Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

يجمع هذا البروتوكول توصيف عينة البروتين بالتفريد جل الشعرية وغربلة سريعة-ملزم يغاندس مشحونة بالتفريد الشعرية تقارب. من المستحسن للبروتينات مع بنية مرنة، مثل البروتينات اضطرابه جوهريا، لتحديد أي اختلافات في ربط كونفورميرس مختلفة.

Abstract

النباتات التي تعتمد بشدة على بيئتهم. من أجل التكيف مع التغيرات المجهدة (مثلاً، والجفاف والملوحة العالية)، تتطور النباتات العليا وفئات من البروتينات اضطرابه جوهريا (المشردون داخليا) للحد من التوتر التأكسدي وناضح. هذه المقالة يستخدم مزيجاً من جل الشعرية التفريد (فريق الخبراء الاستشاري) والتنقل shift تقارب التفريد (ACE) لوصف سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة من AtHIRD11 المشردين داخليا من نبات التمويل. يستخدم فريق الخبراء الاستشاري لتأكيد نقاء AtHIRD11 واستبعاد الأجزاء والتعديلات بوسترانسلاشونال، وغيرها من الشوائب كأسباب لأنماط معقدة الذروة. في هذا الجزء من التجربة، مفصولة هلام لزج داخل شعري واسطة كتلها مختلفة المكونات العينة مختلفة والكشف مع جهاز كشف صفيف صمام ثنائي. بعد ذلك، يجري التحقيق في سلوك ملزمة العينة نحو الأيونات المعدنية المختلفة بايس. في هذه الحالة، يجند يضاف إلى الحل المخزن المؤقت ويتم قياس التحول في وقت الترحيل من أجل تحديد ما إذا كان حدث ربط حدث أم لا. واحدة من مزايا استخدام المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لتحديد سلوك ملزمة المشردين داخليا هو إمكانية أتمتة التفريد جل والمقايسة ملزمة. وعلاوة على ذلك، فريق الخبراء الاستشاري ويبين حد أدنى للكشف من التفريد جل الكلاسيكية وايس قادرة على أن تحدد بطريقة ملزمة يجند بطريقة سريعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق ACE للأنواع الأخرى مشحونة من الأيونات المعدنية. بيد أن استخدام هذا الأسلوب لربط التجارب هو محدودة في قدرتها على تحديد عدد المواقع الملزمة. ومع ذلك، يمكن تكييفها مع المزيج من فريق الخبراء الاستشاري وايس لوصف سلوك ملزمة لأي عينة البروتين نحو يغاندس اتهم العديد.

Introduction

النباتات أكثر اعتماداً على بيئتها من العديد من أشكال الحياة الأخرى. إذ لا يمكن نقل النباتات إلى أماكن أخرى، لديهم للتكيف مع التغيرات في البيئة المحيطة بهم (مثلاً، الجفاف، البرد وارتفاع تركيزات الملح). ونتيجة لذلك، وضعت النباتات العليا البروتينات الإجهاد المتخصصة مثل ديهيدرينس، التي تفي بالمهام المتعددة للحد من التوتر الخلية تتصل بالملوحة العالية. هذه البروتينات ربط الماء والايونات داخل الخلايا، والحد من الأكسدة بربط Cu2 +-الأيونات، والتفاعل مع فوسفوليبيدات، فضلا عن سيتوسكيليتونس. وعلاوة على ذلك، ربط Zn2 +-الأيونات تسمح هذه البروتينات بمثابة عوامل النسخ. القدرة على ربط Ca2 +-الأيونات بعد الفسفرة كما تم الإبلاغ عن1.

سلوك متعدد الوظائف لهذه البروتينات يرتبط بعدم وجود مخلفات الأحماض الأمينية مسعور. وبالتالي فإنها تفتقر إلى أي التفاعلات مسعور داخل سلسلة الببتيد وبنية مقيدة أيضا. ومع ذلك، نظراً لأن هذه البروتينات تفتقر إلى هيكل تقييدية، التي يشغلونها كونفورميرس مختلفة تحت نفس الظروف. ولذلك، يمكن وصف أفضل كفرقة هياكل بدلاً من تكيف واحد. تعرف البروتينات بهذه الخصائص كما جوهريا اضطرابه البروتينات (داخليا) ومفهوم مستخدمة على نطاق واسع للبروتينات الإجهاد والحديث المتبادل بين مسارات مختلفة في الخلايا حقيقية النواة2.

