Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Denne protokol kombinerer karakterisering af et protein udsnit af kapillar gelelektroforese og en hurtig-bindende screening for opladet ligander af affinitet kapillær elektroforese. Det anbefales for proteiner med en fleksibel struktur, som uløseligt uordnede proteiner, til at bestemme eventuelle forskelle i bindende for forskellige opbygninger.

Abstract

Planter er stærkt afhængige af deres miljø. For at justere stressende ændringer (f.eks., tørke og høj saltholdighed), udvikler højere planter klasser af uløseligt uordnede proteiner (internt fordrevne) kan reducere oxidativ og osmotisk stress. Denne artikel bruger en kombination af kapillar gelelektroforese (CGE) og mobilitet Skift affinitet elektroforese (ACE) for at beskrive den bindende opførsel af forskellige konformere af IDP AtHIRD11 fra Arabidopsis thaliana. CGE bruges til at bekræfte renheden af AtHIRD11 og udelukke fragmenter, posttranslationelle ændringer og andre urenheder som årsager til komplekse peak mønstre. I denne del af forsøget, er forskellige prøve komponenter adskilt af en tyktflydende gel inde en kapillær af deres forskellige masserne og registreret med en diode array detektor. Bagefter, er den bindende opførsel af prøven mod forskellige metalioner undersøgt af ACE. I dette tilfælde liganden føjes til bufferopløsning og skift i migration tid måles for at bestemme om en bindende hændelse har fundet sted eller ej. En af fordelene ved at bruge kombinationen af CGE og es til at bestemme den bindende opførsel af en IDP er mulighed for at automatisere gelelektroforese og bindende assay. Derudover CGE viser en lavere grænse på opdagelse end den klassiske gelelektroforese og es er i stand til at bestemme mulige bindende en ligand på en hurtig måde. Desuden kan ACE også anvendes til andre ladede arter end metalioner. Men brugen af denne metode til bindende eksperimenter er begrænset i sin evne til at bestemme antallet af bindingssteder. Ikke desto mindre, kombinationen af CGE og ACE kan tilpasses for kendetegner bindende adfærd af enhver protein prøve mod talrige opladet ligander.

Introduction

Planter er mere afhængige af deres miljø end mange andre livsformer. Da planter ikke kan flytte til andre steder, har de til at tilpasse sig ændringer i deres omgivelser (f.eks., tørke, kulde og høje salt koncentrationer). Derfor, højere planter udviklet specialiseret stress proteiner som dehydrins, som opfylder mangfoldige opgaver for at reducere celle stress i forbindelse med høj saltholdighed. Disse proteiner binder vand og ioner inde i cellerne, reducere oxidativ stress ved at binde Cu2 +-ioner, og interagere med fosfolipider samt cytoskeletons. Derudover bindende Zn2 +-ioner tillader disse proteiner til at fungere som transkriptionsfaktorer. Deres evne til at binde Ca2 +-ioner efter fosforylering er også blevet rapporteret1.

Den multifunktionelle opførsel af disse proteiner er relateret til manglen hydrofobe aminosyrerester. Derfor, de mangler nogen hydrofobe interaktioner inde peptid kæde og også en begrænset struktur. Men fordi disse proteiner mangler en restriktiv struktur, kan de indtager forskellige opbygninger på samme betingelser. Derfor, de kan beskrives bedst som et ensemble af strukturer og ikke som en enkelt kropsbygning. Proteiner med disse egenskaber er kendt som uløseligt uordnede proteiner (internt fordrevne) og er et udbredt koncept for stress proteiner og krydstale mellem forskellige veje i eukaryote celler2.

En af disse stress-relaterede internt fordrevne er AtHIRD11. Det er en af Arabidopsis thalianade fleste meget tørke-udtrykt internt fordrevne. Derfor, de forskellige konformere kan være adskilt af deres effektive radius at oplade ratio, og kapillær elektroforese (CE) har været anvendt til yderligere undersøgelser. Tidligere ACE eksperimenter viste interaktioner mellem AtHIRD11 og overgang metal ioner som Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +og Ni2 +-ioner. De detaljerede resultater kan findes i Hara et al. 3 og Nachbar et al. 4.

