Summary
Dit protocol combineert de karakterisering van een eiwitsteekproef door capillaire gelelektroforese en een snel-bindende screening voor geladen liganden door affiniteit capillaire elektroforese. Het wordt aanbevolen voor eiwitten met een flexibele structuur, zoals intrinsiek ongeordende eiwitten, om te bepalen van eventuele verschillen in bindende voor verschillende conformeren.
Abstract
Planten zijn sterk afhankelijk van hun omgeving. Om aan te passen aan stressvolle veranderingen (bijvoorbeeld, droogte en hoge zoutgehalte), evolueren hogere planten klassen van intrinsiek ongeordende eiwitten (ontheemden) oxidatieve en osmotische stress te verminderen. Dit artikel maakt gebruik van een combinatie van capillaire gelelektroforese (CGE) en affiniteit elektroforese (ACE) van de verschuiving van de mobiliteit om te beschrijven het bindingsgedrag van verschillende conformeren van de IDP-AtHIRD11 van Arabidopsis thaliana. CGE is gebruikt om te bevestigen de zuiverheid van AtHIRD11 en tot uitsluiting van fragmenten, posttranslationele modificaties, en andere verontreinigingen als redenen voor complexe piek patronen. In dit deel van het experiment, zijn de verschillende monster onderdelen gescheiden door een viskeuze gel binnen een capillair door hun verschillende massa's en met een diode array detector gedetecteerd. Daarna wordt het bindingsgedrag van het monster naar verschillende metaalionen onderzocht door ACE. In dit geval de ligand is toegevoegd aan de bufferoplossing en de verschuiving in de migratietijd wordt gemeten om te bepalen of een bindende gebeurtenis heeft plaatsgevonden of niet. Een van de voordelen van het gebruik van de combinatie van CGE en aas om te bepalen van het bindingsgedrag van een IDP is de mogelijkheid om de Elektroforese van het gel en de bindende bepaling te automatiseren. Bovendien CGE toont een ondergrens voor detectie dan de klassieke gelelektroforese en ACE vermag bepalen de wijze van bindende een ligand in een snelle manier. ACE kan daarnaast ook worden toegepast op andere geladen soorten dan metaalionen. Het gebruik van deze methode voor het binden van experimenten wordt echter beperkt in zijn vermogen om te bepalen van het aantal bandplaatsen. De combinatie van CGE en ACE kan echter worden aangepast voor het karakteriseren van het bindingsgedrag van een eiwitsteekproef naar talrijke geladen liganden.
Introduction
Planten zijn meer afhankelijk van hun omgeving dan vele andere levensvormen. Aangezien planten niet naar andere plaatsen verplaatsen, moeten ze zich aanpassen aan veranderingen in hun omgeving (bijvoorbeelddroogte, koude en hoge zout concentraties). Daarom ontwikkelde hogere planten gespecialiseerde stress eiwitten zoals dehydrins, die vele taken vervullen ter vermindering van de spanning van de cel aan hoge zoutgehalte gerelateerde. Deze proteïnen binden van water en ionen binnen cellen, vermindering van oxidatieve stress door bindende Cu2 +-ionen, en interactie met fosfolipiden, evenals de cytoskeletons. Bovendien bindend Zn2 +-ionen kan deze eiwitten als transcriptiefactoren op te treden. Hun vermogen om te binden Ca2 +-ionen nadat fosforylatie ook is gemeld1.
De multifunctionele werking van deze proteïnen is gerelateerd aan het ontbreken van hydrofobe aminozuurresidu's. Zij missen dus een hydrofobe interacties binnen de keten van peptide en ook een beperkte structuur. Echter, omdat deze proteïnen een restrictieve structuur ontbreekt, zij verschillende conformeren onder dezelfde voorwaarden kunnen innemen. Dus kunnen ze beschreven worden best als een ensemble van structuren in plaats van een enkele bevleesdheid. Eiwitten met deze eigenschappen staan bekend als intrinsiek eiwitten (ontheemden ontregelde) en een veelgebruikt concept voor stress-eiwitten en overspraak tussen verschillende trajecten in eukaryote cellen2 zijn.