واحد من هذه الأشخاص المشردين داخليا المتصلة بالإجهاد هو AtHIRD11. أنها واحدة من التمويل نباتشديدة الجفاف-أعرب معظم النازحين. ومن ثم، كونفورميرس مختلفة يمكن أن تكون مفصولة دائرة نصف قطرها فعالة لشحن نسبة، والتفريد الشعرية (CE) وقد استخدمت لإجراء مزيد من التحقيقات. آيس التجارب السابقة أثبتت التفاعلات بين AtHIRD11 وأيونات المعادن الانتقالية مثل Cu2 +Zn2 +-، Co2 +وني2 +-الأيونات. ويمكن الاطلاع على النتائج المفصلة في هارا et al. 3 وناخبار et al. 4.

تستند الطريقة آيس التي سيتم استخدامها هنا لدينا الأعمال المنشورة في وقت سابق6. ومع ذلك، إضافة اسيتانيليد علامة EOF إلى عينة البروتين ليست مناسبة. AtHIRD11 يعرض أنماط ذروة واسعة، وإضافة علامة EOF إلى العينة أن تخفي قمم اثنين. ولذلك، يتم استخدام العلامة في تشغيل منفصلة. قبل النظر في سلوك ملزمة، من المؤكد أن قمم عثر عليها خلال التجارب السابقة من كونفورميرس مختلفة. وهكذا، يستخدم فريق الخبراء الاستشاري للتمييز بين كونفورميرس البروتين، تعديل بوستترانسلاشونال البروتين والشوائب، مثل أجزاء من AtHIRD11، بكتلها مختلفة. وفي وقت لاحق، التحقيق في العينة AtHIRD11 يتسم سلوك ربط نحو مختلف الأيونات المعدنية المختلفة.

والغرض من هذه المقالة وصف إعداد تجريبية للتمييز بين المشردين داخليا والمكونات الأخرى من عينة من أجل تقييم الاختلافات في سلوك ملزمة كونفورميرس مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد الصكوك التفريد الشعرية

  1. إعداد الشعيرات الدموية
    1. استخدام قطع زجاج لقطع والسليكا تنصهر عارية الشعرية مع طلاء خارجي بوليميد وقطر داخلي ل 50 ميكرون إلى 33 سم (لتجربة فريق الخبراء الاستشاري) و 30 سم (للتجربة ACE) طويلة الشعيرات الدموية. إجراء القطع على طبق من زجاج.
      ملاحظة: وضعت 2 الأجهزة التجريبية المختلفة للصكوك المختلفة 2. بغية استخدامها في صكوك أخرى، قد نقل طريقة الصحيحة التي يتعين القيام بها وطول شعري إلى تعديل للطول المسموح به من الصك.
    2. استخدم قلم للاحتفال في منتصف نافذة الكشف واسعة 1 سم على مسافة من 24.5 سم من طرف واحد شعري لتجربة فريق الخبراء الاستشاري وفي 21.5 سم من نهاية واحد من الشعرية للتجربة آيس (الطول الفعال).
    3. إزالة الطلاء الخارجي بوليميد من الشعيرات الدموية بحرق مع موقد اللحام، 0.5 سم قبل وبعد العلامة. وبالمثل، استخدم في موقد اللحام لإزالة 1 سم للطلاء على كلا طرفي من الشعيرات الدموية.
      ملاحظة: طول الفعال قد تختلف بشكل طفيف حيث أنها تعتمد على الصك التفريد الشعرية المستخدمة.
    4. تنظيف نهايات الشعيرات الدموية ونوافذ الكشف مع الإيثانول وأنسجة لينة.
      ملاحظة: الشعيرات الدموية غير المصقول أقل مرونة ومن المرجح أن كسر.
  2. تثبيت الشعيرات الدموية
    1. تثبيت شعري في نظام CE مع نافذة الكشف عن قرب بالمأخذ.
      ملاحظة: مختلف نماذج صك CE قد نظم عقد مختلفة الشعيرات الدموية. أرجع إلى الدليل للأداة المستخدمة للتعليمات الدقيقة.

2-إعداد الحلول

  1. إعداد الحلول لتحليل فريق الخبراء الاستشاري
    1. إعداد أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) (تريس)-الحزب الديمقراطي الصربي المخزن المؤقت (mM/1% 100 w/v) في درجة الحموضة 8.0.
      1. استخدام قناع التنفس وكشك لوزن 1.00 g من دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي) في كوب 100 مل.
      2. إضافة ز 1.21 من تريس في الكأس 100 مل وحل استخدام 50 مل مياه وبار إثارة مغناطيسية على محرض مغناطيسية.
      3. وضع قطب درجة حموضة في الحل وضبط درجة الحموضة إلى 8.0 استخدام 1.0 M HCl.
      4. تعبئة الحل إلى قارورة حجمية 100 مل وإضافة المياه يصل إلى العلامة. اهتز برفق لتجنب أي تشكيل الرغوة.
    2. إعداد الحل هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
      1. وزن ز 4.0 من هيدروكسيد الصوديوم في قارورة حجمية 100 مل. ملء ما يصل إلى العلامة مع المياه لجعل مخزون 1 م.
      2. استخدام ماصة لمبة 10 مل لنقل 10 مل هذا الحل إلى قارورة حجمية 100 مل آخر وملء ما يصل إلى العلامة مع المياه..
    3. تعد حل HCl 0.1 متر.
      1. وضع 10 مل من 10 M HCl إلى قارورة حجمية 100 مل استخدام ماصة حجمية من 10 مل وملء ما يصل إلى العلامة مع المياه. كرر هذه الخطوة للحصول على HCl 0.1 متر.
    4. إعداد الحل عينة.
      1. وزن 0.5 ملغ البروتين في أنبوب 1 مل. إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت جل تريس-الحزب الديمقراطي الصربي من الخطوة 2.1.1 مع ميكروبيبيتي.
      2. حل البروتين التي تهز برفق لتجنب أي تشكيل الرغوة وتحلل البروتين.
        ملاحظة: استخدم ultrasonication إذا كان لا يمكن حله البروتين كما هو موضح؛ تجنب أي تدفئة للحل.
    5. تعبئة الحلول إلى قنينة.
      1. تصفية كل حل من خلال 0.22 ميكرومتر الفينيليدن الفلوريد (PVDF) التصفية باستخدام المحاقن كافية مباشرة إلى القنينة.
        ملاحظة: للحلول التي تحتوي على هلام، الضغط الخلفي يمكن أن تكون مرتفعة بسبب لها لزوجة عالية.
      2. إعداد قنينة 15 في المجموع وعلامة كل منها لتجنب أي ميكسوبس.
        1. ملء قنينات 3 مع صوديوم متاحة تجارياً دوديسيل كبريتات (SDS) جل المخزن مؤقت على درجة الحموضة 8.
          ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت جل المخزونات المتوفرة تجارياً يوفر نتائج أكثر دقة.
        2. ملء قنينة 1 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وقنينة 1 مع 0.1 M HCl للتنظيف.
        3. ملء قنينة 1 مع الحل عينة.
        4. تعبئة القنينات 5 مع المياه وقارورة 4 مع 0.1 مل مياه (غمس قارورة).
          ملاحظة: تستخدم القنينات غمس كقارورة النفايات أثناء التنظيف من الشعرية قبل كل تشغيل. هي انخفضت نهايات الشعيرات الدموية في الماء شطف أي مخلفات هلام.
  2. إعداد الحلول لتحليل آيس
    1. إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم 1 متر.
      1. وزن ز 4.0 من هيدروكسيد الصوديوم في قارورة حجمية 100 مل.
      2. ملء ما يصل إلى العلامة مع المياه لجعل مخزون 1 م.
    2. تحضير حمض اتهيلينديامينيتيتراسيتيك 0.1 M (يدتا) في محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M.
      1. نقل 10 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.1 في قارورة حجمي 100 مل استخدام ماصة لمبة 10 مل. ملء ما يصل إلى العلامة مع المياه.
      2. وزن ز 2.42 يدتا على متن قارب وزنها وحل المجمع الصلبة في 100 مل من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    3. إعداد الحل تريس المخزن المؤقت (30 مم).
      1. إضافة ز 3.63 من تريس، 200 مل من المياه، وبار ضجة في كوب 500 مل. ضع في الكأس على طبق من إثارة وتشغيله.
      2. وضع قطب مقياس الأس الهيدروجيني الكأس وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام 0.1 M HCl.
      3. تعبئة الحل في دورق حجمي 1 لتر وتعبئة ما يصل إلى العلامة بالمياه.
        ملاحظة: هذا الإجراء قد تتكرر أو حاجة دورق حجمي أكبر منذ أكثر من 1 لتر هناك حاجة لتحليل كامل.
    4. إعداد تدفق اليكتروسموتيك اسيتانيليد (EOF)-حل علامة (60 ميكرومتر).
      1. إضافة 6 مغ من اسيتانيليد و 100 مل من تريس المخزن المؤقت قارورة حجمية 100 مل.
      2. دورق حجمي في حمام الموجات فوق الصوتية وتشغيله لمدة 30 دقيقة.
    5. إعداد الحل عينة (1 ملغ/مل).
      1. وضع أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل على توازن دقة وإضافة 0.3 ملغ مسحوق AtHIRD11 المعصوفه في الأنبوب.
      2. استخدام ميكروبيبيتي لإضافة 0.3 مل من المخزن المؤقت تريس 30 مم (درجة الحموضة 7.4) في الأنبوب. هز الأنبوب بعناية لإذابة البروتين.
    6. إعداد الحلول يجند.
      1. إعداد الحل كاكل الأسهم2 (5 مم).
        1. تأخذ قارب وزنها ووضعها على توازن التحليلي وتزن ملغ 36.76 كاكل2* H2o.
        2. ميكروبيبيتي، باستخدام مسح كاكل2* ح2س من وزنها قارب في قارورة حجمي 50 مل مع المخزن المؤقت تريس المجهز سابقا.
        3. ملء قارورة الحجمي مع المخزن المؤقت تريس ما يصل إلى العلامة.
      2. إعداد الحلول الأسهم المتبقية (5 مم).
        1. كرر الخطوة 2.2.6.1 المعادن الأخرى باستخدام أملاح بدلاً من كاكل2* ح2س [مجكل2: 23.80 ملغ، BaCl2: ملغ 26.02, ريال (لا3)2: 52.91 ملغ، الحركة2: ملغ 31.46, سيكل4: 52.91 ملغ، كوكل 2* 2 ح2o: 41.47 ملغ، كوكل2* ح 22o: 42.62 ملغ، زنكل2: مغ 3.41 ونيكل2* o: 6 ح2ملغ 59.43].
          ملاحظة: قد حل2 زنكل بتركيز 0.5 مم. إذ لوحظ وجود تفاعلات قوية بين الأيونات والجدار الداخلي الشعرية، التركيز انخفض بمقدار 104.
      3. إعداد الحل2 كاكل 500 ميكرومتر.
        1. ملء 10 مل الحل الأسهم2 كاكل ووضعها في قارورة حجمية 100 مل.
        2. ملء قارورة الحجمي مع عازلة تريس إلى العلامة واهتز قارورة.
      4. إعداد الحل2 ميكرومتر 250 كاكل.
        1. ملء 5 مل الحل الأسهم2 كاكل ووضعها في قارورة حجمية 100 مل.
        2. ملء قارورة الحجمي مع عازلة تريس إلى العلامة واهتز قارورة.
      5. كرر الخطوتين 2.2.6.3 و 2.2.6.4 للحلول الأسهم الأخرى.
    7. ملء الحلول في القنينات.
      ملاحظة: كل التشغيل المتكرر يحتاج إلى مجموعة من قنينات مدخل ومخرج. يقلل استخدام الحلول يجند الطازجة في مداخل ومخارج التحولات في وقت الترحيل بعد كل تشغيل.
      1. ملء الحل2 ميكرومتر 250 كاكل في حقنه 10 مل.
      2. وضع مرشح PVDF ميكرومتر 0.22 المحاقن ودفع 2 مل الحل من خلال عامل التصفية باستخدام المحاقن لتجاهل هذا الحل الذي تم تصفيته.
      3. ملء قارورة 10 تصل إلى أقصى حجم مسموح به مع الحل2 كاكل 250 ميكرون المتبقية من المحاقن. وضع علامة على كل ك 250 ميكرون كاكل 2 حل مدخل قنينة.
      4. ملء قارورة 10 حتى تكون مملوءة نصف مع 250 ميكرون كاكل2 الحل. وضع علامة على كل ك 250 ميكرون كاكل 2 الحل مأخذ قنينة.
      5. كرر الخطوات 2.2.7.1-2.2.7.4 للحلول التي تحتوي على الملح المعدنية الأخرى.
      6. كرر الخطوات لكل زوج من قنينات مدخل ومخرج 30 ملم من تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) الحل باستخدام بدلاً من ذلك.
        ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت الهيدروجيني 7.4 تريس 30 ملمول/لتر بين يمتد من أجل الحصول على بيانات الوقت الهجرة للبروتين في حالة عدم وجود أيونات المعادن. من الضروري من أجل إهمال التغييرات في EOF.
      7. كرر الخطوات المذكورة أعلاه لقنينة واحدة بدلاً من ذلك باستخدام اسيتانيليد علامة EOF (60 ميكرومتر) الحل. أيضا، كرر هذه الخطوات باستخدام الحل عينة (1 ملغ/مل) بدلاً من ذلك.

3-الفصل شعري جل الغرواني الكهربي

ملاحظة: إعداد الفصل وفقا للطريقة الموضحة في الأعمال السابقة التي ناخبار et al. 4.

  1. إعداد التحليل
    1. شرط شعري
      1. تعيين الحرارة إلى 23 درجة مئوية.
      2. تدفق شعري لمدة 10 دقيقة في بار 2.5 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
      3. مسح شعري لمدة 5 دقائق في شريط 2.0 مع 0.1 M HCl.
      4. تدفق شعري لمدة 2 دقيقة في بار 2.0 مع المياه.
    2. ملء المخزن المؤقت جل مخزونات النشر الاستراتيجي
      1. ملء شعري لمدة 10 دقيقة في بار 2.0 مع المخزن المؤقت جل مخزونات النشر الاستراتيجي متاحة تجارياً في pH 8.0.
    3. تدفق شعري قبل تشغيل كل فصل
      1. مسح شعري لمدة 3 دقيقة في بار 4.0 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
      2. تدفق شعري لمدة 1 دقيقة في بار 4.0 مع 0.1 M HCl.
      3. تدفق شعري لمدة 1 دقيقة في بار 4.0 مع المياه.
      4. تدفق شعري لمدة 10 دقيقة في بار 4.0 مع المخزن المؤقت جل الحزب الديمقراطي الصربي.
  2. تشغيل الفصل
    1. حقن الحل عينة لتجارب فريق الخبراء الاستشاري (الخطوة 2.1.4) هيدروديناميكالي عن طريق تطبيق 0.1 بار لمدة 4 دقائق في المدخل.
    2. تطبيق-16.5 كيلو فولت وضغط من شريط 2.0 في كلا طرفي شعري لمدة 25 دقيقة.

4-تقارب تحليل الغرواني الكهربي الشعرية

ملاحظة: إعداد الفصل وفقا للطريقة الموضحة في الأعمال السابقة التي ناخبار et al. 4 والحازمي et al. 5.

