Summary
Udfordrende unge neuroner i nye områder af hjernen kan afsløre vigtige indsigt i hvordan miljøet sculpts neuronal skæbne og modning. Denne protokol beskriver en procedure for at høste interneuron prækursorer fra specifikke hjerneregioner og omplante dem enten homotopically eller heterotopically i hjernen hos postnatal unger.
Abstract
Neuronal skæbne beslutsomhed og modning kræver et indviklet samspil mellem genetiske programmer og miljømæssige signaler. Udrede roller af iboende vs extrinsic mekanismer, der regulerer denne differentiering proces er dog en gåde for alle udviklingsmæssige neurobiologists. Dette spørgsmål er forstørret til GABAergic interneurons, en utrolig heterogene celle befolkning, der er født fra forbigående embryonale strukturer og gennemgå en langvarig vandrende fase at sprede sig i hele telencephalon. For at undersøge hvordan forskellige hjernen miljøer påvirker interneuron skæbne og modning, udviklede vi en protokol til høst fluorescently mærket umodne interneuron prækursorer fra specifikke hjerneregioner i nyfødte mus (P0-P2). I denne alder, interneuron migration er næsten komplet og disse celler er bosat i deres endelige hvilende miljøer med relativt lille synaptic integration. Efter samling af enkelt celle løsninger via flowcytometri, disse interneuron prækursorer er transplanteret ind i P0-P2 vildtype postnatal unger. Ved at udføre både homotopic (fx cortex til cortex) eller heterotopisk (f.eks. cortex til hippocampus) transplantationscentre, kan man vurdere hvordan udfordrende umodne interneurons i nye miljøer, hjernen påvirker deres skæbne, modning og kredsløb integration. Hjerner kan høstes i voksen mus og analyseres med en bred vifte af posthoc analyse på podede celler, herunder immunhistokemiske, elektrofysiologiske og transcriptional profilering. Denne generelle tilgang giver efterforskere med en strategi til assay hvordan forskellige hjernen miljøer kan påvirke mange aspekter af neuron udvikling og identificere hvis neuronal særpræg er primært drevet af hardwired genetiske programmer eller miljømæssige stikord.
Introduction
Korrekt kortikal funktion kræver en balance mellem excitatoriske projektion neuroner og hæmmende GABAergic interneurons, en meget heterogene befolkning med særskilte morfologier, elektrofysiologiske egenskaber, tilslutningsmuligheder og neurokemiske markører. Unormal udvikling og funktion af interneurons (og specifikke interneuron undergrupper) har været knyttet til pathobiology for psykiatriske lidelser som skizofreni, autisme og epilepsi1,2,3. Desuden, mange gener involveret i disse hjernen lidelser er stærkt beriget i unge interneurons4. Således en større forståelse af de mekanismer, der regulerer interneuron skæbne beslutsomhed og modning er nødvendig for at forstå normale udvikling og potentielle etiologies af talrige hjernesygdomme.
Forhjernen interneurons er født primært fra to forbigående embryonale strukturer, de mediale og caudale ganglionære eminences (MGE og CGE, henholdsvis). Disse postmitotic celler (interneuron prækursorer) derefter gennemgå en langvarig tangential migration fase at sprede sig i hele telencephalon hvor de integreres i en bred vifte af kredsløb. MGE-afledte interneurons består af tre stort set ikke-overlappende, neurochemically definerede undergrupper: hurtigt spiking parvalbumin (PV+) interneurons, ikke-fast spiking somatostatin (SST+) interneurons, og sent spiking neuronal salpetersyre nitrogenoxid syntase (nNOS+) interneurons, der udgør hippocampus neurogliaform og vedbend celler. Talrige labs har identificeret flere mekanismer inden for MGE, der regulerer indledende skæbne beslutninger i PV+ eller SST + interneurons, herunder rumlige forløb af morphogens, fødselsdato af interneuron prækursorer og tilstand af neurogen division 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. det er blevet foreslået, at interneurons oprindeligt differentiere i 'kardinal klasser' og derefter gradvis modnes til 'endelige klasser' som de interagerer med deres miljø11. Seneste beviser viser, at nogle modne interneuron undertyper kan være genetisk hardwired som disse celler bliver postmitotic i de ganglionære eminences, der angiver, at tidlig definerede iboende genetiske programmer kan spille en større rolle end tidligere værdsat12,13. Men det centrale spørgsmål om hvordan de iboende genetiske programmer interagere med miljømæssige stikord at skabe differentiering af særskilte interneuron undertyper forbliver stort set uudforskede.
Talrige undersøgelser har transplanteret embryonale MGE celler direkte ind i en række forskellige områder af hjernen, med konsensus resultaterne, der podede celler modne og frigive GABA for at generelt hæmme den lokale endogene kredsløb14,15, 16,17,18,19. Disse lovende observationer har genereret betydelig interesse i at bruge menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hIPSC)-afledt interneurons for at behandle en række hjernesygdomme. Men meget få af disse undersøgelser vurdere hvis disse podede celler modne i de forventede former for modne interneurons, et afgørende element, når man tænker på translationel tilgange.
For at løse, hvordan miljøet påvirker interneuron differentiering og modning, udtænkt en strategi for at omplante umodne interneuron prækursorer til ny hjerne miljøer for at undersøge, om podede interneurons vedtage funktioner af værten miljøet eller bevare funktioner fra donor miljø20. MGE transplantationer er ikke egnede til at behandle dette spørgsmål, fordi MGE indeholder en blandet population af interneuron og GABAergic projektion celler, der spredes i hele mange hjernen regioner21. Uden at vide hvor disse MGE celler ville have overført, man ikke fuldt ud kan vurdere hvordan disse transplantationscentrene påvirkes af hjernen miljø. Ved høst interneuron prækursorer på tidlige postnatal timepoints, dette problem er omgået ved at opnå umodne celler, der har afsluttet deres migration og nået deres mål hjernen regionen men har minimal interaktion med miljøet. Ved at fokusere på specifikke funktioner i interneurons, der udtrykkes varierende mellem forskellige hjerneregioner, kan man derefter bestemme, hvordan værtsmiljøet ændrer interneuron egenskaber. Den generelle tilgang skitseret i denne protokol bør finde anvendelse på enhver investigator, ønsker at undersøge, hvordan unge neuroner opføre sig når udfordret i nye omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne for National Institutes of Health og blev godkendt af NICHD dyrs pleje og brug udvalg (ACUC). Protokollen beskrevet nedenfor udnytter Nkx2.1-CreC / +; Ai9+/- unger for at høste MGE-afledte interneuron prækursorer, men kan udføres på alle ønskede fluorescerende reporter mus linjer. Både mandlige og kvindelige tidlige postnatal mus (P0-P2) blev brugt ukritisk for donor og værten væv.
1. løsning forberedelse
- Forberede saccharose kunstige cerebrospinalvæske (sACSF) efter følgende opskrift (enhed i mM): 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 glukose, 75 saccharose mættet med 95% O 2, 5% CO2 på pH = 7.4.
- Fyld et bægerglas med 350 mL ren ddH2O baseret på den endelige ønskede volumen (500 mL af sACSF bør være nok til 1-2 kuld), tilføje en magnetisk røre bar og bægerglasset på røre pladen.
- Vægt alle salte (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2PO4, glucose, saccharose), en på tidspunktet og tilsæt til vand efter følgende tabel. Beløbet kan justeres alt efter den endelige ønskede volumen.
Reagens Molekylær vægt Koncentration (mM) Gram/500 mL Natriumchlorid 58.44 87 2,54 Natriumhydrogencarbonat 84.01 26 1.09 Kalium klorid 74.55 2.5 0,09 Natrium fosfat monobasic 119.98 1,25 0,08 Glukose 180.16 10 0,9 Saccharose 342.3 75 12.84 - Boble løsning med 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) i mindst 20-30 minutter før du tilføjer den passende mængde CaCl2 (0,25 mL af en 1 M løsning for 500 mL sACSF) og MgCl2 (3,5 mL af en 1 M løsning for 500 mL sACSF) .
- Tjek pH-værdien ved hjælp af et standard pH-meter. Hvis forberedt korrekt, løsningen skal have pH = 7.4.
- Bringes opløsningen til endelige mængden af 500 mL med ren ddH2O i et måleglas.
- sACSF kan være forberedt op til 1-2 dage frem. Før brug, Anbring på is og boble med carboxygen i mindst 15 minutter før start af dissektion og holde flasken sACSF boblende hele dissektion.
2. dissektion forberedelse
- Følgende værktøjer bør være steriliseret/autoklaveres: mindst én lille fine skarpe saks, 2 fine pincet (stil #5), buet fine pincet, hjernen skæring matrice mug og flere barberblade. En lille spatel til at fjerne hjernen fra kraniet er valgfri.
- Oprettet den arbejde station i nærheden af dissektion mikroskoper med petriskåle (9 cm og 4 cm diameter), 50 mL konisk plast rør til at indsamle de isolerede hjerneregioner og store bore plast overførsel pipetter, alle holdt på is. Forbered flere 50 mL rør fuld af carboxygenated sACSF på is. Hvis dissekere mere end ét område af hjernen, Sørg for at korrekt og tydeligt mærke både indsamling rør og overførsel pipetter til at undgå forurening.
- Har en ekstra isspand for ice anæstesi i pups via hypotermi, og en ordentlig farligt affald pose til at bortskaffe kadavere.
- Forberede væv ændring brand-poleret glas Pasteur pipetter. Brug en bunsenbrænder til at sterilisere og forme spidsen af en pipette. Forbered flere pipetter med forskellige bore åbninger: store (~ 600 µm), medium (~ 300 µm) og små (~ 100 µm). Afprøve flow gennem tips med vand for at sikre forskellige ændring hastigheder. Mindst en pipette af hver slags er nødvendig for hvert område af isolerede hjernen, men at have flere ekstra for hver størrelse anbefales i tilfælde af tilstopning eller bryde tips.
3. transplantation forberedelse
- Bruge en elektrode aftrækker for at forberede fine spids glas Mikropipetter. Bryde eller facet tip til at gøre en skarp vinklet punkt, med spidsen med en diameter på ~ 20-40 µm. Inspicér visuelt tips med et mikroskop for at sikre ingen støv eller resterende glas partikler hindre blænde.
- Med en fin nål sprøjte, helt fylde glas mikropipette med mineralsk olie. Indsæt mikropipette i Nanoject apparater (eller andre mikroinjektion enhed). Nanoject III, at angive følgende program: volumen = 60 nL, sats = 30, cykler = 25, forsinkelse = 1 s.
- Sikre Nanoject til manipulatoren, der er knyttet til en magnetisk base, og justere manipulatoren så Nanoject peger lige ned, ikke vippes langs x- eller y akse.
- Vedhæfte nogle klæbende Kit (~ 1-2 cm for P0-P2 pups) til toppen af forsiden af en petriskål, at skabe en ophøjet overflade for at hvile den pup hoved på.
- Cut ~ 6-8 cm lange striber af lab tape og lav en diamant-formet hul i midten. Båndet vil blive brugt til at stabilisere lederen af pup under proceduren samtidig strækker huden og giver mulighed for nem visualisering af landemærker og den målrettede region.
- Forberede en varmepude i injektion kvarter, og slå til 'lav' indstilling, før du starter injektioner. Dække pad det med nogle papirhåndklæder eller en ble pad.
- Hvis udfører flere transplantation betingelser, har en lille saks, der er klar til at udføre unger toe/hale klipning til tag modtagende forskellige injektioner.
4. fjernelse af P0-P2 mus hjernen
- Lige før du begynder proceduren, skal du udfylde flere petriskåle med kølet, carboxygenated sACSF. Også fylde samling røret med ~ 25 mL sACSF.
- Wrap en P0-P2 hvalp i nogle parafilm eller en handske og sted det godt dækket under isen. Indstille en timer i 5 minutter og starte den. Efter tid, fjerne pup og kontrollere, at det ikke reagerer på klemme af hindpaw.
- Hug hovedet af pup og indsamle hovedet i en petriskål, fyldt med sACSF. Skære i huden langs midterlinjen at eksponere kraniet.
- Find åbning i kraniet på baghjernen/rygmarven og sæt den ene ende af pincet langs dorsale del af kraniet. Forsigtigt fat i kraniet på midterlinjen og skræl væk stykker lateralt for at udsætte hjernen, være omhyggelig med ikke at beskadige hjernen.
- Efter fjernelse af de dorsale og laterale dele af kraniet, bruge pincet eller spatel forsigtigt fjerne hjernen fra kraniet ved scooping nedenunder den ventrale overflade af hjernen, forsøger ikke at skade noget område. Læg hjernen i en anden petriskål fyldt med carboxygenated sACSF.
Bemærk: Vi præsenterer to forskellige strategier for dissekere hippocampus, striatum og cortex. Den første strategi (trin 5.1-5.10) er nyttig for nogen mus linje, mens den anden strategi (trin 6.1-6.7) ville have en fluorescerende reporter mus til rent adskille striatum fra globus pallidus og andre hjernestrukturer. Hvis striatum ikke ønskes, derefter ignorere striatum-specifikke dele af de to teknikker
Figur 1 : Skematisk og billeder til hjernen dissektion, teknik #1
Dissektion teknik beskrevet i trin 5.1-5.10. Hvis striatal væv ønskes, skal P1 hjernen hjernen matricer ventrale side op. Placere barberblade i matrice slots gennem forreste hjernen at opnå koronale sektioner gennem striatum. Fjern striatal stykker fra begge hjernehalvdele, Gentag for alle sektioner indeholder striatum, der sidder foran hippocampus. Hvis striatal væv ikke ønskes, simpelthen hemisect i hjernen, placere hjernehalvdele mediale side op i skålen og fjerne ventral-mediale hjernestrukturer (thalamus, basale ganglier, etc.) for at udsætte hippocampus. Bruge pincet klemme af hippocampus, derefter dreje halvkugle og bruge pincet til at dissekere ud en luns af kortikale væv. De lodrette sorte streger gennem de skematiske hjernehalvdele hvor nedskæringerne ville være at fjerne striatal sektionerne. Skalalinjen = 500μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. høst Striatum, Hippocampus og Cortex, teknik #1
- Placere hele hjernen på skæring matrice skimmel, ventrale side op. Sted 1 barberblad gennem den mest forreste del af hjernen (gennem forreste olfaktoriske tarmkanalen).
- Indsæt en anden barberblad lige posteriort til den første til at generere en 0,5 mm skive, og placere en ekstra barberblad posteriort for denne ene.
- Overføre disse skiver til en petriskål med carboxygenated sACSF og læg resten af hjernen til en separat skål med sACSF. Overfør striatal skiver til et dissekere muligheder for at visualisere striatum. Disse skiver bør indeholde store dele af den forreste striatum og mangler hippocampus. Bruge en fluorescerende dissekere muligheder med Nkx2.1-Cre+/-; Ai9+ / skiver til at differentiere de svage striatal tdTomato signal fra den stærke tdTomato signal af globus pallidus.
- Med eller uden fluorescens, Knib ud striatum fra begge hjernehalvdele på alle sektioner og overførsel striatal bidder til korrekt mærket 50 mL tube med sACSF, opbevares på is.
- Hemisect hjernen langs midterlinjen med pincet eller et barberblad, og lægge halvkugle, så den mediale overflade vender opad.
- Fjerne den ventrale hjernevæv (thalamus, basale ganglier, osv.) ved at knibe ud dette væv med pincet. Når du er færdig, hippocampus (en pølse formet struktur spanning anteroposterior akse langs den dorsale cortex) og ventrikulære side af cortex skal være klart synlige.
- Hvis du vil fjerne hippocampus, Indsæt spidsen af pincet foran den forreste hippocampus og forsigtigt adskille hippocampus fra cortex ved at flytte pincet posteriort og klemme langs grænsen hippocampus-kortikale. Overføre den isolerede hippocampus til korrekt mærket 50 mL tube med sACSF, opbevares på is.
- For at dissekere cortex, placere den hemisected cortex mediale side ned. Derefter bruge pincet til at knibe de mest dorsale, ventrale, forreste og bageste dele af cortex til at forlade en firkantet luns af mediale somatosensoriske cortex, ~ 2 mm x 2 mm. Flip cortex så mediale side er op og ren af eventuelle overskydende ikke-kortikale væv (thalamus basale ganglier, osv.) på den mediale overflade, hvis det er nødvendigt. Overføre cortex luns til korrekt mærket 50 mL tube med sACSF, opbevares på is.
- Gentag proceduren med anden halvkugle til at indsamle både hippocampi og cortex regioner.
- Gentag denne procedure for alle unger, og sørg for at erstatte sACSF i petriskåle mellem unger til at sikre, at sACSF forbliver kold og frisk.
Figur 2 : Skematisk og billeder til hjernen dissektion, teknik #2
Dissektion teknik beskrevet i trin 6.1-6.7. PIN hjernen på en dissekere parabol dorsale side op. Efter peeling cortex frem, hippocampus og striatum er synlige og kan fjernes, så en del af cortex kan fjernes som beskrevet i tidligere teknik. Afhængigt af Transgene mus linje, kan striatum renses op for at fjerne globus pallidus og andre væv. I Nkx2.1Cre; Ai9 mus linje, globus pallidus har en betydeligt højere tæthed af tomat + celler i forhold til striatum. Skalalinjen = 500 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
6. høst Striatum, Hippocampus og Cortex, teknik #2
- Læg den ventrale side, hjernen ned i en sylgard-belagt petriskål indeholdende sACSF og pin det ned gennem lillehjernen og anterior cortex eller olfaktoriske pære.
- Begynder med en halvkugle, brug buet pincet til at forsigtigt adskille den posteriore cortex fra underliggende hippocampus og andre væv. Forsigtigt læg den flåede cortex fladt på petriskål. Gentag for andre halvkugle. Hippocampi og striatum bør være klart synlige i udsatte hjerne.
- Bruge pincet til at klemme en hippocampus på midterlinjen og skræl hippocampus lateralt til at fjerne. Sted i samling hætteglas på is og Gentag med andre hippocampus.
- For striatum, forsigtigt skrabe omkring kanterne af striatum til at løsne det fra det omgivende væv. Derefter fjerne striatum ved at klemme sig ned fra nedenunder og tilføje til collection tube på is. Gentag for andre striatum.
- Kortikale sektioner kan høstes som beskrevet i trin 5.8.
- Hvis bruger en transgene reporter mus linje (f.eks. Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-normal god landbrugspraksis, osv.), overføre striatum til en petriskål med sACSF og se under fluorescerende dissekere anvendelsesområde. Bruge pincet til at fjerne enhver ikke-striatal væv fra striatum (i Nkx2.1-Cre; Ai9 mus, fjerne alle 'lyse' væv, som globus pallidus har meget højere MGE-stammer, tdTomato + celle tæthed i forhold til striatum). Gentag for alle striatum.
- Gentag denne procedure for alle unger, og sørg for at erstatte sACSF i petriskåle mellem unger til at sikre, at sACSF forbliver kold og frisk.
7. genererer enkelt celle Dissociations
- Efter dissektion er komplet, forberede en 1 mg/mL Pronase løsning af vejer 10 mg Pronase og opløse i 10 mL carboxygenated sACSF.
- Overførsel væv fra 50 mL samling hætteglas på 5 mL rund bund rør indeholdende 2 mL af opløsningen, Pronase-sACSF. Inkuber væv i 20 min. ved stuetemperatur, ryster/svippede rør 3 - 4 gange med din finger under inkubationen blandes prøverne.
- Under denne inkubering, forberede rekonstitution opløsning: 1% FBS (100 μL) + DNAse (1 μL 1:10,000 lager DNAse) i 10 mL carboxygenated sACSF.
- Efter 20 minutter, forsigtigt fjerne pronase løsningen vil ikke forstyrre væv i bunden, og erstatte det med 1-2 mL af rekonstitution (samlede volumen er afhængig af start beløbet af væv).
- Mekanisk adskille væv af triturating væv med de tidligere parat brand-poleret Pasteur pipetter. Startende med stor boring (~ 600 µm) pipette, Aspirér og udvise væv løsning mindst ti gange for at bryde op væv. Indføre ikke bobler i løsningen. Gentag denne proces for mellemlang bore pipette og lille bar pipette. Løsningen skal være overskyet og ingen klare stykke væv skal være synlig i indsamling rør.
- Med pipette overfoeres celle lysate løsning gennem en 50 µm filter til 5 mL konisk rør til at fjerne enhver celle klumper. Gå videre med disse enkelt celle løsninger til at flyde flowcytometri (eller potentielt direkte til celle tælle hvis ingen sortering er nødvendig).
8. forberedelse FACS-renset celle løsninger til Transplantation
- Når vi modtager celle løsninger fra flow Flowcytometret, opløsningen overføres til et (eller flere) 1,5 mL konisk rør og spin celler på 500 g i 5 min på 4oC. Efter centrifugering, fjerne medier så at ~ 20-40 µL forbliver i røret. Rekonstruere celler i dette resterende medier (og kombinere løsning, hvis flere rør var nødvendigt).
- På et lille stykke af parafilm, blandes sammen 2 µL af celle løsning + 8 µL sACSF + 10 µL af trypan blå plet. Med pipette overfoeres 10 µL til en hemocytometer med slide dækning.
- Tæl antallet af levende celler i hver af de 4 x 4 firkantede gitre i hjørnerne af hemocytometer ved hjælp af en standard laboratorium hånd tally counter (døde celler vil være blå fra farvestoffet), og disse 4 tæller den gennemsnitlige. Multiplicer dette nummer af 100 til at bestemme antallet af celler pr. µL.
- Hvis det er nødvendigt, justere lydstyrken, så cellerne er ved en koncentration på 10.000-30.000 celler/mikroliter i rekonstitution løsning. Endelig koncentration er afhængig af samlede celler og ønskede antal transplantationscentre. Holde celler på is til transplantation
9. transplantation til P0-2 WT unger
- Wrap en WT hvalp i nogle parafilm eller en handske og sted det godt dækket under isen. Angiv en timer for 5 min og starte den. Efter tid, fjerne pup og kontrollere, at det ikke reagerer på klemme af hindpaw.
- Mens pup er på isen, bland celle løsning af pipettering det flere gange til at sikre cellesuspension er godt blandet før pålæsningen (bland celler forud for lastning mikropipette til hver injektion). Derefter tømme mikropipette af mineralsk olie og udfylde den helt med cellesuspension.
- Placer den bedøvede pup på en petriskål med hovedet liggende på den selvklæbende kit, således at toppen af hovedet er forholdsvis flad. Placer båndet med diamant-hul på tværs af lederen af den pup, trækker det stramt at sikre huden er strakt og hovedet er fast, men at musen er behagelig og trække vejret godt. Lambda skal være synlige gennem diamond hul.
Figur 3 : Skematisk og billeder til transplantation
(A) billeder af injektion setup. Bemærk at lambda er klart synlig gennem den pup kraniet og skal bruges til nulstilling af mikropipette. Skalalinjen = 1 tomme. (B) skematisk skildrer injektion procedure at målrette hippocampus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Flytte den sikrede pup under Nanoject og sænke mikropipette, således at spidsen af mikropipette er på direkte over lambda. Optage x-y koordinaterne på en manipulator.
- Justere manipulator drejeknapper for at flytte mikropipette til de ønskede koordinater langs mediolateral og anteroposterior akse af hovedet: S1 Cortex → 1.0 mm anterior og 1.0 mm lateral, Hippocampus → 0,75-1,0 mm anterior og 1.0-1.2 mm lateral, Striatum → 2,0-2,2 mm anterior og 1,5 mm lateral. Koordinater kan justeres lidt for at kompensere for alder af hvalp (f.eks. P0 vs P2) eller stamme af mus (f.eks. CD1 mus er større end og C57/B6 på P2).
- Sænke mikropipette, indtil det danner en lille hule på huden. Derefter vende z-aksen manipulator knop fast men forsigtigt for at drive mikropipette gennem huden og kraniet at trænge ind i hjernen. Når mikropipette ind i hjernen, presset på kraniet vil blive frigivet og hule vil forsvinde.
- Trække mikropipette lidt, indtil spidsen er omgivet af en kegle af huden, formet som et telt. Læs koordinater langs z-akser: det er z-aksen nul-punkt.
- Sænke mikropipette til den ønskede dybde: Cortex → 0,75-1,0 mm, Hippocampus → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2,0-2,5 mm. dybde kan justeres lidt for at kompensere for alder eller stamme af pup.
- Injicere cellesuspension ved hjælp af programmet Nanoject III, ovennævnte. Efter injektion-program er færdigt, skal du vente 15-20 s før langsomt tilbagetrækningskraften mikropipette for at minimere løsning siver ud af injektionsstedet.
- Hvis udførelse af bilaterale injektioner, re nul mikropipette ovenfor lambda og flytte til de rette koordinater i anden halvkugle. Alternativt kan man lave to injektioner i cortex af den samme halvkugle ved at flytte mikropipette 1 mm forreste af den første injektion.
- Når transplantation er færdig, Fjern tapen og overføre pup på den hede afrivningsblok. Hvis det er nødvendigt, tag pup af hale eller tå klipning. Når hvalpen har generhvervet en rød farve og bevæger sig, placere det tilbage i buret med moderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol demonstrerer, hvordan man høste specifikke hjerneregioner fra tidlig postnatal hjerner (figur 1-2), indsamle enkelt celle dissociations af interneuron prækursorer og transplantationen disse celler ind i forskellige områder af hjernen i naive WT postnatal unger (figur 3). For posthoc analyse, blev hjerner, der modtog interneuron forløber grafts høstet mellem P30-35 at karakterisere celle morfologi, neurokemiske markører og elektrofysiologiske egenskaber. Disse typer af assays udføres ofte mellem P21-P30 i normale mus, men da modning af transplanterede celler kan blive lidt forsinket på grund af proceduren dissektion/dissociation, venter på yderligere 5-10 dage anbefales at kompensere for dette forsinket modning. Hvilken type analyse udføres vil diktere den rigtige strategi for at høste hjernen. Især, vi ikke har overholdt præferentielle celledød af specifikke interneuron undergrupper, der kunne skævhed for eller imod visse undertyper20.
For immunhistokemisk analyse, mus var perfunderet med 4% PARAFORMALDEHYD og hjerner blev fjernet. 50 μm vibratome skiver var forberedt gennem målrettede hjernen regionen og gemt i frostvæske løsning og/eller forarbejdes til immunfarvning som tidligere beskrevet20. Nogle hjerner indeholdt ikke nogen tomat + celler, hvilket kan skyldes forkert målretning (f.eks. indsprøjtning for dybt i ventriklen), celler tabt eller undergår apoptose i løbet af podning procedure, eller afvisning af transplanterede celler af værten. Baseret på sidste celle tæller, er det anslået, at kun 2-5% af podede celler overleve20, som er i overensstemmelse med andre transplantation procedurer22,23.
Ikke overraskende var der stor variation i det samlede antal tomat + celler i vellykkede transplantationer, lige fra snesevis til flere tusinde tomat + celler (figur 4A). Podede celler er lokaliseret i de korrekte regioner, med mange vise interneuron morfologier og godt karakteriseret interneuron neurokemiske markører (figur 4B). Lignende celle overlevelse numre og modning profiler blev observeret, selv når cellerne blev podet ind i nye miljøer i heterotopisk transplantationscentrene (figur 4 c).
Ud over immunhistokemisk analyse, blev elektrofysiologiske analyse på podede celler udført for at bekræfte, at de har integreret i hjernen kredsløb og få vist forventede iboende og fyring egenskaber. Hjerner er høstet fra P30-35 mus og skiver rede for fysiologiske optagelser som tidligere beskrevet20. De podede interneurons præsenteret voksen-lignende fysiologiske egenskaber og forskellige affyring mønstre kunne være karakteriseret som var repræsentant for godt karakteriseret interneuron undertyper (figur 5A), tyder på, at podede interneurons var i stand til korrekt modne i værtsmiljøet. For at kontrollere, at transplanterede celler blev integreret i den neuronal netværk, blev sEPSCs også indspillet (figur 5B). Derudover et undersæt af transplantationer blev udført med interneurons udtrykker ChR2 efterfulgt af optagelse fra pyramideformet celler lokaliseret nær transplanterede interneurons. Disse data viste, at postsynaptiske GABAergic strømme er fremkaldt af blåt lys (figur 5 c-D).
Figur 4 : Podede interneuron prækursorer udfylde vært hjerneregioner repræsentative sektioner fra P30 WT-mus, der blev transplanteret med tomat + interneuron prækursorer på P1. (A) i homotopic cortex til cortex transplantationscentre, de podede celler udfylde alle kortikale lag og vise morfologier, der efterligner endogene interneurons. Udvalgte billeder fremhæve variabilitet i celle numre fra forskellige transplantationer, med det venstre billede har et langt større antal tomat + celler pr. afsnit i forhold til transplantation i højre side. (B) lav forstørrelse (venstre) og høj forstørrelse (højre) repræsentative afsnit fra homotopic hippocampus at hippocampus podninger. Bemærk at fleste tomat + celler i stratum oriens (så) express SST (sandsynligvis O-LM celler), der henviser til, at mange tomat + celler i stratum pyramidale (SP) express PV (sandsynligvis kurv celler), svarende til endogen hippocampus interneurons. (C) eksempel på en heterotopisk transplantation (Cortex til Striatum) med tomat + stede i striatum. Skalere barer = 200 μm i A i lav mag panel i B, 50 μm i C og høj effekt mag i B. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Podede interneurons electrophysiologically modne og integrere i vært neuronal netværk
(A) repræsentative eksempler på de højeste fyring frekvenser optaget fra podede interneurons. Venstre, hurtigt Spiking interneuron fra en Hip til Ctx graft, injiceres nuværende trin:-100 pA og 520 pA; rigtige, ikke-Fast Spiking interneuron fra en Ctx til Ctx graft, injiceres nuværende trin: -100 pA og 360 pA. (B) eksempel på sEPSCs registreres i et sent Spiking interneuron fra hofte til hofte transplantation. (C) repræsentative billede viser Nkx2.1-Cre; Ai32 celler (YFP) fra en Ctx til Ctx transplantation med et biocytin-fyldt (rød) pyramideformet celler. Skalalinjen = 50 μm. (D) eksempel på en GABAergic postsynaptiske strømninger fremkaldt af blå lysimpulser indspillet i pyramideformet celler, registreres med en [145 mM] Cl-. I sort, gennemsnit spor; i rødt, gennemsnitlige svar registreres i overværelse af Gabazine. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk aspekt i denne protokol maksimering overlevelsesevne af celler. At sikre, at væv og celler er altid i iskolde carboxygenated sACSF er nødvendigt at fremme celle overlevelse. Dette kræver en effektiv dissektion og dissociation strategi at minimere længden af tid, cellerne bruger i forskellige løsning og uden for hjernen-miljø. Afhængigt af antallet af områder af hjernen er dissekeret og transplanteres, kan det være gavnligt at have en partner støtte i dissektion og/eller transplantation skridt til at mindske længden af eksperimentet. For at sikre sundhed og overlevelse af pup, er det også afgørende at minimere anæstesi istid (< 4 min) og holde den pup opvarmet med lys under proceduren transplantation.
Der kan være betydelig variation i de transplanterede hjerner, nogle må ikke indeholde nogen podede celler, mens andre hjerner vil indeholde tusindvis. Kombinere flere P0-P2 kuld til dissektion kan øge antallet af celler høstet for podning, som tillader en at enten øge transplantation celle tæthed og/eller øge antallet af podede unger, som begge vil forbedre sandsynligheden for vellykkede transplantationer. For at målrette ordentlig hjernen regionen, er det kritisk, at den pup hoved er stabiliseret og bevæger sig ikke når sænke mikropipette ind i hjernen. Enhver omlægning af hovedet eller bøjning af mikropipette skaft kan resultere i mistargeting og unøjagtige injektioner (såsom tab af celler i den laterale ventrikel). Derudover kan udfører flere injektionssteder pr. hvalp (ensidigt eller bilateralt) forbedre succesrate i tilfælde af en injektionsstedet er mistargeted. Fremover, ville det være optimalt at udvikle en mere effektiv stereotaxisk strategi for at stabilisere pup og giver mere nøjagtige og konsekvente injektioner.
Th P0-P2 tidsramme var valgt af både videnskabelige og tekniske grunde. I denne alder, de fleste interneuron prækursorer har migreret til deres terminal steder men har minimal miljøvekselvirkninger. Denne tidsramme kan ikke holder stik for andre neuronal celletyper og hjerneregioner, så kan man ønsker at justere disse timepoints til deres særlige formål. For eksempel, det ville være interessant at sammenligne disse P0-P2 høstet interneuron prækursorer med MGE-høstet celler terapeutiske potentiale: en alder kan have flere fordele og/eller mindre uønskede bivirkninger end den anden. Derudover kunne det være interessant at udføre heterochronic transplantationer (fx indsamling celler på P0-P2 og omplantning i P7-10 hjerner, eller vice versa) at identificere hvordan timeligt ændringer i miljøet kan påvirke celle skæbne og modning. Fordelen ved udfører injektioner på P0-2 er, at kraniet er forholdsvis tynd og kan let gennemtrænges med en skarp mikropipette. Enhver injektioner over P5 vil kræve fjernelse eller udtynding kraniet.
Den analyse, der er beskrevet i denne protokol er begrænset til særlige karakteristika af interneuron undertyper, der udtrykkes varierende mellem hjerneregioner. I fremtiden kunne man udnytte enkelt celle sekventering magt til at karakterisere den fulde transkriptom af podede celler. Denne fordomsfri tilgang kunne identificere specifikke gener (eller større signaling cascades) der er stærkt beriget eller depleteret i transplanterede celler i forhold til kontrol, hvilket ville give indsigt i kandidat miljømæssige stikord, der ville påvirke skæbne bestemmelse eller modning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health (K99MH104595) og NICHD murene forskningsprogram til T.J.P. Vi takker Gord Fishell, i hvis lab denne tilgang blev oprindeligt etableret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
