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Biochemistry

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

이 프로토콜 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 모 세관 젤 전기 이동 법 및 충전된 ligands에 대 한 빠른 바인딩 심사를 단백질 샘플의 특성을 결합합니다. 그것은 본질적으로 무질서 단백질 등 유연한 구조를 가진 단백질에 대 한 다른 conformers에 대 한 바인딩 차이 확인 하려면 권장.

Abstract

식물은 강하게 그들의 환경에 따라 달라 집니다. 스트레스 변화 (예:가뭄, 높은 염 분)을 조정 하기 위하여 더 높은 식물 진화 산화 및 삼투성 스트레스를 줄이기 위해 본질적으로 무질서 단백질 (IDPs)의 클래스. 이 문서는 애기 thaliana에서 IDP AtHIRD11의 다른 conformers의 바인딩 동작을 설명 하기 위해 모 세관 젤 전기 이동 법 (CGE)와 이동성 교대 선호도 전기 이동 법 (ACE)를 사용 합니다. CGE는 AtHIRD11의 순도 확인 하 고 복잡 한 피크 패턴에 대 한 이유로 서 조각, posttranslational 수정 및 기타 불순물을 제외 하는 데 사용 됩니다. 실험의이 부분에서 다른 샘플 구성 요소는 그들의 다른 대 중에 의해 모 세관 내부 점성 젤으로 구분 하 고 다이오드 배열 검출기 감지. 그 후, 다양 한 금속 이온으로 샘플의 바인딩 동작은 에이스에 의해 조사 하 고 있다. 이 경우에 ligand 버퍼 솔루션에 추가 되 고 마이그레이션 시간에 변화 여부 바인딩 이벤트 발생 여부를 결정 하기 위하여 측정 된다. CGE와 에이스의 조합 IDP의 바인딩 동작을 사용 하 여의 장점 중 하나는 젤 전기 이동 법 및 바인딩 분석 결과를 자동화 가능성입니다. 또한, CGE 고전 젤 전기 이동 법 보다 탐지의 하한값을 보여줍니다 이며 에이스 빠른 방법에 있는 ligand 바인딩 방식으로 확인할 수 있습니다. 또한, 에이스 금속 이온 보다 다른 청구 종에도 적용할 수 있습니다. 그러나, 실험 바인딩에 대 한이 메서드를 사용 하 여 바인딩 사이트 수를 결정 하는 기능에 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, CGE와 에이스의 조합 다 충전된 ligands 향해 어떤 단백질 샘플의 바인딩 동작을 특성화에 대 한 적응 될 수 있다.

Introduction

식물은 다른 많은 생명체 보다 자신의 환경에 더 의존. 때문에 식물은 다른 곳으로 이동할 수 없습니다, 그들은 변화 (예를 들면, 가뭄, 추위와 높은 소금 농도) 그들의 주위에 있다. 따라서, 더 높은 식물 dehydrins, 높은 염 분에 관련 된 세포 스트레스를 줄이기 위해 다양 한 작업을 수행 같은 전문된 스트레스 단백질을 개발 했다. 이 단백질 셀 안에 물과 이온 바인딩, 바인딩 Cu2 +로 산화 스트레스를 감소-이온, 인지질으로는 cytoskeletons와 상호 작용 하는 고. 또한, 바인딩 Zn2 +-이온이이 단백질 녹음 방송 요인의 역할을 수 있습니다. 그들의 능력을 바인딩할 캘리포니아2 +-이온 인 산화 또한 후 보고1.

이 단백질의 다기능 동작 소수 성 아미노산 잔류물의 부재와 관련이 있습니다. 따라서, 그들은 부족 펩 티 드 사슬 및 또한 제한 구조 내부의 소수 성 상호 작용. 그러나, 이러한 단백질 부족 제한적인 구조, 때문에 그들은 동일한 조건 하에서 다른 conformers 차지할 수 있습니다. 따라서, 그들은 설명할 수 있습니다 최고의 단일 구조 아니라 구조의 앙상블. 이러한 속성 가진 단백질 단백질 (IDPs) 본질적으로 무질서 하 고 스트레스 단백질 및 진 핵 세포2다른 통로 사이 누화에 대 한 널리 사용 되는 개념으로 알려져 있다.

이러한 스트레스 관련 IDPs 중 하나는 AtHIRD11입니다. 그것은 대부분 매우 가뭄 표현 IDPs 애기 thaliana중 하나입니다. 따라서, 다른 conformers 충전 비율, 그들의 효과적인 반경으로 분리 될 수 있다 그리고 모 세관 전기 이동 법 (세 륨) 추가 수사를 위해 사용 되었습니다. 이전 에이스 실험 AtHIRD11와 Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +및 Ni2 +같은 전이 금속 이온 간의 상호 작용을 시연-이온. 하 라 외 에 상세한 결과 찾을 수 있습니다. 3 그리고 Nachbar 외. 4.

에이스 메서드를 여기에서 사용 될 것입니다 우리의 이전 저서6을 기반으로 합니다. 그러나, 단백질 견본을 EOF 표식 acetanilide 추가 적합 하지 않습니다. AtHIRD11 넓은 피크 패턴을 표시 하 고 두 봉우리를 위장 것 샘플에 EOF 표식 추가. 따라서, 표시자는 별도 실행에 사용 됩니다. 바인딩 동작을 검사 하기 전에 그것에서 다른 conformers 이전 실험 중에 발견 하는 봉우리는 확인 된다. 따라서, CGE는 단백질 conformers 사이 구별 하는 데 사용 됩니다는 포스트 번역 상 수정 단백질, 및 그들의 다른 대 중에 의해 AtHIRD11의 조각 같은 불순물. 그 후, 다양 한 다른 금속 이온으로 특징이 AtHIRD11 샘플의 바인딩 동작 조사 이다.

이 문서의 목적은 다른 conformers의 바인딩 동작에 차이 평가 하기 위해 IDP와 샘플의 다른 구성 요소를 구분 하는 실험 설치를 설명 하는 것입니다.

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Protocol

1입니다. 모 세관 전기 이동 법 장비의 준비

  1. 모세를 준비
    1. 유리 커터를 사용 하 여 잘라 베어-융합 된 실리 카 폴 외부 코팅 및 50 µ m의 내부 직경 모 세관 (CGE 실험)에 대 한 33 cm과 30 cm (에이스 실험)에 대 한 긴 모세 혈관. 유리 접시에 절단을 수행 합니다.
      참고: 2 다른 실험 설정 2 가지 악기에 대 한 개발 되었다. 을 다른 악기에 그들을 사용 하려면 적절 한 방법을 전송 수행할 수 있다 고 모 세관 길이 악기의 허용된 길이를 조정할 수 있다.
    2. 펜을 사용 하 여 ACE 실험 (효과적인 길이)에 대 한 세관의 한쪽 끝에서 21.5 cm에서 1 cm 넓은 탐지 창 CGE 실험에 대 한 세관의 한쪽 끝에서 24.5 cm의 거리에서의 중앙을 표시.
    3. 횃불, 0.5 cm 마크 전후와 레코딩에 의해 모세 혈관에서 구체의 외부 코팅을 제거 합니다. 마찬가지로, 모세의 양 끝에서 코팅의 1 cm를 제거 하는 횃불을 사용 합니다.
      참고: 효과적인 길이 달라질 수 있습니다 약간 이후 사용 하는 모 세관 전기 이동 법 악기에 의존.
    4. 에탄올과 부드러운 조직 검색 창과 모 세관의 끝 청소.
      참고: 비 코팅된 모세 혈관은 덜 유연 하 고 휴식을.
  2. 모 세관을 설치
    1. 콘센트 근처 검색 창 CE 시스템에는 모 세관을 설치 합니다.
      참고: 다양 한 CE 악기 모델은 모세 혈관에 대 한 다른 지주 시스템이 있다. 대 한 정확한 지침은 사용된 악기의 설명서를 참조 하십시오.

2. 준비 된 솔루션

  1. CGE 분석에 대 한 솔루션을 준비
    1. 트리 스 (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 준비-pH 8.0에서 SDS 버퍼 (100 mM/1% w/v).
      1. 호흡 마스크와 부스를 사용 하 여 100 mL 비 커에 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 1.00 g 무게에 대 한.
      2. 100 mL 비 커에 트리 스의 1.21 g를 추가 하 고는 자력에 이온된 물 50 mL 및 자석 저 어 막대를 사용 하 여 해산.
      3. 솔루션에 pH 전극을 넣고 8.0 1.0 M HCl을 사용 하 여 pH를 조정.
      4. 100ml 부피 플라스 크에 솔루션을 이온된 수 표까지 추가. 어떤 거품 형성을 피하기 위해 부드럽게 그것을 흔들어.
    2. 0.1 M NaOH 솔루션을 준비 합니다.
      1. 100ml 부피 플라스 크에 NaOH의 4.0 g 무게. 표까지 1 M 주식을 이온된 수로 그것을 채우십시오.
      2. 10 mL 전구 피 펫을 사용 하 여 다른 100 mL 부피 플라스 크에 10 mL이이 솔루션의 전송 하 고 이온을 제거 된 물으로 표까지 작성.
    3. 0.1 M HCl 솔루션을 준비 합니다.
      1. 10 M HCl의 10 mL를 100 mL 부피 플라스 크 10ml 부피 피 펫을 사용 하 여 투입 하 고 이온을 제거 된 물으로 표까지 작성. 0.1 M HCl을 얻기 위해이 단계를 반복 합니다.
    4. 샘플 솔루션을 준비 합니다.
      1. 1 mL 튜브에 단백질의 0.5 밀리 그램 무게. micropipette 2.1.1 단계에서 트리 스-SDS 젤 버퍼의 0.5 mL를 추가 합니다.
      2. 어떤 거품 형성 및 단백질의 저하를 피하기 위해 부드럽게 흔들어 단백질 분해.
        참고: 사용 ultrasonication 단백질 설명; 해산 될 수 없다 솔루션의 모든 난방을 하지 마십시오.
    5. 튜브에는 솔루션을 작성.
      1. 0.22 μ m polyvinylidene 불 소 (PVDF) 유리병에 직접 적절 한 주사기를 사용 하 여 필터링을 통해 각 솔루션을 필터링 합니다.
        참고: 젤 포함 된 솔루션에 대 한 역 압력 높을 수 있다 그것의 높은 점도 때문.
      2. 총에서 15 병을 준비 하 고 어떤 에러를 피하기 위해 각각을 표시 합니다.
        1. 3 튜브를 pH 8에서 상용 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 젤 버퍼에 채워 넣어 라.
          참고: 상용 SDS 젤 버퍼를 사용 하 여 더 정확한 결과를 제공합니다.
        2. 홍 조에 대 한 0.1 M NaOH와 0.1 M HCl과 1 유리병 1 유리병을 작성.
        3. 샘플 솔루션 1 유리병을 채우십시오.
        4. 이온된 수, 이온된 수 (튜브 찍기)의 0.1 mL와 4 튜브로 5 튜브를 채우십시오.
          참고: 수영 튜브 각 실행 전에 모 세관의 홍 조 중 폐기물 튜브로 사용 됩니다. 모 세관 끝 물에 어떤 젤 잔류물을 씻어 위해 감소 됩니다.
  2. 에이스 분석에 대 한 솔루션을 준비
    1. 1 M NaOH 솔루션을 준비 합니다.
      1. 100ml 부피 플라스 크에 NaOH의 4.0 g 무게.
      2. 표까지 1 M 주식을 이온된 수로 그것을 채우십시오.
    2. 0.1 M NaOH 솔루션에서 0.1 M ethylendiaminetetraacetic 산 (EDTA)를 준비 합니다.
      1. 10 mL 전구 피 펫을 사용 하 여 100 mL 부피 플라스 크에 0.1 M NaOH의 10 mL를 전송 합니다. 이온된 물으로 표까지 그것을 채우십시오.
      2. 그리고 무게 보트에 EDTA의 2.42 g 무게 0.1 M NaOH의 100 mL에 고체 화합물을 분해.
    3. Tris 버퍼 (30mm) 솔루션을 준비 합니다.
      1. 500 mL 비 커에 트라이앵글, 3.63 g의 이온을 제거 된 물, 그리고 저 어 바 200 mL를 추가 합니다. 비 커를 저 어 접시에 놓고 스위치를 합니다.
      2. PH 미터 전극을 비 커에 넣고 pH 7.4 0.1 M HCl을 사용 하 여를 조정.
      3. 이온된 물으로 1l 부피 플라스 크에 표까지 채우기 솔루션을 채우십시오.
        참고:이 절차는 반복 또는 더 큰 부피 플라스 크 1l 이상이 전체 분석 필요 필요 하다.
    4. Acetanilide electroosmotic 교류 (EOF) 준비-마커 (60 µ M) 솔루션.
      1. 100ml 부피 플라스 크에 6 mg acetanilide와 Tris 버퍼의 100 mL를 추가 합니다.
      2. 초음파 목욕에서 부피 플라스 크를 넣고 30 분 동안 그것을 전환.
    5. 샘플 (1 mg/mL) 솔루션을 준비 합니다.
      1. 정밀 균형에 0.5 mL microcentrifuge 튜브를 넣고 튜브에 동결된 AtHIRD11 분말의 0.3 mg을 추가.
      2. micropipette를 사용 하 여 30 mM Tris 버퍼 (pH 7.4)의 0.3 mL 튜브에 추가. 단백질을 분해 하는 신중 하 게 튜브를 흔들어.
    6. Ligand 솔루션을 준비 합니다.
      1. CaCl2 (5mm) 재고 솔루션을 준비 합니다.
        1. 무게 배, 분석 균형에 넣고 무게 CaCl236.76 mg * H2o.
        2. CaCl2플러시 micropipette를 사용 하 여 * H2O는 무게에서 이전 준비 Tris 버퍼 50ml 부피 플라스 크에 보트.
        3. 부피 측정 플라스 크는 마크까지 Tris 버퍼 채우십시오.
      2. 나머지 재고 솔루션 (5mm)를 준비 합니다.
        1. 반복 단계 다른 금속을 사용 하 여 2.2.6.1 CaCl2대신 소금 * H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, 엔지니어링4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2소개할 41.47 mg, CuCl2* 2 H2소개할 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg, 및 NiCl2* 6 H2소개할 59.43 mg].
          참고: ZnCl2 솔루션은 0.5 m m의 농도. 농도 10의 요인에 의해 감소 되었다 이온 및 모 세관 내벽 사이의 강한 상호 작용 관찰 했다, 이후4.
      3. 500 µ M CaCl2 솔루션을 준비 합니다.
        1. CaCl2 재고 솔루션의 10 mL를 100 mL 부피 플라스 크에 넣어.
        2. 부피 측정 플라스 크 마크 Tris 버퍼를 플라스 크를 흔들어 있습니다.
      4. 250 µ M CaCl2 솔루션을 준비 합니다.
        1. CaCl2 재고 솔루션의 5 mL를 100 mL 부피 플라스 크에 넣어.
        2. 부피 측정 플라스 크 마크 Tris 버퍼를 플라스 크를 흔들어 있습니다.
      5. 다른 재고 솔루션 2.2.6.3-2.2.6.4 단계를 반복 합니다.
    7. 튜브에서 솔루션을 작성 합니다.
      참고: 모든 반복된 실행 입구 및 출구 튜브 집합이 필요합니다. 입구와 출구에서 신선한 ligand 솔루션의 사용 각 실행 후 마이그레이션 시간에 교대를 감소 시킨다.
      1. 10 mL 주사기에 250 µ M CaCl2 솔루션을 작성 합니다.
      2. 위에 0.22 μ m PVDF 필터 주사기와 푸시 솔루션의 2 mL 주사기를 사용 하 여이 필터링된 솔루션을 삭제 하는 필터를 통해.
      3. 최대 허용된 볼륨까지 10 튜브 주사기의 나머지 250 µ M CaCl2 솔루션을 채우십시오. 250 µ M CaCl 2 솔루션 입구 유리병으로 각각 표시 합니다.
      4. 될 때까지 250 µ M CaCl2 솔루션으로 반 가득 10 튜브를 입력 합니다. 250 µ M CaCl 2 솔루션 콘센트 유리병으로 각각 표시 합니다.
      5. 솔루션에 대 한 다른 금속 포함 하는 소금 2.2.7.4 2.2.7.1-단계 반복 합니다.
      6. 대신 30 mM Tris 버퍼 (pH 7.4) 솔루션을 사용 하 여 입구와 출구 튜브의 모든 쌍에 대 한 단계를 반복 합니다.
        참고: 30 mmol/L Tris 버퍼 pH 7.4 실행 사이 금속 이온의 부재에는 단백질에 대 한 마이그레이션 시간 데이터를 얻기 위해 사용 됩니다. EOF에 변화를 무시 하기 위해 필요 하다.
      7. 한 유리병 대신 acetanilide EOF 표식 (60 µ M) 솔루션을 사용 하 여 위의 단계를 반복 합니다. 또한, 대신 샘플 (1 mg/mL) 솔루션을 사용 하 여 이러한 단계를 반복 합니다.

3. 모 세관 젤 전기 이동 별거

참고: 준비 Nachbar 외 에 의해 이전 작업에서 설명한 방법에 따라 분리 4.

  1. 분석 준비
    1. 상태는 모 세관
      1. 23 ° c 온도 설정
      2. 0.1 M NaOH와 2.5 바에서 10 분 동안 모 세관을 플러시.
      3. 0.1 M HCl와 2.0 바에서 5 분 동안 모 세관을 플러시.
      4. 이온을 제거 된 물으로 2.0 바에서 2 분 동안 모 세관을 플러시.
    2. SDS 젤 버퍼 채우기
      1. PH 8.0에 상용 SDS 젤 버퍼에 2.0 바에서 10 분 동안 모 세관을 채우십시오.
    3. 각 분리 실행 전에 모 세관을 플러시
      1. 0.1 M NaOH와 4.0 바에서 3 분 모 세관을 플러시.
      2. 0.1 M HCl로 4.0 바에서 1 분 동안 모 세관을 플러시.
      3. 4.0 바 이온을 제거 된 물에서 1 분 동안 모 세관을 플러시.
      4. SDS 젤 버퍼 4.0 바에서 10 분 동안 모 세관을 플러시.
  2. 분리를 실행
    1. Hydrodynamically 0.1 바 입구에 4 분을 적용 하 여 CGE 실험 (단계 2.1.4)에 대 한 샘플 솔루션을 주입.
    2. -16.5 적용 kV 및 25 분 모 세관의 양쪽 끝에 2.0 바의 압력.

4. 선호도 모 세관 전기 이동 분석

참고: 준비 Nachbar 외. 이전 작품에서 설명 하는 방법에 따라 분리 4 및 Alhazmi 외. 5.

  1. 상태는 모 세관
    1. 23 ° c 온도 설정
      참고: 온도 게시 된 프로토콜에 따라 사용 되 고 다른 온도4,5로 변경할 수 있습니다. 그러나, 상호 작용 온도에 의존 하 고 그에 따라 변경 됩니다.
    2. 40 분 0.1 M NaOH와 2.5 바에서 모 세관을 플러시.
    3. 이온을 제거 된 물으로 1.0 바에서 10 분 동안 모 세관을 플러시.
    4. 30 mM Tris 버퍼 (pH 7.4) 1.0 바에서 30 분 동안 모 세관을 플러시.
  2. 에이스 방법에 대 한 준비
    1. Ligands 없이 측정을 위한 방법을 준비 합니다.
      참고: Acetanilide 추가 되지 않았습니다 샘플 솔루션에 그것 위장 2 단백질 봉우리로.
      1. 0.1 m M EDTA 솔루션 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.
      2. 이온을 제거 된 물으로 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.
      3. 평형에 대 한 트리 스 버퍼와 2.5 바에서 1.5 분 모 세관을 씻어.
      4. 6 0.05 바와 변화는 입구에서 s 및 Tris 버퍼 튜브에 콘센트 튜브 acetanilide 솔루션을 주입.
      5. 2.4 0.05 바 적용 s 모 세관 더 안쪽의 끝에서 acetanilide 솔루션을 밀기 위하여.
      6. 10.0 적용 6 분 kV 200의 파장에서 acetanilide 피크 감지 nm.
      7. 4.2.1.1 단계를 반복 합니다. -4.2.1.6. 단백질을 사용 하 여 샘플 acetanilide 솔루션 대신 고 모든 단백질 봉우리를 감지.
    2. Ligands와 측정에 대 한 메서드를 준비 합니다.
      1. 0.1 m M EDTA 솔루션 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.
      2. 이온을 제거 된 물으로 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.
      3. 평형에 대 한 리간드 솔루션 2.5 바에서 1.5 분 모 세관을 씻어.
      4. 6 0.05 바와 변화는 입구에서 s와 리간드를 포함 하는 버퍼 튜브에 콘센트 튜브 acetanilide 솔루션을 주입.
      5. 2.4 0.05 바 적용 s 모 세관 더 안쪽의 끝에서 acetanilide 솔루션을 밀기 위하여.
      6. 10.0 적용 6 분 kV 200의 파장에서 acetanilide 피크 감지 nm.
      7. 단계 4.2.2.1-4.2.2.6 acetanilide 솔루션 대신 단백질 견본을 사용 하 여 반복 하 고 모든 단백질 봉우리를 감지.
    3. 또는 다양 한 단백질-금속 이온 상호 작용 ( 대표 결과에서 설명)에 대 한 충전 크기 비율에 있는 변화를 계산 하려면 4.2.1 및 4.2.2 단계를 반복 합니다.
      1. 모든 60 h 후 신선한 한 단백질 해결책을 변경 합니다.
        참고:이 시점에서, 실험 수 일시 정지 됩니다. 이 절차는 적어도 반복된 10 x 피크 패턴 실행 실행에서 약간 다르므로 ligands의 각 농도 대 한. 솔루션 60 h 이상 사용 하는 경우 변이 너무 커질.
    4. 메서드 실행
      1. 단계 4.2.2, 알카라인 지구 ligand 솔루션 (CaCl2, MgCl2, BaCl2및 SrCl2 솔루션)을 사용 하 여 아래 설명 된 메서드를 실행 합니다.
      2. 단계 4.2.2, 알카라인 지구 ligand 솔루션 대신 MnCl2, 엔지니어링4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2및 NiCl2 솔루션을 사용 하 여 아래 설명 된 방법을 사용 하 여 계속 합니다.
        참고: 후자의 전이 금속 염화는 모 세관으로 강한 상호 작용 그리고 완전히 제거할 수 없습니다. 이러한 상호 작용 결과에 마이그레이션 시간에서 실행을 이동합니다. 따라서, 그들은 다른 금속 이온 후 조사 되었다.

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Representative Results

그림 1 에서는 CGE 실험 기간 동안 얻은 AtHIRD11 샘플에 대 한 electropherogram. 펩 티 드 크기 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다. 최대 수 4 큰 질량은 고 그대로 단백질을 나타냅니다. 작은 봉우리 2와 3는 작은 불순물을 (예, 저하 제품)를 나타냅니다. 첫 번째 피크와 전에 기준선의 불일치 또한 단백질 샘플 없이 재현 수 있습니다. 따라서, 그것은 관련이 SDS 자체 젤과 어떤 샘플 관련 불순물을 대표 하지 않는다.

그림 2 는 ACE 실험 동안 acetanilide에 대 한 electropherogram를 나타냅니다. 이후 아무 불순물 있어야 acetanilide 솔루션 1 높은 피크를 보여줍니다. 최대 피크에 대 한 검색 시간 electroosmotic 교류 (tEOF)의 마이그레이션 시간을 나타내고 상호 작용의 계산에 사용 됩니다.

그림 3 은 SDS와 금속 이온의 부재에서 에이스 실험 동안 AtHIRD11 샘플의 electropherogram입니다. 그것은 쇼, CGE electropherogram에서 2 불순물 외 단백질 자체와 관련 있는 적어도 5 봉우리. 1와 2 피크 이후 마이그레이션 시간을 표시 그들은 작은 또는 매우 긍정적으로 위탁 불순물을 할당할 수 있습니다. 이 가정은 시간이 지남에 최대 높이 지역에의 증가 의해 지원 됩니다. 3, 4 AtHIRD11 봉우리는 EOF 가까이 있기 때문에, 그들은 거의 충전 하 고 모든 실행에서 분리 될 수 없습니다. 그들은 거의 아무 상호 작용을 표시 하 고 액세스할 수 잔류물 금속 이온과 상호 작용에 대 한 필수적인 없이 conformations를 나타냅니다. AtHIRD11 여러 다른 충전-에-크기-비율 보여줍니다 다른 conformers의 다른 효과적인 반지름 때문. 이러한 conformers 지속적으로 병합할 수 있습니다. 그 후, 봉우리 5-7 평소 단백질 봉우리 보다 더 넓은 있습니다. 광범위 한 봉우리에 게 상호 작용의 활동에 힌트. 이후 봉우리는 좁은, 빠르고 다른 conformers 사이 매우 느린 변환 제외할 수 있습니다. 두 경우 모두, 봉우리 기준 구분4것입니다. 이 경우에, 전 평형 단계 피크 패턴을 변경할 수 있으며 느린 속도와 상호 작용에 대 한 더 나은 통찰력을 줄 것 이다.

그림 4 는 측정 된 마이그레이션 시간 그래픽 평가 피크 6에 대 한 다양 한 금속 이온의 교대. 그것은 계산 된 값 ΔR/Rf로 표시 됩니다. 이 값 (값)으로 얼마나 강한 변화는 고 단백질-금속 이온 복합물 충전 (부호)에 의해의 전반적인 변화를 나타냅니다. 중요 한 상호 작용 그리고 우연 교대, α에 대 한 자신감을 간격 사이 분화 하기 위하여 = 0.05도 계산 됩니다. 신뢰 구간 영 선와 교차 하지 하는 경우에서 상호 작용으로 중요 한으로 간주 됩니다. 결과 고려는 피크 10 electropherograms에서 적어도 6에 있었다면. 피크 6 500 µ M Co2 +모든 실행에 존재 했다. 각 AtHIRD11 피크에 대 한 상호 작용의 완전 한 목록은 Nachbar 외. 이전 작품에서 발행은 4.

ΔR/Rf (ligand)의 연구나 마이그레이션 시간 비율 및 마이그레이션 시간 비율 Rf (에 있는 ligand의 부재)를 사용 하 여 계산 됩니다:

Equation 1

Ri 및 Rf EOF 표식에 대 한 단백질 샘플 봉우리와 해당 피크 최고의 시간에 대 한 피크 최고 시간 t단백질 을 사용 하 여 계산 됩니다 tEOF:

Equation 2

R나는 ligand의 존재 시간 있습니다 사용 하 고 Rf, 부재에 시간.

Figure 1
그림 1 : 젤 버퍼에서 AtHIRD11 샘플의 CGE 분리에 대 한 Electropherogram. 그래서 그들은 유물 피크 1와 그것의 왼쪽에 봉우리 샘플 주입 없이 관찰할 수 있습니다. 대중과 전체 이후 피크 피크 2와 3의 영역은 피크 4의 보다 작은, 그들은 가능성이 불순물, 저하 제품 등. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : EOF 표식 acetanilide 실행의 Electropherogram. 그림에 금속 이온과 SDS 젤 버퍼 없이 화합물에 대 한 단 1 피크입니다. 피크 톱의 시간 electroosmotic 흐름을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 어떤 금속 이온이 없을 경우에는 복잡 한 피크 패턴을 보여주는 에이스 실험 동안 샘플 분리의 예는 electropherogram. 적어도 7 봉우리 식별 하 고 단백질과 그 2 불순물에 관련 된 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 500 µ M의 농도 사용 하 여 최대 6에 대 한 조사 금속 이온으로 바인딩 동작의 그래픽 평가. ΔR의 값 /Rf 힌트 마이그레이션 시간 이동의 강도에 따라서 금속 이온 바인딩에 구조적 변화 강도. ΔR의 부호 /Rf 경우 복잡 한 더 긍정적으로 또는 부정적으로 비용이 청구 됩니다 언바운드 단백질에 비해 나타냅니다. 오차 막대 나타내는 α에 대 한 자신감을 간격 = 0.05. 그 후, 그들은 영역 표시 어디 진정한 ΔR/Rf-값의 95%는 확실 하 게 찾을 수 있습니다. 빨간색 막대 (피크 미만 6 electropherograms에 존재 했다) 부족 한 데이터 계산된 결과 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

모든 CE 실험, 모 세관의 준비는 중요 한 단계 이다. 작은 직경을 가진 유리 튜브 때문에, 처리 되 고 때 코팅을 제거 하는 관광 명소에 쉽게 끊을 수 있다. 에 모 세관의 설치는 매우 신중 하 게 이루어져야 한다.

주로 에이스 메서드를 사용 하 여 중요 한 단계는 실험적인 체제에 관계 한다. 다른 중요 한 단계는 오른쪽 샘플 주입 매개 변수를 찾아내고 있다. 샘플의 주입된 양을 충분히 높은 봉우리를 수 있다. 그러나, 그것을 오버 중복 봉우리와 제대로 해결된 피크 패턴 발생할 것 이다. 때 삽입 된 볼륨 감소, 프로그램된 주입 압력을 도달 하는 악기에 대 한 시간이 좀 걸립니다 이후 주입 시간 대신 사출 압력 감소는 것이 좋습니다.

비정상적으로 넓은 봉우리는 다른 단백질 샘플에 대 한 찾을 수 있습니다. 이 패턴 전압을 증가 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 봉우리 좁은 고 분리 시간이 줄어듭니다. 그럼에도 불구 하 고, 분리 시간을 단축 하지 해결 봉우리에 발생할 수 있습니다 및 더 높은 전압 증가 줄 난방 전기 이동 분산7,8좁은 봉우리의 효과 제한. 따라서, 적절 한 조건 검사 각 새로운 단백질에 대 한 결정 될 필요가 있다.

CGE와 에이스는 단백질 및 그것의 바인딩 동작의 본질적으로 무질서 문자에 대 한 정보를 수집 하는 것은 새로운 접근 이다. 젤 전기 이동 법에 의해 샘플의 특성화는 관찰 된 여러 봉우리와 관련 되지 않은 불순물을 증명 하기 위해 필요한 단계입니다. CGE의 장점은, 짧은 준비 시간 및 고전 젤 전기 이동 법9에 비해 높은 해상도 자동화 하는 가능성. 사용 하 여 ACE 실험 쇼를 바인딩 하는 IDP에 대 한 다른 분석 실험 (예를 들어, 결과에서 금속 친화성 크로마토그래피 움직일 수) 쪽으로 그것의 우월 에이스 이후 뿐만 아니라 표시 바인딩. 또한, 그것은 단백질의 다른 conformers 분리 하 고 다양 한 conformers의 바인딩 ligands에 차이 밝힐 수 있다. 바인딩 실험 기간 동안 분리 없이 방법으로이 문제를 감지할 수 없습니다. 또한, 분석 시간은 불과 6 분; 따라서, 시간10짧은 금액에 결과 계산할 수 있습니다. 다른 한편으로, 빠른 분석 추정 바인딩 사이트11의 수에 제한이 함께 제공 됩니다.

이 접근의 미래 빠른 방식으로 화면 잠재적인 바인딩 파트너 단백질, 특히 IDPs 가능성에 놓여 있습니다. 그것은 다양 한 conformers 샘플에 존재의 다른 바인딩 동작의 빠른 개요를 제공합니다. 이후 에이스 자체 불순물과 자체 단백질을 구분할 수 없습니다 샘플 특성에 대 한 크기에 종속적 분리 (예를 들어, CGE)의 사용은 필수입니다. 그러나, CGE는 다른 크기의 종 수에 대 한 아이디어를 제공합니다. 바인딩 분석 결과 에이스의 응용 프로그램은 어떤 청구 ligand12에서 금속 이온의 ligands 이미 확장 되었습니다. 따라서, 그것은 어떤 특징 바인딩, 분리의 조합부터 상호 작용에 대 한 추가 정보 추가할 수 있으며 하나의 방법에 바인딩 분석 결과 다른 conformers의 어떤 변경된 바인딩 동작의 증거를 줄 수 있는 고 posttranslational 수정, 각각.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 감사 감사 Masakuza 하 라 (녹색 과학 연구 및 기술, 시즈오카 대학, 일본) AtHIRD11 단백질 샘플 제공.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

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References

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생화학 문제 138 본질적으로 무질서 단백질 선호도 모 세관 전기 이동 법 모 세관 젤 전기 이동 법 바인딩 분석 결과 금속 ligands dehydrins AtHIRD11
AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석
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Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

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