Metoden ACE, der vil blive brugt her bygger på vores tidligere udgivne værker6. Tilsætning af EOF markør acetanilid protein prøven er imidlertid ikke egnet. AtHIRD11 viser bred peak mønstre, og tilføje EOF markør til prøven ville skjule to toppe. Derfor bruges markøren i en separat køre. Før bindende adfærd undersøges, bekræftes det, at toppene fundet under tidligere eksperimenter er fra forskellige opbygninger. Således CGE bruges til at skelne mellem protein konformere, den posttranslationelle modificeret protein og urenheder, som fragmenter af AtHIRD11, af deres forskellige masserne. Efterfølgende er er karakteriseret AtHIRD11 prøven bindende adfærd over for forskellige forskellige metalioner undersøgt.

Formålet med denne artikel er at beskrive en eksperimentel setup at skelne mellem en IDP og andre komponenter i en prøve for at vurdere forskelle i forskellige konformere bindende adfærd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af kapillær elektroforese instrumenter

  1. Forberede kapillærerne
    1. Bruge et glas cutter til at skære en bare-fused silica kapillær med en polyimid ydre belægning og en indre diameter på 50 µm i 33 cm (til CGE eksperiment) og 30 cm (for ACE eksperiment) lang kapillærer. Udføre skæring på en glasplade.
      Bemærk: De 2 forskellige eksperimentelle opsætninger var udviklet til 2 forskellige instrumenter. For at bruge dem på andre instrumenter, en ordentlig metode overførsel har skal udføres og kapillær længden skal tilpasses den tilladte længde af instrumentet.
    2. Brug en blyant til at markere midten af et 1-cm bred afsløring vindue ved en afstand på 24,5 cm fra den ene ende af kapillar til CGE eksperiment og 21,5 cm fra den ene ende af kapillar for ACE eksperiment (effektiv længde).
    3. Fjerne polyimid ydre belægning fra kapillærerne ved at brænde det med en blæselampe, 0,5 cm før og efter markeret. På samme måde, bruge blæselampe til at fjerne 1 cm med belægning på begge ender af kapillærerne.
      Bemærk: Den effektive længde kan variere lidt, da det bygger på kapillær elektroforese måleapparatet.
    4. Rens enderne af kapillærer og registrering af windows med ethanol og en blød væv.
      Bemærk: Ubestrøget kapillærerne er mindre fleksible og tilbøjelige til at bryde.
  2. Installere kapillærerne
    1. Installere en kapillær i CE-systemet med vinduet påvisning nær stikkontakten.
      Bemærk: De forskellige CE instrument modeller har forskellige bedrift systemer for kapillærerne. Se i brugervejledningen til den af det anvendte instrument for de præcise instruktioner.

2. klargør løsningerne

  1. Forberede løsninger til CGE analyse
    1. Forberede tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-SDS buffer (100 mM/1% w/v) ved pH 8,0.
      1. Bruge en respiratoriske maske og en kabine til vejning 1,00 g dodecyl natriumsulfat (SDS) i et 100 mL bægerglas.
      2. Tilføje 1,21 g af Tris i 100 mL bægerglas, og opløse den ved hjælp af 50 mL deioniseret vand og en magnetisk røre bar på en magnetomrører.
      3. Sætte en pH elektrode i opløsningen og justeres til pH 8,0 ved hjælp af 1,0 M HCl.
      4. Fylde løsningen i en 100 mL målekolbe og der tilsættes deioniseret vand op til maerket. Ryst den forsigtigt for at undgå enhver skum danner.
    2. Forberede 0,1 M NaOH-opløsning.
      1. 4,0 g NaOH i en 100 mL målekolbe afvejes. Fyld den op til mærket med deioniseret vand til at gøre en 1 M bestand.
      2. Bruge en 10 mL pære pipette til at overføre 10 mL af denne opløsning i en 100 mL målekolbe og fyld op til mærket med deioniseret vand.
    3. Forberede 0,1 M HCl løsning.
      1. Sat 10 mL 10 M HCL i en 100 mL målekolbe med en 10 mL målekolbe afpipetteres og fyld op til mærket med deioniseret vand. Gentag dette trin for at hente de 0,1 M HCl.
    4. Forberede prøveopløsningen.
      1. Veje 0,5 mg af protein i en 1 mL tube. Tilsættes 0,5 mL af Tris-SDS gel buffer fra trin 2.1.1 med en mikropipette.
      2. Opløs proteinet ved at ryste forsigtigt for at undgå enhver skum danner og nedbrydning af protein.
        Bemærk: Brug ultralydbehandling hvis proteinet ikke opløses som beskrevet; undgå enhver opvarmning af løsningen.
    5. Fylde løsningerne i hætteglassene.
      1. Filtrere hver løsning gennem et 0,22 µm polyvinylidene fluorid (PVDF) filtreres ved hjælp af en passende sprøjten direkte ind i hætteglasset.
        Bemærk: For de gel-holdige løsninger, kan modtrykket være høj på grund af sin høje viskositet.
      2. Forberede 15 hætteglas i alt og markere hver for at undgå eventuelle forvekslinger.
        1. Fyld 3 hætteglas med en kommercielt tilgængelig sodium dodecyl sulfat (SDS) gel buffer på pH 8.
          Bemærk: Brug af et kommercielt tilgængelige SDS gel buffer giver mere præcise resultater.
        2. Fyld 1 hætteglas med 0,1 M NaOH og 1 hætteglas med 0,1 M HCl til skylning.
        3. Fyld 1 hætteglas med prøveopløsningen.
        4. Fylde 5 hætteglas med deioniseret vand og 4 hætteglas med 0,1 mL deioniseret vand (dypning hætteglas).
          Bemærk: De dyppe hætteglas anvendes som affald hætteglas under rødmen af kapillar før hvert løb. Kapillar enderne er dyppet i vand for at skylle gel rester.
  2. Forberede ACE analyse af løsninger
    1. Forberede 1 M NaOH-opløsning.
      1. 4,0 g NaOH i en 100 mL målekolbe afvejes.
      2. Fyld den op til mærket med deioniseret vand til at gøre en 1 M bestand.
    2. Forberede 0,1 M ethylendiaminetetraacetic syre (EDTA) i en 0,1 M NaOH-opløsning.
      1. Overfør 10 mL af 0,1 M NaOH i en 100 mL målekolbe overføres ved hjælp af 10 mL pære pipette. Fyld den op til mærket med deioniseret vand.
      2. 2.42 g af EDTA på en vejer båden afvejes og opløses af fast stof i 100 mL af 0,1 M NaOH.
    3. Forberede Tris bufferopløsning (30 mM).
      1. Tilføje 3,63 g af Tris, 200 mL deioniseret vand og omrøres bar i et 500 mL bægerglas. Bægerglasset anbringes på en røre pladen og tænder for den.
      2. Sætte en pH meter elektrode i bægerglasset, og ph indstilles til 7.4 ved hjælp af 0,1 M HCl.
      3. Fyld løsningen i en 1 L målekolbe og fyld op til mærket med deioniseret vand.
        Bemærk: Denne procedure har gentages eller en større målekolbe er nødvendig, da mere end 1 L er nødvendig for hele analysen.
    4. Forberede acetanilid elektroosmotisk flow (EOF)-markør (60 µM) løsning.
      1. Tilføj 6 mg acetanilid og 100 mL af Tris buffer i en 100 mL målekolbe.
      2. Sætte den målekolbe i et ultralydsbad og tænde det i 30 min.
    5. Forberede prøveopløsningen (1 mg/mL).
      1. Lægge en 0,5 mL microcentrifuge tube på en præcision balance og tilføje 0,3 mg af frysetørret AtHIRD11 pulver ind i røret.
      2. Brug en mikropipette til at tilføje 0,3 mL af en 30 mM Tris buffer (pH 7,4) i røret. Ryst glasset omhyggeligt for at opløse proteinet.
    6. Forberede ligand løsninger.
      1. Forberede stamopløsningen CaCl2 (5 mM).
        1. Tage en vejning båd, sætte det på en Analysevægt og vejer 36.76 mg CaCl2* H2O.
        2. Ved hjælp af en mikropipette flush CaCl2* H2O fra vejningen båd i en 50 mL målekolbe med de tidligere parat Tris buffer.
        3. Fyld den målekolbe med Tris buffer op til mærket.
      2. Forberede de resterende stamopløsninger (5 mM).
        1. Gentag trin 2.2.6.1 ved hjælp af anden metallet salte i stedet for CaCl2* H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)2: 52.91 mg, frihedsbevægelse2: 31.46 mg, SeCl4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2O: 41.47 mg, CuCl2* 2 H2O: 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg, og NiCl2* 6 H2O: 59.43 mg].
          Bemærk: ZnCl2 løsning har en koncentration på 0,5 mM. Da stærk interaktioner mellem ioner og indre kapillar væggen blev observeret, koncentrationen var reduceret med en faktor 104.
      3. Forberede 500 µM CaCl2 løsning.
        1. Fylde 10 mL af stamopløsningen CaCl2 og sætte det i en 100 mL målekolbe.
        2. Fyld den målekolbe med en Tris buffer til mærket og Kolben rystes.
      4. Forberede 250 µM CaCl2 løsning.
        1. Fylde 5 mL af stamopløsningen CaCl2 og sætte det i en 100 mL målekolbe.
        2. Fyld den målekolbe med en Tris buffer til mærket og Kolben rystes.
      5. Gentag trin 2.2.6.3 og 2.2.6.4 for de andre stamopløsninger.
    7. Fylde løsningerne i hætteglassene.
      Bemærk: Hver gentagne run har brug for et sæt af indsugnings- og udstødningsporte hætteglas. Brugen af friske ligand løsninger på tilgangs- og afgangsåbninger reducerer forskydninger i migration tid efter hver kørsel.
      1. Fylde 250 µM CaCl2 løsning i en 10 mL sprøjte.
      2. Sætte et 0,22 µm PVDF filter på sprøjten og tryk 2 mL af opløsningen gennem filteret ved hjælp af sprøjten for at skille sig af med denne filtrerede løsning.
      3. Fylde 10 hætteglas op til den maksimale tilladte mængde med de resterende 250 µM CaCl2 løsning af sprøjten. Markere hver som 250 µM CaCl 2 løsning inlet hætteglas.
      4. Fylde 10 hætteglas, indtil de er halv-fyldt med 250 µM CaCl2 løsning. Markere hver som 250 µM CaCl 2 løsning outlet hætteglas.
      5. Gentag trin 2.2.7.1 - 2.2.7.4 for de andre metal salt-holdige løsninger.
      6. Gentag trinnene for hvert par af indsugnings- og udstødningsporte hætteglas med 30 mM Tris buffer (pH 7,4) løsning i stedet.
        Bemærk: 30 mmol/L Tris buffer pH 7,4 bruges i mellem løber for at opnå migrering tidsdata for protein i mangel af metal ioner. Det er nødvendigt for at forsømme ændringer i EOF.
      7. Gentag trinene ovenfor for et hætteglas med acetanilid EOF-markør (60 µM) løsning i stedet. Også, gentage disse trin ved hjælp af prøveopløsningen (1 mg/mL) i stedet.

3. kapillær Gel elektroforese adskillelse

Bemærk: Forberede adskillelse efter den metode, beskrevet af Nachbar et al. i tidligere arbejde 4.

  1. Forberede analysen
    1. Betingelse for kapillær
      1. Sæt termostaten til 23 ° C.
      2. Skyl kapillær for 10 min. ved 2,5 bar med 0,1 M NaOH.
      3. Skyl kapillær i 5 min på 2,0 bar med 0,1 M HCl.
      4. Skyl kapillær for 2 min på 2,0 bar med deioniseret vand.
    2. Udfyld SDS gel buffer
      1. Fyld en kapillær i 10 min på 2,0 bar med kommercielt tilgængelige SDS gel buffer til pH 8,0.
    3. Skyl kapillær før hver separation run
      1. Skyl kapillær for 3 min på 4,0 bar med 0,1 M NaOH.
      2. Skyl kapillær for 1 min på 4,0 bar med 0,1 M HCl.
      3. Skyl kapillær for 1 min på 4,0 bar med deioniseret vand.
      4. Skyl kapillær i 10 min på 4,0 bar med SDS gel buffer.
  2. Køre adskillelse
    1. Injicere prøveopløsningen til CGE eksperimenter (trin 2.1.4) hydrodynamically ved at anvende 0,1 bar i 4 min på fjorden.
    2. Anvende-16.5 kV og et tryk på 2,0 bar i begge ender af kapillar i 25 min.

4. affinitet kapillær elektroforese analyse

Bemærk: Forberede adskillelse efter metoden beskrevet i tidligere værker af Nachbar et al. 4 og Alhazmi et al. 5.

  1. Betingelse for kapillær
    1. Sæt termostaten til 23 ° C.
      Bemærk: Temperaturen bruges ifølge publicerede protokoller og kan ændres til andre temperaturer4,5. Imidlertid, samspillet er afhængig af temperaturen og ændres i overensstemmelse hermed.
    2. Skyl en kapillær for 40 min. ved 2,5 bar med 0,1 M NaOH.
    3. Skyl kapillær for 10 min. ved 1,0 bar med deioniseret vand.
    4. Skyl kapillær for 30 min. ved 1,0 bar med en 30 mM Tris buffer (pH 7,4).
  2. Forberedelse til ACE metoder
    1. Forberede metode til målinger uden ligander.
      Bemærk: Acetanilid blev ikke føjet til prøveopløsningen, som det slører 2 protein toppe.
      1. Skyl kapillær for 1 min på 2,5 bar med en 0,1 M EDTA-oploesning.
      2. Skyl kapillær for 1 min på 2,5 bar med deioniseret vand.
      3. Skyl kapillær for 1,5 min 2,5 bar med en Tris buffer for ækvilibrering.
      4. Injicere acetanilid løsning for 6 s på 0,05 bar og ændre fjorden og outlet hætteglas til Tris buffer hætteglas.
      5. Anvende 0,05 bar for 2,4 s for at skubbe acetanilid løsning fra spidsen af kapillar yderligere indersiden.
      6. Anvende 10,0 kV for 6 min og opdage acetanilid peak ved en bølgelængde på 200 nm.
      7. Gentag trin 4.2.1.1. -4.2.1.6. ved hjælp af proteinet prøve i stedet for acetanilid løsning og opdage alle protein toppene.
    2. Forberede metode til målinger med ligander.
      1. Skyl kapillær for 1 min på 2,5 bar med en 0,1 M EDTA-oploesning.
      2. Skyl kapillær for 1 min på 2,5 bar med deioniseret vand.
      3. Skyl kapillær for 1,5 min 2,5 bar med ligand løsning for ækvilibrering.
      4. Injicere acetanilid løsning for 6 s på 0,05 bar og ændre fjorden og outlet hætteglas til ligand-holdige buffer hætteglas.
      5. Anvende 0,05 bar for 2,4 s for at skubbe acetanilid løsning fra spidsen af kapillar yderligere indersiden.
      6. Anvende 10,0 kV for 6 min og opdage acetanilid peak ved en bølgelængde på 200 nm.
      7. Gentag trin 4.2.2.1 - 4.2.2.6 bruger eksemplet protein i stedet for acetanilid løsning og registrere alle protein toppe.
    3. Skiftevis Gentag trin 4.2.1 og 4.2.2 for at beregne ændringen i charge-størrelse nøgletal for de forskellige protein-metal ion interaktioner (beskrevet under Repræsentant resultater).
      1. Ændre opløsningen protein efter hver 60 h til en frisk.
        Bemærk: på dette tidspunkt forsøget kan afbrydes midlertidigt. Denne procedure er i det mindste gentagne 10 x for hver koncentration af ligander da peak mønster varierer lidt fra køre til at køre. Hvis opløsningen anvendes længere end 60 h, bliver variationerne for stor.
    4. Køre metoderne
      1. Køre metoden beskrevet under trin 4.2.2, bruger alkaline jorden ligand solutions (CaCl2, MgCl2, BaCl2og SrCl2 løsninger).
      2. Fortsætte med at bruge metoden beskrevet under trin 4.2.2, bruge frihedsbevægelse2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2og NiCl2 løsninger i stedet for alkaline jorden ligand løsninger.
        Bemærk: Sidstnævnte overgangen metal chlorider viste stærkere interaktioner med kapillær og kan ikke fjernes helt. Disse interaktioner resulterer i forskydninger i migration tid fra køre til at køre. Derfor blev de undersøgt efter de andre metalioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser elektroferogrammet for AtHIRD11 prøven fremstillet under CGE eksperimenter. Peptid størrelse øges fra venstre mod højre. Peak nummer 4 har den største masse og angiver den intakte protein. De mindre tinder 2 og 3 repræsenterer mindre urenheder (f.eks., nedbrydningsprodukter). Den første top og den manglende sammenhæng i baseline før kunne også gengives uden protein prøven. Derfor, det er relateret til SDS gel selve og repræsenterer ikke nogen prøve-associerede urenheder.

Figur 2 repræsenterer elektroferogrammet for acetanilid under ACE eksperimenter. Acetanilid løsning viser kun 1 høje peak, da det skulle have nogen urenheder. Afsløring tid til peak maksimale angiver det migration af elektroosmotisk flow (tEOF) og bruges til beregning af interaktionen.

Figur 3 er elektroferogrammet i eksemplet AtHIRD11 under ACE eksperimentet i mangel af SDS og metal-ioner. Det viser, udover de 2 urenheder fra CGE elektroferogrammet, mindst 5 toppe, som er relateret til proteinet, selv. Peak 1 og 2 kan tildeles til urenheder, da deres migration gange viser, at de er små eller meget positivt ladede. Denne antagelse er understøttet af stigning af peak højde og området over tid. Da AtHIRD11 toppe 3 og 4 er tæt på EOF, de er næppe opladet og kan ikke adskilles i hvert løb. De næsten Vis ingen interaktioner og repræsenterer konformationer uden tilgængelige restkoncentrationer afgørende for interaktioner med metal-ioner. AtHIRD11 viser flere forskellige charge-til-størrelse-nøgletal på grund af forskellige effektive radier i forskellige opbygninger. Disse konformere kan flette kontinuerligt. Efterfølgende er toppe 5-7 bredere end de sædvanlige protein toppe. De brede toppe give et vink om kinetik af interaktioner. Da toppene ikke er smalle, kan en fast og en meget langsom konvertering mellem de forskellige konformere udelukkes. I begge tilfælde ville toppene være baseline-adskilt4. I dette tilfælde, en præ ækvilibrering trin kan ændre peak mønster og ville give et bedre indblik i interaktioner med langsommere kinetik.

Figur 4 viser grafisk evalueringen af den målte migration tid skifter i tilstedeværelse af forskellige metalioner top 6. Den repræsenteres af den beregnede værdi ΔR/Rf. Denne værdi angiver, hvor stærkt et skift er (af dens værdi) og den samlede ændring af protein-metal ion komplekser afgift (ved sine tegn). For at skelne mellem en betydelig interaktion og en tilfældig Skift, konfidensintervaller for α = 0,05 beregnes som godt. I tilfælde hvor konfidensintervallet ikke skærer med nul linje, anses interaktionen som betydelige. Resultaterne tages i betragtning, hvis højdepunkt var til stede i mindst 6 ud af 10 elektroferogrammer. Top 6 var ikke til stede i enhver run med 500 µM Co2 +. Den komplette liste over interaktioner for hver AtHIRD11 peak er udgivet i et tidligere værk af Nachbar et al. 4.

ΔR/Rf beregnes ved hjælp af migration tid nøgletal, R,jeg (i nærværelse af ligand) og migration tid nøgletal Rf (i mangel af en ligand):

Equation 1

Rjeg og Rf beregnes ved hjælp af peak top gange tprotein til protein prøve toppe og den tilsvarende top spidsbelastningen for EOF-markør tEOF:

Equation 2

Rjeger gange i nærværelse af liganden anvendte og for Rf, gange i fravær.

Figure 1
Figur 1 : Elektroferogrammet til CGE adskillelse af AtHIRD11 prøven i gel buffer. Peak 1 og toppe på dens venstre kan observeres endda uden en prøve indsprøjtning, så de er artefakter. Da masserne og samlet toparealer af peak 2 og 3 er mindre end peak 4, de er sandsynlige urenheder, såsom nedbrydningsprodukter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Elektroferogrammet af EOF-markør acetanilid køre. Figuren viser kun 1 højdepunkt for sammensat uden metalioner og SDS gel buffer. Tidspunktet for peak top markerer elektroosmotisk flow. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Eksempel for en elektroferogrammet af prøven adskillelse under ACE eksperimenter viser en kompleks peak mønster i mangel af enhver metalioner. Mindst 7 toppe kunne identificeres og relateret til proteinet og urenhederne 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Grafisk evaluering af bindende adfærd over for de undersøgte metal ioner ved hjælp af en koncentration af 500 µM for bjerg 6. Værdier af ΔR/Rf give et vink om intensiteten af tidsskiftet migration og derfor på grundlag af de konformationelle ændringer på metal-ion bindende. Tegnet af ΔR/Rf viser hvis komplekset er mere positivt eller negativt opladt i forhold til den ubundet protein. Fejllinjer angive konfidensintervaller for α = 0,05. Efterfølgende, de viser området hvor den sande ΔR/Rf-værdi kan findes med en sikkerhed på 95%. De røde angiver de beregnede resultater opnået ved utilstrækkelige data (peak var til stede i mindre end 6 elektroferogrammer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For alle CE eksperimenter er forberedelse af kapillar et kritisk skridt. Da det er et glasrør med en lille diameter, kan det nemt bryde på de steder, hvor belægningen fjernes, når det bliver håndteret. Installation af kapillar i instrumentet skal gøres meget omhyggeligt.

De kritiske trin involveret i at bruge metoden ACE hovedsagelig vedrører opsætningen af eksperimenterende. En anden kritisk trin er at finde de rigtige prøve injektion parametre. Injiceres mængden af prøven må være nok for høje tinder. Men, overbelastning det ville resultere i et dårligt løst peak mønster med overlappende toppe. Når faldende de injicerede volumen, anbefales det at formindske injektion trykket i stedet for injektion tid, da det tager noget tid for instrumentet til at nå den programmerede indsprøjtning pres.

Usædvanligt bredt toppe kan findes forskellige protein prøver. Dette mønster kan påvirkes ved at øge spændingen. Derfor toppene få smallere og adskillelse tid er reduceret. Ikke desto mindre, den kortere adskillelse tid kan resultere i ikke-løst toppe og den højere spænding øger Joule varme og begrænser effekten af smalle toppe af elektroforese dispersion7,8. De rette betingelser skal derfor fastsættes for hver ny protein undersøgt.

Kombinere CGE og es for at indsamle oplysninger om uløseligt uordnede karakter af en protein og dets bindende opførsel er en ny tilgang. Karakterisering af prøven ved gelelektroforese er et nødvendigt skridt for at bevise, at de flere peaks observeret ikke er relateret til urenheder. Fordelen ved CGE er mulighed for at automatisere det, den kortere tid til forberedelse og en højere opløsning i forhold til klassisk gel elektroforese9. Ved hjælp af es for IDP bindende eksperimenter viser sin overlegenhed over andre assays (fximmobiliseret metal affinitet kromatografi i resultaterne) siden ACE ikke kun viser bindende begivenheder. Endvidere adskiller forskellige konformere af et protein, og kan afsløre forskelle i bindende ligander af mangfoldige opbygninger. Denne adfærd ikke kan påvises ved metoder uden en adskillelse i løbet af bindende eksperiment. Derudover er analyse tid kun 6 min; Derfor kan resultaterne beregnes i en kort tid10. På den anden side kommer den hurtige analyse med begrænsninger i estimeringen af antal bindende websteder11.

Fremtiden for denne tilgang ligger i muligheden for at skærmen potentielle bindende partnere for proteiner, især internt fordrevne, på en hurtig måde. Det giver et hurtigt overblik over forskellige bindende funktionsmåden for de forskellige konformere findes i en prøve. Anvendelse af størrelse-afhængige adskillelse (fxCGE) til prøven karakterisering er obligatorisk, da ACE, selv ikke kan skelne mellem urenheder og protein, selv. Dog giver CGE en idé om antallet af forskellige mellemstore arter. Anvendelse af ACE som en bindende assay er blevet udvidet allerede fra metal-ion ligander til enhver opladet ligand12. Derfor, det kan tilføje yderligere oplysninger om interaktioner til nogen karakteriseret bindende, da kombinationen af adskillelse og bindende analysen i en metode kan give dokumentation for eventuelle ændrede bindende adfærd af forskellige konformere og posttranslationelle modifikationer, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi taknemmelig takker Masakuza Hara (Research Institute af grøn videnskab og teknologi, Universitet i Shizuoka, Japan) for at give AtHIRD11 protein prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

Biokemi spørgsmålet 138 uløseligt uordnede proteiner affinitet kapillær elektroforese kapillær gelelektroforese bindende assay metal ligander dehydrins AtHIRD11
Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter