Summary
새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.
Abstract
신경 운명 결정과 성숙 유전 프로그램 및 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 요구 한다. 그러나,이 분화 과정을 조절 하는 외부 메커니즘 대 내장의 역할 disentangling 모든 발달 neurobiologists에 대 한 수수께끼 이다. 이 문제는 GABAergic 수, 과도 미 발달 구조에서 태어나 고는 telencephalon 걸쳐 분산 수와 철새 단계를 받아야 하는 매우 다른 유형의 세포 인구에 대 한 확대 됩니다. 어떻게 다른 두뇌 환경 영향 interneuron 운명과 성숙 탐험, 우리 붙일 레이블된 미숙한 interneuron 선구자 신생아 쥐 (P0-P2)에 있는 특정 한 두뇌 지역에서 수확에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 나이에, interneuron 마이그레이션이 거의 완료 되 고이 세포는 상대적으로 작은 시 냅 스 통합 된 그들의 마지막 휴식 환경에 거주 하는. Cytometry 통해 단일 셀 솔루션의 컬렉션, 다음 이러한 interneuron 선구자 P0-P2 wildtype 출생 후 새끼로 이식 됩니다. 두 homotopic 수행 하 여 (예를 들어, 피 질-피 질) 또는 heterotopic (예, 피 질-해 마) 이식, 수 평가 새 뇌 환경에 미 숙 수 도전 미치는 그들의 운명, 성숙, 그리고 회로 통합. 두뇌는 성인 쥐에 수확 될 수 있으며 immunohistochemical를 포함 하 여 이식할된 셀에 posthoc 분석의 광범위 한 분석 electrophysiological 및 transcriptional 프로 파일링. 이 일반적인 접근 방식을 제공 합니다 어떻게 가지 두뇌 환경 분석 결과를 전략 수 있습니다 신경 개발의 많은 측면에 영향을 미칠 수 사와 특정 신경 특성은 주로 내장 돼 유전자 프로그램에 의해 구동 확인 또는 환경 단서입니다.
Introduction
적절 한 대뇌 피 질의 기능 필요 흥분 성의 프로젝션 뉴런을 억제 GABAergic 수, 명료한 형태학, electrophysiological 속성, 연결 된 매우 이질적인 인구 사이 균형 및 neurochemical 마커입니다. 비정상적인 개발 및 기능 수 (및 특정 interneuron 하위 그룹)의 정신 분열 증, 자폐증, 간 질1,2,3등 정신 장애의 pathobiology에 연결 되었습니다. 또한, 이러한 뇌 장애에 연루 된 많은 유전자는 젊은 수4농축 강력 하 게. 따라서, interneuron 운명 결정 및 성숙 조절 메커니즘의 이해는 정상적인 개발 및 수많은 뇌 질환의 잠재적인 etiologies 이해 필요 합니다.
개 수는 주로 두 가지 과도 배아 구조, 중간 그리고 꼬리 절 정령에서 태어난 (MGE 및 CGE, 각각). 이러한 postmitotic 세포 (interneuron 선구자)는 telencephalon 걸쳐 분산 그들은 다양 한 회로 통합할 수와 접선 마이그레이션 단계를 받 다. MGE 파생 수 세 크게 겹치지, neurochemically 정의 된 하위 그룹의 구성: 빠른 parvalbumin (PV+) 수, 비-빠른 somatostatin (SST+) 수 급상승 급상승 하 고 늦게 신경 급상승 질소 산화물 synthase (nNOS+) 수 hippocampal 아이비와 neurogliaform 세포를 구성 하는. 수많은 연구소 PV+ 또는 SST + 수, morphogens, interneuron 일어나, 생년월일 및 neurogenic 사단의 모드의 공간 그라디언트를 포함 하 여 초기 운명 결정을 통제는 MGE 내의 여러 메커니즘을 확인 했습니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 수 처음 '추기경 클래스'로 차별화 하 고 다음 점차적으로 성숙 '최종 클래스' 그들은 그들의 환경11상호 작용으로 제안 되었습니다. 최근의 증거는 나타냅니다 일부 성숙한 interneuron 하위 유전자 내장 돼 이러한 세포가 절 정령에 postmitotic로 나타내는 초기 정의 본질적인 유전 프로그램 이전 보다 더 큰 역할을 할 수 있습니다. 평가12,13. 그러나, 본질적인 유전 프로그램 별개 interneuron 하위 유형으로 차별화 실현 환경 신호 상호 작용 하는 방법의 핵심 문제 크게 미개척 남아 있습니다.
수많은 연구는 다양 한 뇌 영역, 성숙 세포를 융합 하 고 일반적으로 지역 내 생 회로14,15, 억제 하는 GABA를 해제 합의 결과에 직접 배아 MGE 셀을 이식 16,17,,1819. 이러한 관측을 약속 인간 유도 만능 줄기 세포 (hIPSC)를 사용 하 여에 상당한 관심을 생성-다양 한 뇌 질환을 치료 하는 수를 파생. 그러나, 하나의 중요 한 구성 요소 변환 방법 들에 대해 생각 한다 이러한 연구의 거의 평가이 이식할된 세포 성숙 수의 예상된 유형으로 성숙 하는 경우.
해결 하기 위해 어떻게 환경 영향 interneuron 분화 및 성숙, 전략 이식할된 수는 호스트의 기능 채택 여부를 시험 하기 위하여 새로운 뇌 환경에 미 숙 interneuron 선구자를 이식 하 고안 되었다 환경 또는 기증자 환경20에서 기능을 유지. MGE 이식은 MGE interneuron 및 수많은 두뇌 지역21에 걸쳐 분산 GABAergic 프로젝션 셀의 혼합된 인구를 포함 하기 때문에이 문제를 해결 하기 위해 적합 하지 않습니다. 이러한 MGE 셀 마이그레이션한 것 모르고 하나 평가할 수 있습니다 없습니다 완전히 어떻게 이러한 이식 두뇌 환경에 의해 영향을 받습니다. 이른 출생 후 timepoints에서 interneuron 선구자, 수확 하 여이 문제는 미 숙 셀의 마이그레이션을 완료 하 고 그들의 목표에 도달 하 여 피할 지역 뇌 하지만 최소한의 상호 작용 환경. 다른 두뇌 지구 사이 표현 차동 수의 특정 기능에 집중 함으로써, 하나는 다음 호스트 환경 interneuron 속성을 변경 하는 방법을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 일반적인 접근 모든 조사에 적용 해야 새로운 환경에 도전 젊은 신경 세포를 검사 하 고 싶어 때 행동.
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Protocol
모든 실험 절차 국립 보건원의 지침에 따라 실시 했다 고 NICHD 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인 했다. 아래에 설명 된 프로토콜 활용 Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ MGE 파생 interneuron 선구자, 수확 새끼 하지만 어떤 원하는 형광 기자 마우스 라인에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 남성과 여성 이른 출생 후 마우스 (P0-P2)는 기증자와 호스트 조직에 대 한 무차별 사용 되었다.
1. 솔루션 준비
- 자당 인공 뇌 척수 (sACSF) 다음 제조 법 (mm에서 단위)에 따라 준비: 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 포도 당, 75 자당 95 %O 포화 2, 5% CO2 pH 7.4 =.
- 350 mL 순수 ddH2O 비 커 최종 원하는 볼륨에 따라 채우기 (sACSF의 500 mL에 1-2 담가 충분 해야 한다), 자석 볶음 바 추가 하 고 저 어 접시에 비 커를 놓습니다.
- Weight 모든 소금 (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2포4, 포도 당, 자당), 한 시간에 하 고 다음 표에 따라 물에 추가 합니다. 금액은 최종 원하는 볼륨에 따라 조정할 수 있습니다.
시 약 분자량 농도 (mM) 그램/500 mL 염화 나트륨 58.44 87 2.54 나트륨 중 탄산염 84.01 26 1.09 염화 칼륨 74.55 2.5 0.09 인산 이수소 나트륨 119.98 1.25 0.08 포도 당 180.16 10 0.9 자당 342.3 75 12.84 - 95% O2, 5% CO2 (carboxygen) CaCl2 (0.25 mL 500 mL sACSF에 대 일 분 솔루션에서)의 적절 한 금액을 추가 하기 전에 적어도 20-30 분, MgCl2 (3.5 mL 500 mL sACSF에 대 일 분 솔루션에서)와 솔루션 거품 .
- 표준 pH 미터를 사용 하 여 pH를 확인 하십시오. 정확 하 게 준비 솔루션 있어야 pH 7.4 =.
- 순수한 ddH2O 졸업된 실린더에서 500 mL의 최종 볼륨을 솔루션을가지고.
- sACSF 수 1-2 일 앞두고 준비. 사용 하기 전에, 얼음에 배치 하 고 해 부의 시작 하기 전에 적어도 15 분 동안 carboxygen와 거품 sACSF 해 부를 통해 버블링의 병을 유지.
2. 해 부 준비
- 다음 도구 소독/압력가 이어야 한다: 적어도 하나의 작은 좋은 날카로운가 위, 2 잘 집게 (스타일 #5), 미세 집게, 뇌 matrice 형과 여러 면도날 단면 곡선. 작은 주걱 두개골에서 뇌를 제거 하는 옵션입니다.
- 접시 (9 cm, 4 cm 직경)와 해 부 현미경 근처 작업 역 50 mL 원뿔 플라스틱 관 격리 된 두뇌 지구를 수집 하 고 큰 구멍 플라스틱 전송 펫, 모든 얼음에 보관 합니다. 얼음에 carboxygenated sACSF의 전체 여러 50 mL 튜브를 준비 합니다. 하나 이상의 뇌 영역 해 부, 제대로 있는지 확인 하 고 명확 하 게 레이블 컬렉션 튜브와 오염을 피하기 위하여 전송 펫.
- 저체온증, 통해 강아지의 얼음 마 취에 대 한 추가 얼음 양동이 있고 시체를 처리 하는 적절 한 유해 폐기물 가방.
- 조직 분쇄에 대 한 화재 광택 유리 펫 파스퇴르를 준비 합니다. 분 젠 버너를 사용 하 여 소독 하는 피 펫의 끝 모양. 다른 구멍 구멍과 여러 펫을 준비: 큰 (~ 600 μ m), 중간 (~ 300 µ m) 그리고 작은 (~ 100 µ m). 다른 분쇄 속도 보장 하기 위해 물을 사용 하 여 도움말을 통해 흐름에 밖으로 테스트 합니다. 각 종류의 적어도 하나의 피펫으로 각 격리 된 뇌 영역에 대 한 필요 하지만 막힘 또는 팁을 깨고 각 크기에 대 한 여분의 몇을 데는 것이 좋습니다.
3. 이식 준비
- 뾰족한 유리 micropipettes를 준비 하는 전극 끌어당기는 사람을 사용 합니다. 휴식 또는 경사 날카로운 각도 포인트를 만들기 위해 팁 팁 ~ 20-40의 직경을 갖는 µ m. 시각적으로 검열 하십시오 팁 되도록 먼지 현미경 또는 잔여 유리 입자는 조리개를 방해.
- 미세 바늘 주사기를 사용 하 여 완전히 채울 유리 제 micropipette 미네랄 오일. Nanoject 장치 (또는 다른 microinjection 장치)에 micropipette를 삽입 합니다. Nanoject III에 대 한 다음 프로그램을 설정: 볼륨 60 = nL, 속도 = 30, 주기 25, 지연 = = 1 s.
- 마그네틱 베이스에 연결 된 조작자를 Nanoject 고 조정 조작자는 Nanoject, 곧장 가리키는 하지 x 또는 y 따라 기울이면 축.
- 일부 접착제 퍼 티 연결 (~ 1-2 cm P0-P2 새끼에 대 한)에서 강아지의 머리를 휴식을 높은 표면을 만드는 페 트리 접시의 커버의 상단에.
- 실험실의 컷 ~ 6-8 cm 긴 줄무늬 테이프 하 고 중간에 다이아몬드 모양의 구멍을 확인 합니다. 테이프는 또한 피부를 스트레칭 하 고 랜드마크 및 대상된 지역의 쉽게 시각화를 허용 하면서 절차 동안, 강아지의 머리를 안정 시키기 위해 사용 됩니다.
- 주입 역 난방 패드를 준비 하 고 주사를 시작 하기 전에 '낮은' 설정 설정. 패드 커버 몇 종이 수건 이나 기저귀 패드와 함께.
- 만약 여러 개의 이식 조건, 수행 수행 준비가 작은 위 태그 발가락/꼬리 클리핑 받는 다른 주사 새끼.
4. P0-P2 마우스 뇌의 제거
- 바로 시작 하기 전에 절차, 냉장된, carboxygenated sACSF로 여러 접시를 채우십시오. 또한 컬렉션 tube(s) 채울 25 mL sACSF.
- 얼음 아래 일부 parafilm 또는 장갑과 잘 적용 하는 곳에 P0-P2 강아지를 바꿈. 5 분 타이머를 설정 하 고 그것을 시작 합니다. 그 시간 후에 강아지를 제거 하 고는 hindpaw의 곤란에 응답 하지 않는 확인 하십시오.
- 강아지 목을 벨을 sACSF로 가득 페 트리 접시에 머리를 수집 합니다. 두개골을 노출 하는 중간 선 따라 피부를 잘라.
- Hindbrain/척수에서 두개골에 오프닝 찾아서 두개골의 등 쪽 부분을 따라 집게의 한쪽 끝을 삽입 합니다. 부드럽게 정중 선에서 두개골을 파악 하 고 '껍질' 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 되 고, 뇌를 옆으로 멀리 조각.
- 두개골의 등 쪽과 측면의 제거를 따라 부드럽게 모든 영역을 손상 하지 않으려고 하는 두뇌의 복 부 표면 아래 떠 서 여 두개골에서 뇌를 제거 하는 집게 또는 주걱을 사용 합니다. 장소 다른 배양 접시에 두뇌 carboxygenated sACSF로 가득합니다.
참고: 우리는 해 마가와 피 질 해 부에 대 한 두 개의 서로 다른 전략을 제시. 첫 번째 전략 (단계 5.1-5.10)는 두 번째 전략 (단계 6.1-6.7) 깔끔하게 globus pallidus 및 다른 뇌 구조는가 분리 하는 형광 기자 마우스 필요 반면 어떤 마우스 라인에 대 한 유용 합니다. 가 적절 하지 않으면 다음 두 가지 방법 중가 특정 부분 무시
그림 1 : 회로도 및 뇌 해 부, 기술 # 1에 대 한 이미지
해 부 기술 단계 5.1-5.10에에서 설명 된입니다. Striatal 조직, 필요한 경우를 뇌 행렬 복 부 측에 P1 뇌를 놓습니다. 면도날을가 통해 코로나 섹션 앞쪽 뇌를 통해 matrice 슬롯에 넣으십시오. 두 반구에서 striatal 조각을 제거, 해 마 앞쪽을 포함 된 모든 섹션에 대 한 반복. Striatal 조직이 적절 하지 단순히 hemisect는 뇌 반구 내측 측 최대는 접시에 놓고 노출 해 마 복 부 중간 뇌 구조 (시상, 기초 중추, 등)을 제거 합니다. 핀셋을 사용 하 여 해 마의 대 타 그리고 반구를 뒤집어 핀셋을 사용 하 여 청크 대뇌 피 질의 조직 해 부. 도식 반구 어디 인하 striatal 섹션을 제거 하는 것을 통해 수직 블랙 라인. 눈금 막대 500μm =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
5. 수확가, 해 마, 외피, 기술 #1
- 전체 두뇌 matrice 형, 복 부 측을 단면에 배치 합니다. (이전 후 각 관)을 통해 뇌의 가장 앞쪽 부분을 통해 1 면도날을 배치 합니다.
- 다른 면도날 단지 0.5 m m 슬라이스를 생성 하는 첫 번째 후부를 삽입 하 고 추가 면도날이 하나 후부 장소.
- Carboxygenated sACSF와 페 트리 접시에이 분할 영역을 전송 하 고 sACSF와 함께 별도 접시에 두뇌의 나머지를 장소. 가 시각화 해 범위를 striatal 분할 영역을 전송 합니다. 이러한 조각 앞쪽가의 큰 부분을 포함 하 고 해 마 부족 해야 합니다. Nkx2.1-Cre+; 범위 해 부 형광을 사용 하 여 Ai9+ 슬라이스 약한 striatal tdTomato 차별화 globus pallidus의 강한 tdTomato 신호에서 신호.
- 또는 형광 없이, sACSF 제대로 분류 50 mL 튜브에 모든 섹션 및 전송 striatal 덩어리 두 반구에서가 밖으로 꼬집어, 얼음에 저장.
- Hemisect 집게 또는 면도칼 블레이드를 사용 하 여 중간 선 따라 뇌 반구 그렇게 중간 표면 향하게 누워.
- 이 조직에서 꼬 집는 집게와 복 부 뇌 조직 (시상, 기초 중추, 등)을 제거 합니다. 언제 완료, 해 마 (등 피 질에 따라 anteroposterior 축에 걸친 소시지 모양의 구조) 하 고 피 심 실 측 명확 하 게 표시 되어야 합니다.
- 해 마를 제거 하려면 이전 해 마 앞 집게의 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 분리 해 마 피 질에서 대뇌 피 질의 hippocampal 국경 곤란 하 게는 집게를 뒤로 이동. SACSF 제대로 분류 50 mL 튜브에 격리 해 마를 전송, 얼음에 저장.
- 피 질 부, hemisected 피 층 중간 쪽을 아래로 놓습니다. 다음은 집게를 사용 하 여 가장 등 꼬집어, 복 부, 앞쪽 및 후부 부분 중간 somatosensory 피, ~ 2 m m x 2 m m.의 사각형 덩어리를 두고 피 플립 피 질 그래서 중간 쪽이 고 어떤 과잉 비 대뇌 피 질의 조직 (시상의 깨끗 한 기초 중추, 등.) 에 필요한 경우 중간 표면. SACSF 제대로 분류 50 mL 튜브에 피 덩어리를 전송, 얼음에 저장.
- 수집 된과 피 질 하 다른 반구와 절차를 반복 영역.
- 배양 접시는 sACSF 춥고 신선한 유지 되도록 새끼 사이 sACSF를 대체 하는 모든 새끼에 대 한이 절차를 반복 합니다.
그림 2 : 회로도 및 뇌 해 부, 기술 # 2에 대 한 이미지
해 부 기술 단계 6.1-6.7에에서 설명 된입니다. 위로 해 접시 등 쪽 측에 뇌를 고정 합니다. 피 질 필 링 후 앞으로, 해 마가 표시 되 고 이전 기술에 설명 된 대로 피 섹션을 제거할 수 있습니다 다음 제거 될 수 있다. 유전자 변형 마우스 선 따라가 globus pallidus 및 다른 조직을 제거 하 정리 수 있습니다. Nkx2.1Cre;에 Ai9 마우스 선, globus pallidus는 토마토 + 셀는 비해 상당히 높은 밀도. 눈금 막대 = 500 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
6. 수확가, 해 마, 외피, 기술 #2
- 뇌 복 부 측 아래로 sACSF를 포함 하는 sylgard 코팅 페 트리 접시에 놓고 앞쪽 피 질, 소 뇌 및 후 각 전구를 통해 그것을 아래로 핀.
- 한 반구와 시작 하는 것 사용해 부드럽게 기본 해 마에서 후부 대뇌 피 질 및 다른 조직 분리 곡선된 겸 자. 부드럽게 페 트리 접시에 껍질을 벗 겨 피 질을 하다. 다른 반구에 대 한 반복 합니다. 된와가 노출 된 뇌에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다.
- 집게를 사용 하 여 하는 중간에 한 해 마를 꼬 집 고 껍질을 제거 하는 옆 해 마. 얼음에 컬렉션 유리병에 놓고 다른 해 마와 함께 반복 합니다.
- 가, 주변 조직에서 그것을 풀고가의 가장자리 주위 긁어 부드럽게. 다음 그것에서 밑을 곤란 하 게 하 여 여가 제거 하 고 얼음에 컬렉션 튜브에 추가. 다른가를 반복 합니다.
- 대뇌 피 질의 섹션 단계 5.8에서에서 설명한 대로 수확 될 수 있습니다.
- 기자는 유전자 변형 마우스 라인을 사용 하는 경우 (예: Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, 등), sACSF와 페 트리 접시가 전송 및 형광 범위 해 부 아래 볼. 집게를 사용 하 여 (에서 Nkx2.1-Cre;가에서 어떤 비 striatal 조직을 제거합니다 Ai9 마우스, globus pallidus 훨씬 높은 MGE 파생 된 tdTomato + 셀 밀도 비해 서 모든 '밝은' 조직 제거). 모든가 대 한 반복 합니다.
- 배양 접시는 sACSF 춥고 신선한 유지 되도록 새끼 사이 sACSF를 대체 하는 모든 새끼에 대 한이 절차를 반복 합니다.
7. 단일 셀 Dissociations 생성
- 해 부를 완료 한 후 준비 1 mg/mL 나 솔루션 10 mg 나 무게와 10 mL carboxygenated sACSF에 용 해.
- 전송 5 ml 50 mL 수집 튜브에서 조직 라운드 하단 튜브 나 sACSF 솔루션의 2 개 mL를 포함 하. 조직 샘플을 혼합 하는 인큐베이션 기간 동안 3-4 번 손가락으로 튜브 떨고/터치 실 온에서 20 분 동안 품 어.
- 이 잠복기 동안 재구성 솔루션 준비: 1 %FBS (100 μ) + DNAse (1:10,000의 1 μ 재고 DNAse) 10 mL carboxygenated sACSF에.
- 20 분 후 신중 하 게 하단에, 조직 방해 하지 나 솔루션을 제거 하 고 재구성 솔루션 (전체 볼륨은 시작 하는 양의 조직에 따라)의 1-2 mL와 함께 그것을 대체.
- 기계적 분쇄 이전 준비 화재 광택 파스퇴르 펫으로 조직 하 여 조직 분리. 큰 구멍 (~ 600 μ m) 피펫으로, 발음을 헤어 조직 조직 솔루션 10 번 이상 추방. 솔루션에는 거품을 소개 하지. 매체 피 펫을 작은 구멍 피 펫에 대 한이 프로세스를 반복 합니다. 솔루션 흐린 고 조직의 아무 명확한 조각 컬렉션 튜브에 표시 되어야 합니다.
- 피펫으로 세포 lysate 솔루션 셀을 제거 하 5 mL 원뿔 튜브로 50 µ m 필터를 통해 묶습니다. 이러한 단일 셀 솔루션 cytometry 흐름을 진행 (또는 잠재적으로 직접 셀 계산 없는 정렬 하는 경우 필요).
8. 이식 FACS 정화 셀 솔루션을 준비합니다.
- 교류 cytometer에서 셀 솔루션을 받으면 솔루션 하나 (또는 여러) 1.5 mL 원뿔 튜브에 전송 하 고 스핀 4oc.에서 5 분 동안 500 g에서 셀 원심, 후 미디어를 제거 그래서 그 20 ~ 40 µ L 튜브에 남아. 미디어를 남아 있는 셀이 다시 구성 (그리고 솔루션을 결합 하는 경우 여러 튜브 필요).
- Parafilm의 작은 조각에 믹스 함께 셀 솔루션 + 8 µ L sACSF의 2 µ L + 10 µ L trypan 푸른 얼룩의. 피펫으로 10 µ L hemocytometer 슬라이드 커버로.
- 표준 실험실 손 집계 카운터를 사용 하 여 hemocytometer의 모서리에 4 x 4 정사각형 격자의 각 라이브 셀의 수를 계산 (죽은 세포는 염료에서 블루 됩니다), 이러한 4 건의 평균. 100 µ L 당 세포의 수를 결정 하 여이 수를 곱하면.
- 필요한 경우, 재구성 솔루션에서 10000-30000 셀 / µ L의 농도에서 세포는 볼륨을 조정 합니다. 최종 농도 세포의 총 금액 및 간이식의 원하는 숫자에 의존 합니다. 세포 이식에 대 한 얼음에 계속
9. P0-2 WT 강아지에 이식
- 얼음 아래 일부 parafilm 또는 장갑과 잘 적용 하는 곳에 WT 강아지를 바꿈. 5 분 타이머를 설정 하 고 그것을 시작 합니다. 그 시간 후에 강아지를 제거 하 고는 hindpaw의 곤란에 응답 하지 않는 확인 하십시오.
- 얼음에 강아지를 실행 하는 동안 그것에 pipetting 세포 현 탁 액은 로드 전에 잘 혼합 되도록 여러 번에 의해 셀 솔루션을 혼합 (혼합 모든 사출 micropipette 로드 하기 전에 셀). 그리고 미네랄 오일의 micropipette 빈 세포 현 탁 액 완전히 채워.
- 그의 머리는 머리의 맨 위에 비교적 평평한 접착제 퍼 티에 누워 마 취 강아지 페 트리 접시에 놓습니다. 피부는 기지개 하 고 머리는 확고 하지만 마우스는 편안 하 고 호흡 잘 정비 된 당기는 강아지의 머리에 걸쳐 다이아몬드 구멍 테이프를 배치 합니다. 람다는 다이아몬드 구멍을 통해 표시 되어야 합니다.
그림 3 : 회로도 및 이식에 대 한 이미지
(A) 주입의 사진. Note는 람다 강아지의 두개골을 통해 명확 하 게 볼 수 있으며는 micropipette 비우기 위해 사용 되어야 한다. 눈금 막대 = 1 인치. (B) 회로도 주입 절차를 묘사 해 마를 대상으로 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- Nanoject 아래 보안된 강아지를 이동 하 고가 micropipette의 팁에 람다 바로 위에 micropipette 낮은. 조작자의 x y 좌표를 기록 합니다.
- 입장 및 머리의 anteroposterior 축 따라 원하는 좌표는 micropipette 이동 조작 손잡이 조정: S1 피 질 → 앞쪽 1.0 m m와 1.0 m m 측면, 해 마 → 0.75-1.0 m m 앞쪽 및 1.0-1.2 m m 측면가 → 2.0-2.2 m m 앞쪽 및 1.5 m m 옆. 좌표 (예: P0 및 P2) 강아지의 나이 또는 마우스 (예를 들어, 마우스는 보다 큰 CD1 및 C57/B6 p 2에서)의 변형에 대 한 보상을 약간 조정할 수 있습니다.
- 그것은 피부에 작은 오목 함 형성 될 때까지 micropipette를 낮춥니다. 다음 단단히 부드럽게 드라이브 피부와 두개골 두뇌를 입력을 통해 micropipette 하지만 z 축 조작 노브를 켜십시오. micropipette 들어갈 때 두뇌, 두개골에 압력 나올 것 이다 고는 오목 함이 사라질 것 이다.
- 철회는 micropipette 약간 끝에 둘러싸여 피부, 텐트 모양 콘 때까지. Z 축 따라 좌표 읽기:이 z 축을 0 포인트가 될 것입니다.
- 원하는 깊이에 micropipette 낮은: 피 질 → 0.75-1.0 m m, 해 마 →가 → 2.0-2.5 m m. 깊이 수 1.2-1.5 m m 나이 또는 강아지의 변형에 대 한 보상을 약간 조정 될.
- 위에서 설명한 Nanoject III 프로그램을 사용 하 여 세포 현 탁 액을 주입. 주입 후 프로그램 완료, 15-20 s 천천히 주사 사이트에서 새 솔루션을 최소화 하기 위해 micropipette를 제거 하기 전에 잠깐.
- 양자를 수행 하는 경우 주사, 다시 위의 람다 micropipette 제로 하 고 다른 반구에 적절 한 좌표를 이동 합니다. 또는, 하나는 micropipette 1mm 처음 주입의 앞쪽으로 이동 하 여 같은 반구의 피 질에 2 개의 주사를 만들 수 있습니다.
- 이식이 완료 되 면 테이프를 제거 하 고 난방 패드에 강아지를 전송. 필요한 경우, 꼬리 또는 발가락 클리핑 하 여 강아지 태그. 일단 강아지는 reacquired 붉은 색 이며 이동, 어머니와 장에 다시 놓습니다.
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Representative Results
이 프로토콜 이른 출생 후 뇌 (그림 1-2)에서 특정 뇌 영역을 수확, interneuron 선구자의 단일 셀 dissociations 수집 순진한 WT에 다양 한 뇌 영역으로이 세포를 이식 하는 방법을 보여 줍니다. 산 후 새끼 들 (그림 3) Posthoc 분석, interneuron 전조 이식 받은 두뇌 세포 형태학, neurochemical 마커 및 electrophysiological 속성 특성 P30-35 사이 수확 했다. 분석 실험의이 유형은 종종 P21-P30 정상적인 쥐에 사이 수행 됩니다 하지만 이식된 세포의 성숙 해 부/분리 절차 때문에 약간 지연 될 수 있습니다, 추가 5-10 일을 기다리는 것이 좋습니다 이것에 대 한 보상 지연된 성숙입니다. 수행 하는 분석의 유형 두뇌를 수확 하기 위해 적절 한 전략을 쓰게 됩니다. 특히, 우리는 우선 세포 죽음 또는 특정 하위20에 대 한 편견 수 특정 interneuron 하위 그룹의 관찰 하지 않았다.
Immunohistochemical 분석에 대 한 마우스 했다 4 %paraformaldehyde 끼얹는다 고 두뇌 제거 되었다. 50 μ m vibratome 조각 했다 대상된 뇌 영역을 통해 준비 및 부동 액 해결책에 저장 및/또는 앞에서 설명한20immunostaining에 대 한 처리. 어떤 두뇌 토마토 + 셀, 부적 절 한 (예를 들어,는 심 실에 너무 깊이 주사)를 대상으로, 손실 된 세포 또는 apoptosis 이식 절차, 또는 호스트에 의해 이식된 세포의 거절 하는 동안 진행 될 수 있는 포함 하지 않았다. 마지막 셀 계산을 바탕으로, 그것은 추정 이식할된 세포의 단지 2-520, 다른 이식 절차22,23은 생존.
아니나 다를까, 토마토 + 수십에서 몇 천 토마토 + 셀 (그림 4A)에 이르기까지 성공적인 이식 세포의 총 수에서 중요 한 변화가 이었다. 이식할된 세포 올바른 지역, 많은 현지 했다 interneuron 형태학 및 잘 특징이 interneuron neurochemical 마커 (그림 4B) 표시. 유사한 세포 생존 수 및 성숙 프로필 셀 heterotopic 간이식 (그림 4C)에서 새로운 환경으로 융합 되었다 때에 관찰 되었다.
Immunohistochemical 분석 이외에 이식할된 세포에 electrophysiological 분석 그들은 두뇌 회로에 통합 하 고 예상된 기본 및 발사 속성 표시를 확인 위해 수행 되었습니다. 두뇌 P30-35 쥐에서 수확 했다 고 조각 설명된20이전 생리 녹음에 대 한 준비. 이식할된 수 성인 같은 생리 적 속성을 제시 하 고 뚜렷한 발사 패턴 수 특징을 잘 특징이 interneuron의 대표 했다 하위 (그림 5A), 제안 하는 투입 수 호스트 환경에서 제대로 성숙 할 수 있었다. 확인 이식된 세포 신경 네트워크에 통합, sEPSCs는 또한 기록된 (그림 5B). 또한, 이식의 부분 집합 수 ChR2 근처 지역화 된 이식된 수 피라미드 세포에서 기록 하 여 다음 표현으로 수행 했다. 이러한 데이터 postsynaptic GABAergic 전류 푸른 빛 (그림 5C-D)에 의해 불러 일으켰다는 설명 했다.
그림 4 : 이식할된 interneuron 선구자 interneuron 선구자 토마토 + p 1에서 호스트 두뇌 지구에서 이식 했다 P30 WT 쥐 대표 섹션 채울. (A) homotopic 피 질-피 질 이식에 이식할된 세포 모든 피 질 레이어를 채우는 고 생 수를 모방 하는 형태학을 표시. 선택한 이미지 섹션 오른쪽에 이식에 비해 당 토마토 + 셀의 훨씬 더 큰 숫자가 왼쪽된 이미지와 다른 이식에서 셀 수 있는 가변성을 강조 표시 합니다. (B) 낮은 확대율 (왼쪽) 및 고배율 (오른쪽) 대표 homotopic 마 마 이식에서. 참고 많은 토마토 + 셀 지층 pyramidale (SP) 익스프레스 PV (가능성이 바구니 세포), 내 생 hippocampal 수와 비슷한 반면 대부분의 지층 oriens에 토마토 + 셀 (그래서) SST (가능성이 O LM 셀)을 표현 합니다. 토마토 + 여가 heterotopic 이식 (피 질 대가)의 (C) 예. 스케일 바 B, C에서 50 μ m와 b에서 고성능 매기에에서 낮은 매기 패널에서 a에서 200 μ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 이식할된 수 electrophysiologically 성숙 하 고 호스트 신경 네트워크에 통합
(A) 높은 발사 주파수의 대표적인 예는 이식할된 수에서 기록. 왼쪽엉덩이 Ctx 이식에서 빨리 급상승 interneuron 주입 현재 단계:-100 pA와 520 pA; 바로, 비-빠른 급상승 interneuron Ctx Ctx 이식에서 주입 현재 단계:-100 pA와 360 실바 (B) sEPSCs의 예 엉덩이-엉덩이 이식에서 늦게 급상승 interneuron에 기록. (C) 대표 이미지 표시 하는 Nkx2.1-Cre; Ai32 세포 (YFP) Ctx를 Ctx biocytin 가득 (빨간색) 피라미드 세포와 함께 이식. 눈금 막대 = 50 μ m. (D) 블루 빛 펄스에 의해 evoked GABAergic postsynaptic 전류의 예 기록 피라미드 세포에 [145 m m] Cl-와 기록. 블랙, 평균 추적; 빨간색, 평균 응답 Gabazine의 기록. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 하나의 중요 한 측면은 세포의 생존을 극대화 이다. 조직과 세포는 항상 얼음 감기 carboxygenated sACSF에서 보장 하는 것은 세포 생존을 촉진 하는 데 필요한입니다. 이 효율적인 해 부와 셀 다양 한 솔루션 및 두뇌 환경 외부 지출 시간의 길이 최소화 하기 위해 분리 전략을 필요 합니다. 뇌 영역 해 부 되 고 이식의 수에 따라 실험의 길이 감소 해 부 또는 이식 단계에서 원조 하는 파트너에 유리할 수 있다. 건강 하 고 강아지의 생존을 보장 하기 위해, 그것은 또한 얼음 마 취 시간 (< 4 분)을 최소화 하 고 이식 절차 동안 빛으로가 열 하는 강아지를 유지 하는 중요 한.
이식된 두뇌에 중요 한 변화 수, 다른 두뇌 수천을 포함 하는 동안 일부 이식할된 셀을 포함할 수 없습니다. 해 부에 대 한 여러 P0-P2 새끼를 결합 하거나 이식 세포 밀도 증가 및 둘 다의 가능성을 향상 시킬 것입니다 이식할된 새끼의 수를 증가 한 수 있는 접목, 수확 하는 셀의 수를 늘릴 수 있습니다. 성공적인 이식입니다. 적절 한 뇌 영역을 대상으로 강아지의 머리는 안정 하 고 뇌에는 micropipette 낮추는 때 이동 하지 않습니다 중요 하다. 머리의 어떤 변화 또는 micropipette 샤프트의 절곡 mistargeting 및 부정확 한 주사 (측면 뇌 실에 셀의 손실) 등에서 발생할 수 있습니다. 또한, 수행 강아지 당 다중 사출 사이트 (일방적으로 또는 양자) 향상 시킬 수 성공률 경우 한 사출 사이트 mistargeted. 미래에, 그것은 강아지를 안정 하 고 더 정확 하 고 일관 된 주사를 제공 하는 더 효율적인 stereotaxic 전략 개발 최적의 것입니다.
Th P0-P2 기간 과학 및 기술적인 이유로 선정 되었다. 이 나이에 대부분 interneuron 선구자 터미널 사이트를 마이그레이션한 하지만 최소한의 환경 상호 작용. 이 기간 한 그들의 특정 목적에 대 한 이러한 timepoints를 조정 하고자 할 수 있습니다 다른 신경 세포 유형과 두뇌 지구에 대 한 사실 보류 수 있습니다. 예를 들어 이러한 P0-P2 수확 interneuron 일어나 MGE 수확 세포 치료 가능성을 비교 하는 흥미로운 것: 한 나이 더 많은 혜택을 할 수 있습니다 또는 덜 다른 사람 보다 부작용을 원치 않는. 또한, 그것은 heterochronic 이주 (예: P0-p 2에서 세포를 수집 하 고 P7-10 두뇌, 또는 반대로 이식)을 수행 재미 있을 수 있는 환경에서 어떻게 시간적 변화를 식별 하 수에 영향을 세포 운명과 성숙. P0-2 주사를 수행의 장점은 두개골 상대적으로 얇은 이며 날카로운 micropipette로 쉽게 관통 될 수 있다. P5에 어떤 주사 제거 또는 두개골 숱이 필요 합니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 분석 두뇌 지구 사이 표현 차동 interneuron 하위의 특정 특성으로 제한 됩니다. 미래에 이식할된 세포의 전체 transcriptome 하 단일 셀 시퀀싱의 힘을 활용 수 하나. 이 편견된 방법은 특정 유전자 (또는 더 큰 신호 폭포)를 식별할 수는 강하게 농축 또는 이식된 세포 운명에 영향을 미치는 것을 환경 단서 후보에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다 컨트롤에 비해 고갈 결정 또는 성숙입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 건강의 국가 학회 (K99MH104595)와 T.J.P. NICHD 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 우리는 그 실험실에서이 방법은 원래 설립 Gord Fishell 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
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