  1. شرط شعري
    1. تعيين الحرارة إلى 23 درجة مئوية.
      ملاحظة: درجة حرارة يتم استخدامها وفقا للبروتوكولات المنشورة ويمكن تغييره إلى غيرها من درجات الحرارة54،. ومع ذلك، التفاعلات تعتمد على درجة الحرارة وستتغير تبعاً لذلك.
    2. مسح شعري لمدة 40 دقيقة في بار 2.5 مع 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم.
    3. تدفق شعري لمدة 10 دقيقة في شريط 1.0 مع المياه.
    4. تدفق شعري لمدة 30 دقيقة في شريط 1.0 مع عازلة تريس 30 مم (درجة الحموضة 7.4).
  2. إعداد أساليب آيس
    1. إعداد الأسلوب للقياسات دون يغاندس.
      ملاحظة: اسيتانيليد لم يتم إضافة إلى الحل العينة، كما أنها تخفي 2 بروتين قمم.
      1. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع حل يدتا 0.1 متر.
      2. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع المياه.
      3. أشطف شعري لمدة دقيقة 1.5 2.5 بار مع عازلة تريس للموازنة.
      4. حقن الحل اسيتانيليد 6 s في شريط 0.05 وتغيير المدخل وقنينات منفذاً للقنينات المخزن المؤقت تريس.
      5. تطبيق شريط 0.05 ل 2.4 s من أجل دفع الحل اسيتانيليد من غيض الداخل المزيد الشعرية.
      6. تطبيق 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق والكشف عن ذروة اسيتانيليد في موجه 200 نانومتر.
      7. كرر الخطوات 4.2.1.1. -4.2.1.6. البروتين باستخدام عينة بدلاً من الحل اسيتانيليد والكشف عن جميع قمم البروتين.
    2. إعداد الأسلوب للقياسات مع يغاندس.
      1. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع حل يدتا 0.1 متر.
      2. أشطف شعري لمدة 1 دقيقة في بار 2.5 مع المياه.
      3. أشطف شعري لمدة دقيقة 1.5 2.5 بار مع الحل يجند للموازنة.
      4. حقن الحل اسيتانيليد 6 s في شريط 0.05 وتغيير المدخل وقنينات منفذاً للقنينات العازلة التي تحتوي على [ليغند].
      5. تطبيق شريط 0.05 ل 2.4 s من أجل دفع الحل اسيتانيليد من غيض الداخل المزيد الشعرية.
      6. تطبيق 10.0 كيلو فولت لمدة 6 دقائق والكشف عن ذروة اسيتانيليد في موجه 200 نانومتر.
      7. كرر الخطوات 4.2.2.1-4.2.2.6 استخدام العينة البروتين بدلاً من الحل اسيتانيليد والكشف عن جميع قمم البروتين.
    3. بدلاً من ذلك كرر الخطوات 4.2.1 و 4.2.2 لحساب التغير في نسب حجم الشحنة لتفاعلات أيون البروتين-المعادن المختلفة (وصف إطار النتائج الممثل).
      1. تغيير الحل البروتين بعد كل ح 60 إلى واحد جديد.
        ملاحظة: عند هذه النقطة، التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً. هذا الإجراء هو المتكررة على الأقل 10 x لكل تركيز من يغاندس نظراً لنمط الذروة يختلف قليلاً من التشغيل إلى التشغيل. إذا كان يتم استخدام الحل أطول من ح 60، تصبح الاختلافات كبيرة جداً.
    4. تشغيل الأساليب
      1. تشغيل الأسلوب الموصوفة في إطار خطوة 4-2-2، باستخدام حلول يجند الأرض القلوية (كاكل2، مجكل2، BaCl2، وحلول2 سركل).
      2. الاستمرار في استخدام الطريقة الموضحة أسفل الخطوة 4-2-2، استخدام الحركة2وسيكل4، كوكل2، كوكل2، زنكل2، وحلول2 نيكل بدلاً من الحلول يجند الأرض القلوية.
        ملاحظة: كلوريدات المعادن الانتقالية الأخيرة أظهرت تفاعل أقوى مع شعري ولا يمكن إزالتها تماما. هذه نتيجة التفاعلات في التحولات في وقت الترحيل من التشغيل إلى التشغيل. ونتيجة لذلك، أنهم للتحقيق بعد الأيونات المعدنية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 1 اليكتروفيروجرام AtHIRD11 العينة التي تم الحصول عليها أثناء تجارب فريق الخبراء الاستشاري. زيادة حجم الببتيد من اليسار إلى اليمين. العدد الأقصى 4 كتلة أكبر، ويشير إلى البروتين سليمة. على قمم أصغر 2 و 3 تمثل الشوائب الأصغر حجماً (مثل، منتجات التحلل). كما يمكن أن تستنسخ الذروة الأولى وعدم الاتساق في الأساس قبل دون العينة البروتين. ولذلك، وهو يتصل بالحزب الديمقراطي الصربي هلام نفسها ولا تمثل أي الشوائب المرتبطة بعينه.

ويمثل الرقم 2 اليكتروفيروجرام اسيتانيليد أثناء تجارب الأس. الحل اسيتانيليد يظهر فقط 1 ذروة عالية نظراً لأنه ينبغي أن يكون لا من الشوائب. الكشف عن وقت الذروة القصوى تشير إلى وقت الترحيل من تدفق اليكتروسموتيك (تيEOF) ويستخدم لحساب التفاعل.

الرقم 3 هو اليكتروفيروجرام عينة AtHIRD11 أثناء التجربة الأس في غياب الحزب الديمقراطي الصربي والايونات المعدنية. أنه يظهر، بالإضافة إلى الشوائب 2 من اليكتروفيروجرام فريق الخبراء الاستشاري، على الأقل 5 القمم التي تتصل بالبروتين نفسه. يمكن تعيين الذروة 1 و 2 للشوائب منذ أوقات الهجرة الخاصة بهم تشير إلى أنها صغيرة أو مشحونة بصورة إيجابية جداً. هذا الافتراض تدعمه زيادة ارتفاع الذروة والمنطقة على مر الزمن. منذ قمم AtHIRD11 3 و 4 بالقرب من الفولكلوري، لا يكاد يتوجب ولا يمكن فصلها في كل تشغيل. أنها تقريبا إظهار لا تفاعلات وتمثل والتشكلات دون بقايا موجوداً أساسيا للتفاعل مع الأيونات المعدنية. ويبين AtHIRD11 عدة رسوم-إلى-الحجم-نسب مختلفة نظراً لإنصاف أقطار فعالة مختلفة من كونفورميرس مختلفة. ويمكن دمج هذه كونفورميرس بشكل مستمر. وفي وقت لاحق، قمم 5-7 أوسع نطاقا من قمم البروتين المعتادة. على قمم واسع تعطي تلميحاً في حركية التفاعلات. القمم ليست ضيقة، يمكن استبعاد سريع وتحويل بطيء جداً بين كونفورميرس مختلفة. وفي كلتا الحالتين، سيكون على قمم مفصولة بخط الأساس4. في هذه الحالة، يمكن تغيير نمط الذروة خطوة ما قبل الموازنة وتعطي رؤية أفضل للتفاعلات مع حركية أبطأ.

ويبين الشكل 4 تقييم رسومية من وقت الترحيل قياس التحولات حضور مختلف الأيونات المعدنية لذروة 6. يتم تمثيله بواسطة ΔR/Rوالقيمة المحسوبة. تشير هذه القيمة إلى مدى قوة تحول (بقيمته) والتغيير الشامل مقابل مجمعات أيون البروتين-المعادن (التي لها علامة). من أجل التفريق بين وجود تفاعل كبير وتحول مصادفة، فترات الثقة ل α = 0.05 تحسب كذلك. في الحالات حيث فاصل الثقة هو عدم التقاطع مع خط الصفر، ويعتبر التفاعل كبيرة. نتائج تؤخذ في الاعتبار إذا كانت الذروة كان حاضرا في مالا يقل عن 6 من أصل 10 اليكتروفيروجرامس. ذروة 6 لم تكن موجودة في أي تشغيل مع 500 ميكرومتر Co2 +. وتنشر القائمة الكاملة للتفاعلات لكل ذروة AtHIRD11 في عمل سابق ناخبار et al. 4.

ΔR/Rو يحسب باستخدام نسب وقت الهجرة Rأنا (بحضور [ليغند]) ونسب وقت الهجرة Rو (في غياب يجند):

Equation 1

Rأنا و Rو يتم حسابها باستخدام مرات أعلى ذروة تيالبروتين على قمم عينة البروتين والوقت أعلى ذروة المقابل لعلامة EOF تيالفولكلوري:

Equation 2

البحث والتطويروأنا، الأوقات حضور يجند المستخدمة Rوالأوقات في غياب.

Figure 1
الشكل 1 : اليكتروفيروجرام لفريق الخبراء الاستشاري فصل العينة AtHIRD11 في المخزن المؤقت لجل. يمكن ملاحظة الذروة 1 والقمم على اليسار حتى بدون حقن عينة، حيث تكون المصنوعات اليدوية. منذ الجماهير، وعموما أقل من ذروة 4 مجالات ذروة الذروة 2 و 3، فهي الشوائب المحتملة، مثل منتجات التحلل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : اليكتروفيروجرام اسيتانيليد علامة EOF تشغيل- ويوضح الشكل ذروة 1 فقط للمجمع دون أي الأيونات المعدنية والحزب الديمقراطي الصربي جل المخزن المؤقت. ويصادف وقت أعلى ذروة تدفق اليكتروسموتيك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : مثال اليكتروفيروجرام الفصل عينة أثناء تجارب آيس عرض نمط ذروة معقدة في غياب أي الأيونات المعدنية. يمكن التعرف على قمم 7 على الأقل والمتعلقة بالبروتين وبه شوائب 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : التقييم رسومية لسلوك ملزمة تجاه الأيونات المعدنية التحقيق باستخدام تركيز 500 ميكرومتر لذروة 6- قيم ΔR/Rو يعطي إشارة على كثافة الهجرة وقت التحويل، وبالتالي قوة التغييرات كونفورماشونال في ربط أيون معدني. علامة ΔR/Rو تشير إلى إذا كان المجمع أكثر سلبا أو إيجاباً مكلفة مقارنة بالبروتين غير منضم. أشرطة الخطأ تشير إلى فترات الثقة ل α = 0.05. وفي وقت لاحق، أنها تظهر المنطقة حيث الحقيقية ΔR/Rويمكن العثور على قيمة مع يقين بنسبة 95%. أشرطة حمراء تشير إلى النتائج المحسوبة التي حصل عليها بيانات غير كافية (الذروة كان حاضرا في اليكتروفيروجرامس أقل من 6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لجميع CE التجارب، إعداد الشعرية خطوة حاسمة. أنها أنبوب زجاج يبلغ قطرها صغير، فإنه يمكن بسهولة كسر في المواقع حيث يتم إزالة الطلاء عند فإنه يتم معالجة. وينبغي أن يتم التثبيت شعري في الصك بعناية فائقة.

الخطوات الأساسية المتضمنة في استخدام أسلوب آيس أساسا تتعلق بالإعداد التجريبية. خطوة حاسمة أخرى هي إيجاد المعلمات حقن عينة اليمنى. حقن كمية العينة قد يكون كافياً للقمم العالية. بيد التحميل الزائد لأنه سيسفر نمط ذروة حل سيئة مع تداخل قمم. عند تناقص حجم المحقون، من المستحسن أن ينخفض ضغط الحقن بدلاً من وقت حقن نظراً لأنه يحتاج إلى بعض الوقت لهذه الوسيلة للوصول إلى ضغط الحقن المبرمجة.

يمكن الاطلاع على قمم واسعة على نحو غير عادي لعينات مختلفة من البروتين. هذا النمط يمكن أن يتأثر بزيادة الجهد. ونتيجة لذلك، الحصول على القمم أضيق ويتم تقليل الوقت الفاصل. على الرغم من ذلك، يمكن أن يؤدي الوقت الفاصل أقصر في قمم عدم حلها والجهد العالي يزيد الجول تدفئة ويحد من تأثير قمم ضيقة تشتت الغرواني الكهربي7،8. ولذلك، الظروف الصحيحة يجب أن تحدد لكل البروتينات الجديدة بحثت.

الجمع بين فريق الخبراء الاستشاري وايس لجمع معلومات حول الحرف اضطرابه جوهريا من بروتين وسلوكها ملزمة اتباع نهج جديد. وصف العينة بالتفريد جل خطوة ضرورية لإثبات أن أي قمم متعددة ولاحظ لا تتصل بالشوائب. الميزة لفريق الخبراء الاستشاري هو إمكانية أتمتة، وقت إعداد أقصر، ودقة أعلى مقارنة ب التفريد الكلاسيكي جل9. استخدام ACE للمشردين داخليا ملزم يبين تجارب تفوقها نحو فحوصات أخرى (مثلاً، معطلة اللوني معدنية تقارب في النتائج) منذ آيس ليس فقط يبين ربط أحداث. وعلاوة على ذلك، فإنه يفصل بين كونفورميرس مختلفة من البروتين ويمكن أن تكشف عن الاختلافات في يغاندس ملزم من كونفورميرس المتنوعة. هذا السلوك لا يمكن الكشف عنها بالطرق دون فصل خلال التجربة ملزم. وبالإضافة إلى ذلك، وقت التحليل فقط 6 دقيقة؛ ولذلك، يمكن حساب النتائج في فترة قصيرة من الوقت10. من ناحية أخرى، يأتي تحليل سريع مع القيود في تقدير عدد المواقع11ملزمة.

مستقبل هذا النهج تكمن في إمكانية الشاشة الشركاء ملزمة المحتملة للبروتينات، ولا سيما الأشخاص المشردين داخليا، بطريقة سريعة. أنه يعطي لمحة سريعة عن سلوك ربط مختلف كونفورميرس مختلفة موجودة في عينة. استخدام الفصل تعتمد على الحجم (مثلاً، فريق الخبراء الاستشاري) لوصف العينة إلزامي منذ الأس نفسه لا يميز بين الشوائب والبروتين نفسه. إلا أن فريق الخبراء الاستشاري يعطي فكرة عن عدد الأنواع المختلفة الحجم. تم تمديد تطبيق ACE بمقايسة ملزمة الفعل من يغاندس أيون معدني ل يجند مشحونة أي12. ولذلك، تستطيع أن تضيف معلومات إضافية حول التفاعلات أي تتميز ملزمة، منذ أن الجمع بين الفصل والمقايسة ملزمة في طريقة واحدة يمكن أن تعطي أدلة على أي سلوك ربط غيرت من كونفورميرس مختلفة و بوسترانسلاشونال من تعديلات، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نشكر الامتنان هارا ماساكوزا (معهد البحوث للعلوم الخضراء والتكنولوجيا، وجامعة شيزوكا، اليابان) لتوفير عينات البروتين AtHIRD11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

الكيمياء الحيوية، 138 قضية، والبروتينات اضطرابه جوهريا، تقارب التفريد الشعرية، التفريد جل الشعرية، ملزمة المقايسة، يغاندس معدنية، ديهيدرينس، AtHIRD11
تحليل AtHIRD11 اضطرابات جوهرية وملزمة تجاه أيونات المعادن بالتفريد جل الشعرية وتقارب التفريد الشعرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter