Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Этот протокол сочетает в себе характеристики образец протеина Капиллярный электрофорез и быстро привязки скрининга для заряженных лигандов, близость капиллярного электрофореза. Рекомендуется для белков с гибкой структурой, например неразрывно неупорядоченных белки, чтобы определить какие-либо различия в привязке для различных конформеров.

Abstract

Растения сильно зависят от окружающей их среды. Для того, чтобы приспособиться к стрессовым изменениям (например, засухи и высокой солености), высших растений развиваться классы неразрывно неупорядоченных белков (ВПЛ) для уменьшения окислительного и осмотического стресса. Эта статья использует комбинацию Капиллярный электрофорез (КГЭ) и мобильность сдвиг сродство электрофореза (ACE), чтобы описать поведение привязки различных конформеров AtHIRD11 ВПЛ из Arabidopsis thaliana. КГЭ используется для подтверждения чистоты AtHIRD11 и исключить фрагменты, Посттрансляционная изменений и других примесей, как причин для сложных пик шаблонов. В этой части эксперимента различные примеры компонентов разделенных их различных масс вязкой гелем внутри капилляра и обнаружены с детектором массив диода. Потом ACE исследуется поведение привязки образца к различных ионов металлов. В этом случае лигандом добавляется буферного раствора и сдвиг в миграции время измеряется для того, чтобы определить, произошло ли событие привязки или нет. Одним из преимуществ использования комбинации КГЭ и ACE определить поведение привязки МВУ является возможность автоматизировать электрофорез геля и пробирного привязки. Кроме того КГЭ показывает нижний предел обнаружения, чем классические гель-электрофорез и туз может определить порядок привязки лиганд в быстром образе. Кроме того ACE также может применяться для других заряженных видов чем ионы металла. Однако использование этого метода для привязки эксперименты ограничен в его способность определить количество сайтов связывания. Тем не менее сочетание КГЭ и туз может быть адаптирована для характеризующие поведение привязки любой образец протеина к многочисленные заряженных лигандами.

Introduction

Растения являются более зависимыми от их окружающей среды, чем многие другие формы жизни. Поскольку растения не может переехать в другие места, они должны адаптироваться к изменениям в их окружении (например, засухи, холодной и высокая концентрация соли). Следовательно высших растений разработана специализированная стресс белки как дегидринов, которые выполняют многообразные задачи, чтобы уменьшить стресс ячейки, относящиеся к высокой солености. Эти белки связывают воды и ионов внутри клеток, уменьшить окислительный стресс путем привязки Cu2 +-ионов и взаимодействовать с фосфолипидами, а также cytoskeletons. Кроме того, привязка Zn2 +-ионов позволяет эти белки выступают в качестве факторов транскрипции. Их способность фиксироваться Ca2 +-ионов после фосфорилирования был также сообщили1.

Многофункциональный поведение этих белков связана с отсутствием гидрофобные аминокислотных остатков. Следовательно им не хватает любой гидрофобных взаимодействий внутри пептидные цепи, а также ограничением структуры. Однако потому что эти белки отсутствие ограничительного структуры, они могут занимать различные конформеров на тех же условиях. Таким образом они могут быть описаны лучшие, как ансамбль сооружений, а не один конформации. Белки с этими свойствами известны как внутренне неупорядоченным белков (ВПЛ) и широко используется понятие стресса белков и перекрестных помех между различными путями в эукариотической клетки2.

Один из этих связанных со стрессом ВПЛ является AtHIRD11. Это один из Arabidopsis thalianaнаиболее высоко засухи выразил ВПЛ. Следовательно различные конформеров могут быть разделены их эффективный радиус для зарядки соотношение и капиллярного электрофореза (CE) был использован для дальнейшего расследования. Предыдущие эксперименты ACE продемонстрировал взаимодействия между AtHIRD11 и ионов переходных металлов таких как Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +и Ni2 +-ионов. Подробные результаты можно найти в Хара и др. 3 и Люберцах и др. 4.

ACE метод, который будет использоваться здесь основан на нашей ранее опубликованных работ6. Однако добавление acetanilide маркер EOF для Образец протеина не подходит. AtHIRD11 показывает широкий пик шаблоны, и добавление метки EOF образца будет замаскировать две вершины. Таким образом маркер используется в отдельном сеансе. Прежде чем рассматривается поведение привязки, он подтвердил, что пики, найденные во время предыдущих экспериментов являются из разных конформеров. Таким образом КГЭ используется для различения между конформеров белка, столб-поступательные изменения протеина и примесей, таких как фрагменты AtHIRD11, их разными массами. Впоследствии Исследовано поведение характеризуется AtHIRD11 Пример привязки к различных различных ионов металлов.

Целью этой статьи является описание экспериментальной установки для различения МВУ и другие компоненты образца для того чтобы оценить различия в поведении привязки различных конформеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка документов капиллярного электрофореза

  1. Подготовить капилляры
    1. Используйте стеклорез для нарезать голые кварцевое кремнезема капилляра с внешнее покрытие полиимида и внутренний диаметр 50 мкм 33 см (для КГЭ эксперимента) и длиной 30 см (для эксперимента, ACE) капилляров. Выполните резки на стеклянной пластины.
      Примечание: 2 различных экспериментальных установок были разработаны для 2 различных инструментов. Для того, чтобы использовать их на других инструментах, надлежащего метода передачи должна быть выполнена и длина капилляра должен корректироваться на допустимую длину документа.
    2. Используйте перо для обозначения в середине окна широкий обнаружения 1 см на расстоянии 24,5 см от одного конца капилляра для эксперимента КГЭ и 21,5 см от одного конца капилляра для ACE эксперимента (эффективная длина).
    3. Удаление полиимида внешнее покрытие из капилляров, сжигая его с паяльной лампой, 0,5 см до и после знака. Аналогично Использование паяльной лампой для удаления 1 см покрытия на обоих концах капилляров.
      Примечание: Эффективная длина может отличаться поскольку он полагается на приборе капиллярного электрофореза используется.
    4. Очистите концы капилляров и обнаружения windows с этанолом и мягких тканей.
      Примечание: Немелованной капилляров являются менее гибкими и, вероятно, сломать.
  2. Установите капилляров
    1. Установите капилляр в системе CE с окном обнаружения вблизи розетки.
      Примечание: Различные модели инструмента CE имеют различные Холдинг систем для капилляров. Обратитесь к руководству используемый инструмент для точных инструкций.

2. подготовить решения

  1. Подготовка решения для анализа КГЭ
    1. Подготовьте трис (гидроксиметил) aminomethane (Tris)-SDS буфера (100 mM/1% w/v) при pH 8.0.
      1. Используйте респираторные маски и стенд для взвешивания 1.00 g додецилового сульфата натрия (SDS) в 100-мл стакан.
      2. Добавьте 1,21 г в 100 мл стакан трис и растворить его с использованием 50 мл деионизированной воды и магнитные перемешать бар на магнитной мешалкой.
      3. Помещать рН электрода в раствор и скорректировать рН 8.0, используя 1.0 М HCl.
      4. Заполните решение в объемном колбу 100 мл и Добавьте деионизированной воды до отметки. Встряхните его осторожно, чтобы избежать любого образования пены.
    2. Приготовляют раствор NaOH 0,1 М.
      1. Весят 4.0 г NaOH в объемный флакон 100 мл. Заполните его до отметки с дейонизированной воды, чтобы сделать запас 1 М.
      2. Использование пипетки лампы 10 мл для передачи 10 мл этого раствора в другой объемный флакон 100 мл и заполнить его до отметки деионизированной водой.
    3. Подготовьте раствор HCl 0,1 М.
      1. Положите 10 мл 10 М HCl в 100 мл объемные колбу с использованием 10 мл Объемный дозатор и заполнить его до отметки деионизированной водой. Повторите этот шаг для получения 0,1 М HCl.
    4. Подготовка примера решения.
      1. Вес 0,5 мг белка в 1 мл трубку. Добавьте 0,5 мл буфера Tris-SDS гель из шага 2.1.1 с микропипеткой.
      2. Растворите белка путем встряхивания осторожно во избежание формирования пены и деградации белка.
        Примечание: Используйте ultrasonication если протеин не может быть распущен как описано; Избегайте любого нагрева раствора.
    5. Заполните решения во флаконы.
      1. Фильтр для каждого решения через 0,22 мкм поливинилиденфторид (ПВДФ) фильтр с помощью адекватных шприц непосредственно в пробирку.
        Примечание: Для решения гелем содержащих, обратное давление может быть высоким из-за его высокой вязкости.
      2. Подготовка 15 флаконов в общей сложности и Марк каждого, чтобы избежать любой путаницы.
        1. Заполните 3 флаконов с коммерчески доступных натрия Додециловый сульфат (SDS) гель буфера при pH 8.
          Примечание: Использование коммерчески доступных буфера гель SDS обеспечивает более точные результаты.
        2. Залейте 1 флакон 0,1 М NaOH и 1 флакон с 0,1 М HCl для промывки.
        3. Заполните 1 флакон с примером решения.
        4. Заполните 5 ампул с деионизированной воды и 4 флаконы с 0,1 мл деонизированной воды (погружение ампул).
          Примечание: Погружения флаконы используются как отходов пузырьки во время промывки капилляра до каждого запуска. Капиллярные концы, смоченной в воде, чтобы смыть остатки геля.
  2. Подготовка решения для анализа ACE
    1. Приготовляют раствор NaOH 1 M.
      1. Весят 4.0 г NaOH в объемный флакон 100 мл.
      2. Заполните его до отметки с дейонизированной воды, чтобы сделать запас 1 М.
    2. Подготовьте 0,1 М ethylendiaminetetraacetic кислоты (ЭДТА) в 0,1 М растворе NaOH.
      1. Передача 10 мл 0,1 М NaOH в 100 мл объемные колбу с помощью пипетки лампы 10 мл. Заполните его до отметки деионизированной водой.
      2. Весят 2,42 г ЭДТА на лодке весом и растворяет твердые соединения в 100 мл 0.1 М NaOH.
    3. Приготовляют раствор трис буфера (30 мм).
      1. Добавление 3.63 г трис, 200 мл деионизированной воды и перемешать бар в 500 мл стакан. Поместите стакан на тарелку, перемешать и включите его.
      2. РН электроды в стакан и скорректировать рН 7,4, используя 0,1 М HCl.
      3. Заполните решение в объемном флакон 1 Л и заполнить до отметки деионизированной водой.
        Примечание: Эта процедура должна повторяться или большие объемные колбу это необходимо, поскольку для всего анализа требуется более 1 Л.
    4. Подготовка acetanilide электроосмотического потока (EOF)-решение маркер (60 мкм).
      1. Добавьте 6 мг, acetanilide и 100 мл трис-буфер в объемный флакон 100 мл.
      2. Положите объемные колбу в ультразвуковой ванне и переключить его 30 мин.
    5. Подготовьте решение примера (1 мг/мл).
      1. Положить трубку microcentrifuge 0,5 мл на балансе точности и добавлять 0,3 мг порошка лиофилизированных AtHIRD11 в трубку.
      2. Используйте микропипеткой для добавления 0,3 мл буфера Tris 30 мм (рН 7,4) в трубе. Встряхните трубки тщательно, чтобы распустить белка.
    6. Подготовка решений лиганда.
      1. Подготовьте Стоковый раствор CaCl2 (5 мм).
        1. Возьмите лодку взвешивания, положить его на весы аналитические и весят 36.76 мг CaCl2* H2O.
        2. С помощью микропипеткой, флеш CaCl2* H2O от весом катера в 50 мл объемные колба с ранее подготовленными буфера Tris.
        3. Заполните объемный колбу с трис-буфер до отметки.
      2. Подготовьте решение оставшихся запасов (5 мм).
        1. Повторите шаг 2.2.6.1, используя другие металлические соли вместо CaCl2* H2O [MgCl2: 23.80 мг, BaCl2: 26.02 мг, Sr (№3)2: 52.91 мг, НКД2: 31.46 мг, SeCl4: 52.91 мг, CoCl 2* 2 H2O: 41.47 мг, CuCl2* 2 H2O: 42.62 мг, ZnCl2: 3.41 мг и NiCl2* 6 H2O: 59.43 мг].
          Примечание: Решение ZnCl2 имеет концентрацию 0,5 мм. Так как наблюдались сильные взаимодействия ионов и внутренней стенки капилляров, концентрация была снижена с коэффициентом 104.
      3. Приготовляют раствор2 500 мкм CaCl.
        1. 10 мл раствора штока2 CaCl, заполните и положил его в объемный флакон 100 мл.
        2. Заполните объемный колбу с буфером трис для знака и встряхнуть флакон.
      4. Приготовляют раствор2 250 мкм CaCl.
        1. 5 мл раствора штока2 CaCl, заполните и положил его в объемный флакон 100 мл.
        2. Заполните объемный колбу с буфером трис для знака и встряхнуть флакон.
      5. Повторите шаги 2.2.6.3 и 2.2.6.4 для других фондовых решения.
    7. Заполните решения во флаконах.
      Примечание: Каждый повторный запуск требуется набор впускных и выпускных флаконов. Использование свежей лигандом решений на входе и выходе уменьшает сдвиги в время миграции после каждого запуска.
      1. Заполните 250 мкм CaCl2 раствор в шприц 10 мл.
      2. Положите фильтр PVDF 0,22 мкм на шприц и push 2 мл раствора через фильтр, с помощью шприца, чтобы отменить этот отфильтрованный раствор.
      3. Заполните 10 ампул до максимального допустимого объема оставшихся 250 мкм CaCl раствором2 шприца. Марк каждый как 250 мкм CaCl 2 решения входе флакона.
      4. Заполните 10 ампул, пока они наполовину заполненный с 250 мкм CaCl2 решения. Марк каждый как 250 мкм CaCl решения 2 розетки во флаконе.
      5. Повторите шаги 2.2.7.1 - 2.2.7.4 металлические соли содержащих решений.
      6. Повторите действия для каждой пары входе и выходе флаконов, вместо этого с помощью 30 мм трис-буфере (рН 7,4) решение.
        Примечание: 30 ммоль/Л трис буфер рН 7,4 используется между запусками для получения данных время миграции для протеина в отсутствие ионов металлов. Это необходимо для того, чтобы игнорировать изменения в EOF.
      7. Повторите вышеуказанные шаги для одного флакона, вместо этого с помощью acetanilide метка EOF (60 мкм) решение. Кроме того повторите эти шаги, вместо этого использовать решение примера (1 мг/мл).

3. Капиллярная гель электрофоретического разделения

Примечание: Подготовьте разделения в соответствии с методом, описанным в предыдущей работе в Люберцах и др. 4.

  1. Подготовить анализ
    1. Состояние капилляров
      1. Установите термостат на 23 ° C.
      2. Промойте капилляра для 10 мин на 2,5 бар с 0,1 М NaOH.
      3. Промойте капилляр 5 мин на 2,0 бар с 0,1 М HCl.
      4. Промойте капилляра 2 мин на 2,0 бар деионизированной водой.
    2. Заполните в буфере гель SDS
      1. Заполните капилляр для 10 мин на 2,0 бар с коммерчески доступных буфера гель SDS при pH 8.0.
    3. Промойте капилляр до каждого запуска разделения
      1. Промойте капилляров на 3 мин на 4.0 бар с 0,1 М NaOH.
      2. Промойте капиллярные за 1 мин на 4.0 бар с 0,1 М HCl.
      3. Промойте капиллярные за 1 мин на 4.0 бар деионизированной водой.
      4. Промойте капилляра для 10 мин на 4.0 бар с буфером гель SDS.
  2. Запуск разделения
    1. Придать эжекции пример решения для КГЭ экспериментов (шаг 2.1.4), применяя 0,1 бар на 4 мин на входе.
    2. Применить-16.5 кв и давлении 2,0 бар на обоих концах капилляра для 25 мин.

4. близость капиллярного электрофореза анализ

Примечание: Подготовьте разделения в соответствии с методом, описанным в предыдущих работах, Люберцах и др. 4 и Alhazmi и др. 5.

  1. Состояние капилляров
    1. Установите термостат на 23 ° C.
      Примечание: Температура используется согласно опубликованные протоколы и может быть изменено для других температур4,5. Однако взаимодействия зависят от температуры и соответственно изменится.
    2. Флеш капилляр для 40 мин на 2,5 бар с 0,1 М NaOH.
    3. Промойте капилляра для 10 мин на 1,0 бар деионизированной водой.
    4. Промойте капилляра для 30 мин при 1,0 бара с буфером Трис 30 мм (рН 7,4).
  2. Подготовка для методов ACE
    1. Подготовьте метод для измерений без лигандами.
      Примечание: Acetanilide не был добавлен для примера решения, как это маскирует 2 белка пиков.
      1. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар с 0,1 М раствором ЭДТА.
      2. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар деионизированной водой.
      3. Промойте капилляра для 1,5 мин на 2,5 бар с буфером трис для уравновешивания.
      4. Внедрять решение acetanilide для 6 s на 0,05 бар и изменением входе и выходе флаконы для флаконов буфера Tris.
      5. Применить 0,05 бар 2.4 s нажать acetanilide решение от кончика капиллярной еще внутри.
      6. Применить 10,0 кв 6 мин и обнаруживать acetanilide пик на длине волны 200 Нм.
      7. Повторите шаги 4.2.1.1. -4.2.1.6. с помощью белка образца вместо решения acetanilide и обнаружить все вершины белка.
    2. Подготовьте метод для измерения с лигандами.
      1. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар с 0,1 М раствором ЭДТА.
      2. Промойте капиллярные за 1 мин на 2,5 бар деионизированной водой.
      3. Промойте капилляра для 1,5 мин на 2,5 бар с решением лигандом для уравновешивания.
      4. Внедрять решение acetanilide для 6 s на 0,05 бар и изменением входе и выходе флаконы для флаконов лиганд содержащие буфер.
      5. Применить 0,05 бар 2.4 s нажать acetanilide решение от кончика капиллярной еще внутри.
      6. Применить 10,0 кв 6 мин и обнаруживать acetanilide пик на длине волны 200 Нм.
      7. Повторите шаги 4.2.2.1 - 4.2.2.6, используя образец протеина вместо решения acetanilide и обнаружить все вершины белка.
    3. Попеременно повторите шаги 4.2.1 и 4.2.2 для того чтобы рассчитать изменения в заряд размер коэффициентов для различных белков металл Ион взаимодействий (описано в разделе Представитель результаты).
      1. Измените решение белка после каждые 60 h на свежие.
        Примечание: на данный момент, этот эксперимент может быть приостановлена. Эта процедура является по крайней мере неоднократные 10 x для каждого концентрации лигандов, поскольку пик шаблон изменяется незначительно от запуска к запуску. Если решение используется более чем 60 h, вариации становится слишком большим.
    4. Запустить методы
      1. Запустите метод, описанный в разделе Шаг 4.2.2, используя Щёлочноземельные лигандом решения (CaCl2, MgCl2, BaCl2и SrCl2 решения).
      2. Далее, с помощью метода, описанного в разделе Шаг 4.2.2, вместо решения лигандом Щёлочноземельные НКД2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2и NiCl2 решения.
        Примечание: Хлориды последний переходных металлов показали более взаимодействия с капиллярной и не могут быть полностью удалены. Эти взаимодействия результат в сдвиги в миграции время от запуска к запуску. Следовательно они были расследованы после других ионов металлов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1 показывает electropherogram для AtHIRD11 образца, полученные в ходе экспериментов КГЭ. Пептид размер увеличивается слева направо. Максимальное число 4 имеет большой массы и указывает интактных белков. Меньшие вершины 2 и 3 представляют собой меньше примесей (например, продуктов разложения). Первый пик и непоследовательность базовой линии до также могут быть воспроизведены без образец протеина. Таким образом, это связано с ПБ гель себе и не представляют каких-либо примесей, образец связанные.

Рисунок 2 представляет electropherogram для acetanilide в ходе экспериментов ACE. Решение acetanilide показывает только 1 высокий пик, поскольку он должен иметь без примесей. Время обнаружения для максимальный пик указывает время миграции электроосмотического потока (tEOF) и используется для расчета взаимодействия.

На рисунке 3 приведена electropherogram в AtHIRD11 образце во время эксперимента ACE в отсутствие SDS и ионов металлов. Он показывает, помимо 2 примесей от electropherogram КГЭ, по крайней мере 5 вершин, которые связаны с белком, сам. Пик 1 и 2 может быть назначен примесей, так как их миграции раз указывают, что они являются небольшие или весьма положительно заряженный. Это предположение подтверждается увеличение высоты пика и области с течением времени. С вершины AtHIRD11, 3 и 4 близки EOF, они вряд ли взимается и не могут быть отделены в каждом сеансе. Они почти показывают без взаимодействия и представляют конформации без доступных остатков существенно важное значение для взаимодействия с ионами металлов. AtHIRD11 показывает несколько разных заряд к размер коэффициенты из-за различных эффективных радиусов различных конформеров. Эти конформеров можно объединить непрерывно. Впоследствии вершины 5-7 шире, чем обычный белок пиков. Широкий пиков дать намек на кинетику взаимодействий. Поскольку не узкие пики, быстрый и очень медленные преобразования между различными конформеров могут быть исключены. В обоих случаях вершины бы базовый отделенный4. В этом случае предварительно уравновешивания шаг можно изменить шаблон пик и даст лучшее понимание взаимодействия с медленнее кинетики.

Рисунок 4 показывает, что графической оценки времени измерения миграции переносит в присутствии различных ионов металлов для пик 6. Она представлена в расчетное значение ΔR/Rf. Это значение показывает, насколько сильна сдвиг (по значению) и общее изменение заряда комплексы белка металл Ион (на его знак). Для того чтобы продифференцировать между существенного взаимодействия и случайный сдвиг, доверительные интервалы для α = 0,05 а также рассчитываются. В тех случаях, когда доверительный интервал не пересекающихся с нулевой линии взаимодействие считается значительным. Если пик присутствовал в по крайней мере 6 из 10 electropherograms учитываются результаты. Пик 6 не присутствовал в любом сеансе с 500 мкм Co2 +. Полный список таких взаимодействий для каждого пика AtHIRD11 публикуется в более ранней работе в Люберцах и др. 4.

ΔR/Rf рассчитывается с помощью миграции время коэффициенты R,я (в присутствии лигандом) и миграции время коэффициенты Rf (в отсутствие лигандом):

Equation 1

R,я и Rf рассчитываются с использованием пик Топ раз tбелка для вершины образца белка и соответствующее время Топ Пика для метки EOF тEOF:

Equation 2

Для R,яраз в присутствии лигандом используется и для Rf, раз в отсутствии.

Figure 1
Рисунок 1 : Electropherogram для разделения КГЭ AtHIRD11 образца в буфере гель. Пик 1 и вершины его слева можно наблюдать даже без образца инъекций, поэтому они являются артефактами. Начиная с массами и общей области пик пик 2 и 3 меньше, чем у пика 4, они являются скорее всего примесей, таких как продукты разложения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Electropherogram метки EOF acetanilide запустить. На рисунке показан только 1 пик для соединения без каких-либо ионы металлов и буфера геля SDS. Время в верхней пик знаменует электроосмотического потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Пример для electropherogram образца разделения в ходе экспериментов ACE показаны шаблон сложного пик в отсутствие каких-либо металлических ионов. По крайней мере 7 вершин можно определить и связанных с белка и его 2 примесей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Графической оценки поведения привязки к исследуемой ионы металла, с помощью концентрации 500 мкм для пик 6. Значения ΔR/Rf дать намек на интенсивность миграции сдвиг по времени и поэтому на основании конформационные изменения на ион металла привязки. Знак ΔR/Rf указывает, если комплекс более положительно или отрицательно взимается по сравнению с несвязанных белка. Планки погрешностей указывают доверительные интервалы для α = 0,05. Впоследствии они показывают области где истинный ΔR/Rf-значение может быть найдено с вероятностью 95%. Красные полоски указывают вычисленные результаты полученных данных недостаточно (пик присутствовал в менее 6 electropherograms). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для всех CE экспериментов подготовка капилляра является важным шагом. Поскольку это стеклянную трубку с малого диаметра, он может легко сломать в местах, где покрытие удаляется, когда он обрабатывается. Установка капилляра, в инструмент следует делать очень осторожно.

Важнейшие шаги, связанные в основном с помощью метода ACE относятся к экспериментальной установки. Другим важным шагом является нахождение правый образец параметров впрыска. Вводится количество образца должно быть достаточно для высоких пиков. Однако перегрузки приведет в шаблон плохо решен пик с перекрывающихся пиков. При снижении закачанного объема, рекомендуется уменьшить давление впрыска вместо время впрыска, поскольку он занимает некоторое время для инструмента для достижения запланированных инъекции давление.

Необычно широкий вершины можно найти для образцов различных белков. Этот шаблон может быть под влиянием увеличения напряжения. Следовательно вершины получить более узкий и сокращается время разделения. Тем не менее короче время разделение может привести к не решены пики и высокого напряжения увеличивает Джоуль Отопление и ограничивает эффект узких пиков, электрофоретической дисперсии7,8. Таким образом условия должны определяться для каждого нового белка изучены.

Сочетая КГЭ и ACE для сбора информации о сути неупорядоченных характер белок и его поведение привязки является новаторский подход. Характеристика образца электрофорезом геля-это необходимый шаг, чтобы доказать, что любой несколько пиков наблюдается не связаны с примесями. Преимуществом КГЭ является возможность автоматизировать его, короче время приготовления и более высокое разрешение по сравнению с классической гель электрофорез9. С помощью ACE для ВПЛ привязки эксперименты показывает свое превосходство в направлении других анализов (например, изъятые из металла аффинной хроматографии в результатах) с ACE не только показывает события привязки. Кроме того он отделяет различные конформеров белка и может выявить различия в связывание лигандов различных конформеров. Это поведение не может быть обнаружена методы без разделения в ходе эксперимента привязки. Кроме того время анализа является только 6 мин; Таким образом результаты могут быть рассчитаны в короткий промежуток времени10. С другой стороны быстрый анализ приходит с ограничениями в оценке количество привязки сайтов11.

Будущее этого подхода заключается в возможности экрана потенциальным партнерам привязки для белков, особенно ВПЛ, в быстром образе. Это дает краткий обзор различных привязки поведение различных конформеров, присутствующих в образце. Использование разделения зависит от размера (например, КГЭ) для описания образца является обязательным, так как ACE, сам не может различать примесей и белка, сам. Однако КГЭ дает представление о количестве видов разного размера. Применение ACE как привязки пробирного уже расширен от иона металла лигандов для любой заряженные лигандом12. Таким образом, он может добавить дополнительную информацию о взаимодействиях в любой характеризуется обязательным, поскольку сочетание разделения и пробирного привязки в одном методе может дать доказательства любых измененных привязки поведения различных конформерам и Посттрансляционная изменения, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы признательны поблагодарить Masakuza Хара (исследовательский институт зеленый науки и технологий, Университет Шизуока, Япония) для предоставления образцов белка AtHIRD11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

Биохимия выпуск 138 неразрывно неупорядоченных белки близость капиллярного электрофореза Капиллярный электрофорез привязка пробирного металлические лигандов дегидринов AtHIRD11
Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter