खोपड़ी मस्तिष्क में प्रवेश करने के लिए के माध्यम से micropipette ड्राइव करने के लिए । जब micropipette मस्तिष्क में प्रवेश करता है, खोपड़ी पर दबाव जारी किया जाएगा और गुहा गायब हो जाएगा ।
  4. micropipette थोड़ा मुकर जब तक टिप त्वचा के शंकु से घिरा हुआ है, एक तंबू की तरह आकार का । पढ़ें z अक्षों के साथ निर्देशांक: यह z-अक्ष शूंय बिंदु होगा ।
  5. वांछित गहराई के लिए micropipette कम: प्रांतस्था → 0.75-1.0 मिमी, हिप्पोकैम्पस → 1.2-1.5 मिमी, Striatum → 2.0-2.5 मिमी. गहराई को थोड़ा समायोजित किया जा सकता है उंर या पिल्ला के तनाव के लिए क्षतिपूर्ति ।
  6. ऊपर वर्णित Nanoject III प्रोग्राम का उपयोग करते हुए सेल सस्पेंशन इंजेक्ट । इंजेक्शन कार्यक्रम के बाद पूरा हो गया है, धीरे से पहले micropipette से वापस लेने के लिए इंजेक्शन साइट से बाहर लीक समाधान को कम करने के लिए 15-20 s प्रतीक्षा करें ।
  7. यदि द्विपक्षीय इंजेक्शन प्रदर्शन, लैंब्डा ऊपर micropipette फिर से शूंय और अंय गोलार्द्ध में उचित निर्देशांक में ले जाएं । वैकल्पिक रूप से, एक ही गोलार्द्ध के प्रांतस्था में दो इंजेक्शन बना कर micropipette 1 मिमी पहले इंजेक्शन के पूर्वकाल में ले जा सकते हैं ।
  8. एक बार ट्रांसप्लांटेशन पूरा हो गया है, टेप को हटाने और हीटिंग पैड पर पिल्ला हस्तांतरण । यदि आवश्यक हो, पूंछ या पैर की अंगुली कतरन द्वारा पिल्ला टैग । एक बार पिल्ला एक लाल रंग का अधिग्रहण किया है और आगे बढ़ रहा है, यह मां के साथ पिंजरे में वापस जगह है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि कैसे जल्दी जन्मोत्तर दिमाग से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों फसल के लिए (चित्रा 1-2), एक कोशिका dissociations के ंयूरॉन अग्रदूतों इकट्ठा, और इन कोशिकाओं को भोली WT में विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रत्यारोपण जन्मोत्तर पिल्लई (चित्रा ३). posthoc विश्लेषण के लिए, दिमाग है कि न्यूरॉन के अग्रदूत साबित P30-35 कोशिका आकृति विज्ञान, neurochemical मार्करों और electrophysiological गुण की विशेषता के बीच काटा गया था । परख के इन प्रकार अक्सर सामांय चूहों में P21-P30 के बीच किया जाता है, लेकिन के बाद से प्रत्यारोपण कोशिकाओं की परिपक्वता थोड़ा विच्छेदन/पृथक्करण प्रक्रिया के कारण देरी हो सकती है, एक अतिरिक्त 5-10 दिन प्रतीक्षा के लिए इस क्षतिपूर्ति की सिफारिश की है देरी परिपक्वता । विश्लेषण के प्रकार के लिए प्रदर्शन किया जाएगा उचित रणनीति के लिए मस्तिष्क फसल हुक्म चलाना होगा । विशेष रूप से, हम विशिष्ट ंयूरॉन उपसमूह है कि के लिए या कुछ उपप्रकार20के खिलाफ पूर्वाग्रह सकता है की तरजीही कोशिका मौत का निरीक्षण नहीं किया ।

immunohistochemical एनालिसिस के लिए चूहों को 4% paraformaldehyde से perfused गया और दिमाग को हटा दिया गया । ५० माइक्रोन vibratome स्लाइस लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के माध्यम से तैयार किया गया था और एंटीफ्रीज़र समाधान में संग्रहीत और/या पहले20वर्णित के रूप में immunostaining के लिए संसाधित । कुछ दिमाग किसी भी टमाटर + कोशिकाओं, जो अनुचित लक्ष्यीकरण के कारण हो सकता है शामिल नहीं किया है (जैसे, निलय में भी गहरी इंजेक्शन), कोशिकाओं को खो दिया है या apoptosis के दौर से गुजर के दौरान भ्रष्टाचार प्रक्रिया, या प्रत्यारोपण कोशिकाओं की अस्वीकृति मेजबान द्वारा । अंतिम सेल गिनती के आधार पर, यह अनुमान लगाया गया है कि केवल 2-5% भ्रष्टाचारी कोशिकाओं के बच20, जो अन्य प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं के साथ लाइन में है22,23.

आश्चर्य नहीं, वहां टमाटर की कुल संख्या में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता था + सफल प्रत्यारोपण में कोशिकाओं, दर्जनों से कई हजार टमाटर से लेकर + कोशिकाओं (चित्रा 4a) । भ्रष्टाचारी कोशिकाओं सही क्षेत्रों में स्थानीयकृत थे, कई के साथ प्रदर्शित करने के लिए न्यूरॉन morphologies और अच्छी तरह से विशेषता न्यूरॉन neurochemical मार्करों (चित्रा 4B). इसी तरह के सेल अस्तित्व संख्या और परिपक्वता प्रोफाइल भी जब कोशिकाओं heterotopic प्रत्यारोपण में नए वातावरण में भ्रष्टाचार किया गया (चित्रा 4c) मनाया गया ।

immunohistochemical विश्लेषण के अलावा, भ्रष्टाचारी कोशिकाओं पर electrophysiological विश्लेषण की पुष्टि करते है कि वे मस्तिष्क सर्किट में एकीकृत किया है और आंतरिक और गोलीबारी के गुणों की उंमीद प्रदर्शन कर दिया था । दिमाग P30 से काटा गया-35 चूहों और शारीरिक रिकॉर्डिंग के लिए तैयार स्लाइस के रूप में पहले20वर्णित के रूप में । भ्रष्टाचारी न्यूरॉन्स प्रस्तुत वयस्क की तरह शारीरिक गुण और अलग फायरिंग पैटर्न विशेषता हो सकता है कि अच्छी तरह से विशेषता के प्रतिनिधि थे न्यूरॉन उपप्रकार (चित्रा 5 ए), सुझाव है कि भ्रष्टाचारी न्यूरॉन्स मेजबान वातावरण में ठीक से परिपक्व कर रहे थे । सत्यापित करें कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं को न्यूरॉन नेटवर्क में एकीकृत किया गया था, sEPSCs भी दर्ज किए गए थे (चित्रा 5B). इसके अलावा, प्रत्यारोपण के एक सबसेट के साथ प्रदर्शन किया गया न्यूरॉन्स के बाद ChR2 व्यक्त पिरामिडी कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग के पास स्थानीय प्रत्यारोपण न्यूरॉन्स. इन आंकड़ों का प्रदर्शन किया है कि postsynaptic GABAergic धाराओं नीली बत्ती (चित्रा 5C-डी) द्वारा पैदा कर रहे हैं ।

Figure 4
चित्र 4 : P30 WT चूहों कि P1 पर टमाटर + न्यूरॉन पुरोगामी के साथ प्रत्यारोपित किया गया से मेजबान मस्तिष्क क्षेत्रों के प्रतिनिधि वर्गों आबाद है । (क) homotopic प्रांतस्था-to-प्रांतस्था प्रत्यारोपण में, भ्रष्टाचारी कोशिकाओं को सभी cortical परतों आबाद और morphologies कि अंतर्जात न्यूरॉन्स की नकल प्रदर्शन । चयनित छवियां अलग प्रत्यारोपण से सेल की संख्या में परिवर्तनशीलता पर प्रकाश डाला, बाईं छवि के साथ टमाटर की एक बहुत अधिक संख्या में होने + अनुभाग के प्रति कोशिकाओं को सही पक्ष पर प्रत्यारोपण की तुलना में । (ख) homotopic हिप्पोकैम्पस-टू-हिप्पोकैम्पस भ्रष्टाचारियों से कम आवर्धन (बाएँ) और उच्च आवर्धन (दाएँ) प्रतिनिधि वर्गों. ध्यान दें कि परत oriens में टमाटर + कोशिकाओं के बहुमत (सू) एक्सप्रेस एसएसटी (संभावना ओ-LM कोशिकाओं) जबकि कई टमाटर + परत pyramidale (सपा) एक्सप्रेस PV (संभावना टोकरी कोशिकाओं) में कोशिकाओं, अंतर्जात हिप्पोकैम्पस के समान ंयूरॉंस । (ग) टमाटर के साथ एक heterotopic ट्रांसप्लांटेशन (प्रांतस्था-to-Striatum) का उदाहरण Striatum में मौजूद । स्केल सलाखों = २०० में एक कम पत्रिका पैनल में बी में, ५० माइक्रोन में सी और हाई पावर पत्रिका में बी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : भ्रष्टाचारी न्यूरॉन्स electrophysiologically परिपक्व हैं और मेजबान न्यूरॉन नेटवर्क में एकीकृत
(क) सबसे ऊंची गोलीबारी आवृत्तियों के प्रतिनिधि उदाहरण भ्रष्टाचारी न्यूरॉन्स से दर्ज की गई. वाम, तेजी से Spiking एक हिप-Ctx भ्रष्टाचार से ंयूरॉन, वर्तमान कदम इंजेक्शन:-१०० pa और ५२० pa; सही, गैर तेजी से Spiking एक Ctx-Ctx भ्रष्टाचार से न्यूरॉन, इंजेक्शन वर्तमान कदम:-१०० pa और ३६० pa. (ख) हिप-टू-हिप प्रत्यारोपण से देर से Spiking न्यूरॉन में दर्ज sEPSCs का उदाहरण । (ग) प्रतिनिधि छवि प्रदर्शित nkx 2.1-Cre; Ai32 कोशिकाओं (YFP) से एक Ctx-Ctx प्रत्यारोपण के साथ एक biocytin भरा (लाल) पिरामिडीय कोशिका । स्केल बार = ५० माइक्रोन । (घ) एक GABAergic postsynaptic धाराओं के उदाहरण नीले प्रकाश पिरामिडीय कोशिकाओं में दर्ज की दालों, एक [१४५ mM] Cl-के साथ दर्ज की गई द्वारा पैदा की । काले में, औसत निशान; लाल रंग में, औसत प्रतिक्रिया Gabazine की उपस्थिति में दर्ज की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू कोशिकाओं के जीवित रहने को अधिकतम है । यह सुनिश्चित करना है कि ऊतक और कोशिकाओं बर्फ ठंड carboxygenated sACSF में हमेशा के लिए सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है । इस समय की लंबाई को कम करने के लिए एक कुशल विच्छेदन और पृथक्करण रणनीति की आवश्यकता है कि कोशिकाओं को विभिंन समाधान और मस्तिष्क के वातावरण के बाहर में खर्च करते हैं । मस्तिष्क क्षेत्रों की संख्या पर निर्भर करता है और प्रत्यारोपण किया जा रहा, यह विच्छेदन और/या प्रत्यारोपण कदम में एक साथी सहायता के लिए प्रयोग की लंबाई कम करने के लिए फायदेमंद हो सकता है । स्वास्थ्य और पिल्ला के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए, यह भी बर्फ संज्ञाहरण समय (< 4 मिनट) को कम करने और प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान प्रकाश के साथ गर्म पिल्ला रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

वहां प्रत्यारोपण दिमाग में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता हो सकता है, कुछ किसी भी भ्रष्टाचारी कोशिकाओं को शामिल नहीं कर सकते हैं, जबकि अंय दिमाग हजारों शामिल होंगे । विच्छेदन के लिए कई P0-P2 कूड़े का मेल है, जो एक या तो प्रत्यारोपण सेल घनत्व को बढ़ाने के लिए और/या भ्रष्टाचारी पिल्ले की संख्या में वृद्धि की अनुमति देता है, जो दोनों की संभावना में सुधार होगा भ्रष्टाचार के लिए काटा कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि कर सकते है सफल प्रत्यारोपण । उचित मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पिल्ला सिर स्थिर है और जब मस्तिष्क में micropipette कम कदम नहीं है । सिर या micropipette शाफ्ट के झुकने के किसी भी स्थानांतरण (जैसे पार्श्व निलय में कोशिकाओं की हानि के रूप में) गलत ढंग से लक्षित और इंजेक्शन में परिणाम कर सकते हैं । इसके अलावा, पिल्ला प्रति कई इंजेक्शन साइटों प्रदर्शन (या तो एकतरफा या द्विपक्षीय) मामले में एक इंजेक्शन साइट को लक्षित है सफलता दरों में सुधार कर सकते हैं । भविष्य में, यह पिल्ला को स्थिर और अधिक सटीक और लगातार इंजेक्शन प्रदान करने के लिए एक अधिक कुशल stereotaxic रणनीति विकसित करने के लिए इष्टतम होगा ।

गु P0-P2 समय सीमा दोनों वैज्ञानिक और तकनीकी कारणों के लिए चुना गया था । इस उम्र में, अधिकांश न्यूरॉन पुरोगामी अपने टर्मिनल साइटों के लिए चले गए हैं, लेकिन न्यूनतम पर्यावरणीय बातचीत है. इस समय फ्रेम अन्य न्यूरॉन सेल प्रकार और मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए सच नहीं पकड़ सकता है, तो एक अपने विशिष्ट प्रयोजनों के लिए इन timepoints को समायोजित करने के लिए चाहते हो सकता है. उदाहरण के लिए, यह इन P0 के चिकित्सीय क्षमता की तुलना करने के लिए दिलचस्प होगा-P2 संचयन MGE-फसल कोशिकाओं के साथ न्यूरॉन्स के साथ-साथ: एक उम्र अन्य की तुलना में अधिक लाभ और/या कम अवांछित साइड इफेक्ट हो सकता है. इसके अतिरिक्त, यह heterochronic प्रत्यारोपण प्रदर्शन दिलचस्प हो सकता है (जैसे, P0 पर कोशिकाओं का संग्रह-P2 और P7 में प्रत्यारोपण-10 दिमाग, या इसके विपरीत) की पहचान करने के लिए कैसे वातावरण में लौकिक परिवर्तन सेल भाग्य और परिपक्वता को प्रभावित कर सकता है । P0-2 में इंजेक्शन प्रदर्शन का लाभ यह है कि खोपड़ी अपेक्षाकृत पतली है और आसानी से एक तेज micropipette के साथ प्रवेश किया जा सकता है । P5 पर किसी भी इंजेक्शन को हटाने या खोपड़ी thinning की आवश्यकता होगी ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण ंयूरॉन उपप्रकार है कि अंतर मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच व्यक्त कर रहे है की विशिष्ट विशेषताओं के लिए सीमित है । भविष्य में, एक एक सेल अनुक्रमण की शक्ति का उपयोग करने के लिए भ्रष्टाचारी कोशिकाओं की पूरी transcriptome की विशेषता सकता है । इस निष्पक्ष दृष्टिकोण विशिष्ट जीन (या बड़ा संकेत कैस्केडिंग) कि दृढ़ता से समृद्ध या प्रत्यारोपण कोशिकाओं में समाप्त कर रहे है नियंत्रण की तुलना में, जो उंमीदवार पर्यावरणीय cues कि भाग्य को प्रभावित करेगा में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा की पहचान सकता है निर्धारण या परिपक्वता ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (K99MH104595) और niched अंदर अनुसंधान T.J.P. को कार्यक्रम द्वारा समर्थित था हम Gord Fishell, जिनकी प्रयोगशाला में इस दृष्टिकोण मूल रूप से स्थापित किया गया था धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium bicarbonate Sigma S6297
Potassium chloride Sigma P9541
Sodium phosphate monobasic Sigma S0751
Calcium chloride Sigma C5080
Magnesium chloride Sigma M2670
Glucose Sigma G7528
Sucrose Sigma S7903
Brain Matrices Roboz SA-2165 Only needed if harvesting striatum
Fine point Dumont Forceps Roboz RS-4978
Microdissecting scissors Roboz RS-5940
Razor blades ThermoFisher 12-640
Pasteur pipettes ThermoFisher 1367820C
Nanoject III Drummond 3-000-207
Manual Manipulator w/ stand World Precision Instruments  M3301R/M10
5 ml round bottom plastic tubes ThermoFisher 149591A
60 mm Petri dishes ThermoFisher 12556001
100 mm Petri dishes ThermoFisher 12565100
Pronase Sigma 10165921001
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher 16140063
DNase I Sigma 4716728001
Celltrics 50um filters Sysmex 04-0042327
Trypan blue ThermoFisher 15-250-061
Hemocytometer ThermoFisher 02-671-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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