Een van deze stressgerelateerde ontheemden is AtHIRD11. Het is een van Arabidopsis thalianade meeste zeer droogte-uitgedrukt ontheemden. Vandaar, de verschillende conformeren kunnen worden gescheiden door hun effectieve straal te rekenen verhouding en capillaire elektroforese (CE) is gebruikt voor verder onderzoek. Vorige ACE experimenten aangetoond dat de interactie tussen AtHIRD11 en overgangsmetalen ionen zoals Cu2 +-, Zn2 +- Co2 +en Ni2 +-ionen. De gedetailleerde resultaten kunnen worden gevonden in Hara et al. 3 en Nachbar et al. 4.
De ACE-methode die hier wordt gebruikt is gebaseerd op onze eerder gepubliceerde werken6. De toevoeging van het EOF marker acetanilide aan de eiwitSteekproef is echter niet geschikt. AtHIRD11 toont brede piek patronen, en de EOF-markering toe te voegen aan het monster twee pieken zou verhullen. De markering wordt daarom gebruikt in een aparte run. Voordat het bindingsgedrag wordt onderzocht, wordt bevestigd dat de pieken gevonden tijdens eerdere experimenten van verschillende conformeren zijn. Dus, CGE is gebruikt om te onderscheiden tussen de eiwit conformeren, de posttranslationele gemodificeerde eiwitten en onzuiverheden, zoals fragmenten van AtHIRD11, door hun verschillende massa's. Daarna wordt het gekenmerkt AtHIRD11 monster bindingsgedrag naar diverse verschillende metaalionen onderzocht.
Het doel van dit artikel is voor het beschrijven van een experimentele opstelling onderscheid maken tussen een IDP en andere componenten van een monster teneinde de verschillen in het bindingsgedrag van verschillende conformeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de capillaire elektroforese instrumenten
-
Voorbereiden van de haarvaten
- Gebruik een glassnijder te snijden een bare-gesmolten siliciumdioxide capillair met een externe coating van polyimide en een inwendige diameter van 50 µm tot 33 cm (voor de CGE experiment) en 30 cm (voor de ACE-experiment) lange haarvaten. Voer het stekje op een glazen plaat.
Opmerking: De 2 verschillende experimentele opstellingen werden ontwikkeld voor 2 verschillende instrumenten. Om ze te gebruiken op andere instrumenten, een juiste methode transfer moet worden uitgevoerd en de capillaire lengte moet worden aangepast aan de toegestane lengte van het instrument. - Gebruik een pen om te markeren van het midden van het venster van een 1 cm brede detectie op een afstand van 24,5 cm vanaf een uiteinde van het capillair voor het experiment CGE en 21.5 cm van het ene eind van het capillair voor de ACE experiment (effectieve lengte).
- Verwijder de externe coating van polyimide uit de haarvaten door branden het af met een steekvlam, 0.5 cm voor en na het merk. Ook gebruiken de steekvlam verwijderen 1 cm van de coating aan beide uiteinden van de haarvaten.
Opmerking: De effectieve lengte kan enigszins variëren omdat het berust op het instrument van de capillaire elektroforese gebruikt. - Reinig de uiteinden van de haarvaten en de ramen van de detectie met ethanol en een zacht weefsel.
Opmerking: De ongecoate haarvaten zijn minder flexibel en waarschijnlijk te breken.
- Gebruik een glassnijder te snijden een bare-gesmolten siliciumdioxide capillair met een externe coating van polyimide en een inwendige diameter van 50 µm tot 33 cm (voor de CGE experiment) en 30 cm (voor de ACE-experiment) lange haarvaten. Voer het stekje op een glazen plaat.
-
Installeren van de haarvaten
- Installeer een capillair in het CE-systeem met het detectie-venster in de buurt van de uitlaat.
Opmerking: De verschillende CE instrument modellen hebben verschillende bedrijf systemen voor de haarvaten. Raadpleeg de handleiding van het gebruikte instrument voor de precieze instructies.
- Installeer een capillair in het CE-systeem met het detectie-venster in de buurt van de uitlaat.
2. het bereiden van de oplossingen
- Bereiden van de oplossingen voor de analyse van CGE
- Voorbereiden van de tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-SDS buffer (100 mM/1% w/v) op pH 8,0.
- Gebruik een respiratoire masker en een stand voor het wegen van 1.00 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) in een bekerglas van 100 mL.
- Voeg 1,21 g van Tris in het bekerglas van 100 mL en los met behulp van 50 mL gedeïoniseerd water en een magnetische roer bar op een magneetroerder.
- Zet een pH-elektrode in de oplossing en breng de pH op 8.0 met behulp van 1,0 M HCl.
- Vul de oplossing in een maatkolf van 100 mL en Voeg gedeïoniseerd water aan tot de streep. Schud het voorzichtig en voorkom de vorming van een schuim.
- Bereid de 0,1 M NaOH oplossing.
- Weeg 4.0 g van NaOH in een 100 mL maatkolf. Vullen tot de maatstreep met gedeïoniseerd water om een voorraad van 1 M.
- Gebruik een pipet 10 mL lamp Pipetteer 10 mL van deze oplossing in een maatkolf van 100 mL en vul het met gedeïoniseerd water aan tot de streep.
- Bereid de 0,1 M HCl oplossing.
- 10 mL 10 M HCl gestoken in een maatkolf van 100 mL met behulp van een volumetrische pipet 10 mL en vul het met gedeïoniseerd water aan tot de streep. Herhaal deze stap om het verkrijgen van de 0,1 M HCl.
- Stellen van de monsteroplossing.
- Weeg 0.5 mg van het eiwit in een 1 mL-buis. Voeg 0,5 mL van de Tris-SDS gel-buffer uit stap 2.1.1 met een micropipet.
- Los het eiwit door zachtjes schudden om te voorkomen dat eventuele schuim vorming en afbraak van het eiwit.
Opmerking: Gebruik met ultrasone trillingen, indien het eiwit niet kan worden opgelost, zoals wordt beschreven; Vermijd elke verwarming van de oplossing.
- Vul de oplossingen in de flesjes.
- Filteren van elke oplossing door een 0,22 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) filteren met behulp van een adequate injectiespuit rechtstreeks in de flacon.
Opmerking: Voor de gel-bevattende oplossingen, de tegendruk kan hoog zijn als gevolg van de hoge viscositeit. - Bereiden van 15 flesjes in totaal en Markeer elke webserver zodanig dat elke verwisselingen te voorkomen.
- 3 flesjes te vullen met een commercieel beschikbare natrium dodecyl sulfaat (SDS) gel buffer bij pH 8.
Opmerking: Het gebruik van een commercieel beschikbare SDS gel-buffer biedt nauwkeurigere resultaten. - Vul 1 flacon met 0,1 M NaOH en 1 flacon met 0,1 M HCl voor het spoelen.
- Vul 1 flacon met de oplossing van het monster.
- 5 flesjes vullen met gedeïoniseerd water en 4 flesjes met 0,1 mL gedeïoniseerd water (dompelen flesjes).
Opmerking: De dompelen flesjes dienen als afval flesjes tijdens het afboeken van het capillair vóór elke run. De capillaire uiteinden worden ondergedompeld in water te spoel af geen gel-residuen.
- 3 flesjes te vullen met een commercieel beschikbare natrium dodecyl sulfaat (SDS) gel buffer bij pH 8.
- Filteren van elke oplossing door een 0,22 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) filteren met behulp van een adequate injectiespuit rechtstreeks in de flacon.
- Voorbereiden van de tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-SDS buffer (100 mM/1% w/v) op pH 8,0.
- Bereiden van de oplossingen voor de ACE-analyse
- Bereid de 1 M NaOH oplossing.
- Weeg 4.0 g van NaOH in een 100 mL maatkolf.
- Vullen tot de maatstreep met gedeïoniseerd water om een voorraad van 1 M.
- De 0,1 M ethylendiaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in een 0,1 M NaOH-oplossing te bereiden.
- Pipetteer 10 mL van 0,1 M NaOH in een maatkolf van 100 mL met behulp van een precisiepipet 10 mL lamp. Vullen tot de maatstreep met gedeïoniseerd water.
- Weeg 2.42 g van EDTA op een gewicht boot en los van de vaste stof in de 100 mL 0,1 M NaOH.
- Bereiden de Tris-bufferoplossing (30 mM).
- Voeg 3.63 g van Tris, 200 mL gedeïoniseerd water en een roer-bar in een bekerglas van 500 mL. Plaats het bekerglas op een bord roer en schakel het.
- Zet een pH meter elektrode in het bekerglas en breng de pH op 7.4 met 0,1 M HCl.
- Vul de oplossing in een maatkolf van 1 L en vul tot de maatstreep met gedeïoniseerd water.
Opmerking: Deze procedure moet worden herhaald of een grotere maatkolf sinds meer dan 1 L nodig is voor de hele analyse nodig is.
- Bereiden de acetanilide electroosmotic stroom (EOF)-marker (60 µM) oplossing.
- Voeg 6 mg acetanilide en 100 mL Tris buffer in een maatkolf van 100 mL.
- Zet de maatkolf in een ultrasoonbad en zet het gedurende 30 minuten.
- Stellen van de monsteroplossing (1 mg/mL).
- Zet een tube van 0,5 mL microcentrifuge op een precisie-evenwicht en Voeg 0.3 mg van gevriesdroogd poeder van de AtHIRD11 in de buis.
- Gebruik een micropipet om te voegen 0.3 mL van een 30 mM Tris buffer (pH 7.4) in de buis. Schud de buis zorgvuldig te ontbinden van het eiwit.
- Bereiden de ligand-oplossingen.
- Voorbereiden van de stockoplossing van CaCl2 (5 mM).
- Neem een wegende boot, zet het op een analytische balans en weeg 36.76 mg CaCl2* H2O.
- Met behulp van een micropipet, spoel de CaCl2* H2O van het gewicht van de boot in een maatkolf van 50 mL met de eerder bereid Tris-buffer.
- Vul de maatkolf met de Tris buffer aan tot de streep.
- Voorbereiding van de resterende voorraadoplossingen (5 mM).
- Herhaal stap 2.2.6.1 met behulp van de andere metalen zouten in plaats van CaCl2* H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)-2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, SeCl4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2O: 41.47 mg, CuCl2* 2 H2O: 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg en NiCl2* 6 H2O: 59.43 mg].
Opmerking: De ZnCl2 oplossing heeft een concentratie van 0,5 mM. Aangezien de sterke wisselwerking tussen de ionen en de binnenwand van de capillaire werden waargenomen, de concentratie werd teruggebracht met een factor 104.
- Herhaal stap 2.2.6.1 met behulp van de andere metalen zouten in plaats van CaCl2* H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)-2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, SeCl4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2O: 41.47 mg, CuCl2* 2 H2O: 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg en NiCl2* 6 H2O: 59.43 mg].
- Bereid de 500 µM CaCl2 oplossing.
- 10 mL van de stockoplossing van de2 CaCl vullen en zet het in een maatkolf van 100 mL.
- Vul de maatkolf met een buffer van Tris tot de maatstreep en schud de kolf.
- Bereid de 250 µM CaCl2 oplossing.
- Vullen van 5 mL van de stockoplossing van de2 CaCl en zet het in een maatkolf van 100 mL.
- Vul de maatkolf met een buffer van Tris tot de maatstreep en schud de kolf.
- Herhaal stap 2.2.6.3 en 2.2.6.4 voor de andere voorraadoplossingen.
- Voorbereiden van de stockoplossing van CaCl2 (5 mM).
- De oplossingen in de flesjes te vullen.
Opmerking: Elke herhaalde run moet een aantal inlaat en uitlaat flesjes. Het gebruik van verse ligand oplossingen op de inlaat en uitlaat vermindert de verschuivingen in migratietijd na elke run.- Vul de 250 µM CaCl2 oplossing in een 10 mL spuit.
- Zet een 0,22 µm PVDF filter op de spuit en de push 2 mL van de oplossing door de filter door middel van de spuit om te negeren deze gefilterde oplossing.
- Vul 10 flesjes tot de maximaal toegestane volume met de resterende 250 µM CaCl2 oplossing van de spuit. Mark elk als 250 µM CaCl 2 oplossing inlaat flacon.
- 10 flesjes te vullen totdat ze half gevuld met de 250 µM CaCl2 oplossing. Mark elk als 250 µM CaCl 2 oplossing outlet flacon.
- Herhaal stap 2.2.7.1 - 2.2.7.4 voor de andere metalen zout-bevattende oplossingen.
- Herhaal de stappen voor elk paar van inlaat en uitlaat flesjes in plaats daarvan gebruik van de 30 mM Tris-bufferoplossing (pH 7.4).
Opmerking: De 30 mmol/L Tris buffer pH 7.4 wordt gebruikt tussen de pistes migratie tijd om gegevens te verkrijgen voor de proteïne in afwezigheid van metaalionen. Het is noodzakelijk om de verwaarlozing van de veranderingen in het EOF. - Herhaal de bovenstaande stappen voor een flacon met behulp van de EOF-marker (60 µM) oplossing van acetanilide plaats. Ook, herhaalt u deze stappen met behulp van de monsteroplossing (1 mg/mL) plaats.
- Bereid de 1 M NaOH oplossing.
3. de capillaire Gel elektroforetische scheiding
Opmerking: De scheiding volgens de methode die wordt beschreven in eerdere werk Nachbar et al. bereiden 4.
-
De analyse voorbereiden
-
Voorwaarde het capillair
- Stel de thermostaat op 23 ° C.
- Spoel het capillair gedurende 10 minuten bij 2.5 bar met 0,1 M NaOH.
- Spoel het capillair gedurende 5 minuten aan 2.0 bar met 0,1 M HCl.
- Spoel het capillair gedurende 2 minuten bij 2,0 bar met gedeïoniseerd water.
-
Vul in de buffer van de gel SDS
- Vul een capillair gedurende 10 minuten bij 2,0 bar met de verkrijgbare SDS gel-buffer met een pH van 8.0.
-
Spoelen van het capillair vóór elke scheiding run
- Spoel het capillair gedurende 3 minuten op 4,0 bar met 0,1 M NaOH.
- Spoel het capillair voor 1 min op 4,0 bar met 0,1 M HCl.
- Spoel het capillair voor 1 min op 4,0 bar met gedeïoniseerd water.
- Spoel het capillair voor 10 min op 4,0 bar met de SDS gel-buffer.
-
Voorwaarde het capillair
-
Uitvoeren van de scheiding
- Injecteer de monsteroplossing voor de experimenten van CGE (stap 2.1.4) hydrodynamica door 0,1 bar voor 4 min aan de inlaat van de toe te passen.
- Toepassen van-16.5 kV en een druk van 2.0 bar aan beide uiteinden van het capillair gedurende 25 minuten.
4. affiniteit capillaire elektroforetische analyse
Opmerking: De scheiding volgens de methode beschreven in eerdere werken door Nachbar et al. bereiden 4 en Alhazmi et al. 5.
-
Voorwaarde het capillair
- Stel de thermostaat op 23 ° C.
Opmerking: De temperatuur wordt gebruikt volgens gepubliceerde protocollen en kan worden gewijzigd in andere temperaturen4,5. Echter de interacties zijn afhankelijk van de temperatuur en zal dienovereenkomstig veranderen. - Spoel een capillair voor 40 min bij 2.5 bar met 0,1 M NaOH.
- Spoel het capillair gedurende 10 minuten bij 1.0 bar met gedeïoniseerd water.
- Spoel het capillair gedurende 30 minuten bij 1.0 bar met een 30 mM Tris buffer (pH 7.4).
- Stel de thermostaat op 23 ° C.
-
Voorbereiding van de ACE-methoden
- De methode voor de metingen zonder liganden voor te bereiden.
Opmerking: Acetanilide is niet toegevoegd aan de oplossing van het monster, zoals het vermommingen 2 eiwit pieken.- Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met een 0,1 M EDTA-oplossing.
- Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met gedeïoniseerd water.
- Spoel het capillair 1,5 min bij 2.5 bar met een buffer van Tris voor evenwichtsinstelling.
- Injecteer de acetanilide oplossing voor 6 s op 0,05 bar en verandering de inlaat en uitlaat flesjes aan de Tris buffer flesjes.
- Toepassen van 0,05 bar voor 2.4 s om de oplossing van acetanilide vanaf de punt van de capillaire verdere binnenkant.
- Toepassen van 10,0 kV voor 6 min en detecteren de acetanilide piek bij een golflengte van 200 nm.
- Herhaal stap 4.2.1.1. -4.2.1.6. met behulp van het eiwit proef in plaats van de oplossing van acetanilide en detecteren alle pieken van het eiwit.
- De methode voor de metingen met liganden voor te bereiden.
- Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met een 0,1 M EDTA-oplossing.
- Spoel het capillair voor 1 min bij 2.5 bar met gedeïoniseerd water.
- Spoel het capillair 1,5 min bij 2.5 bar met de ligand-oplossing voor evenwichtsinstelling.
- Injecteer de acetanilide oplossing voor 6 s op 0,05 bar en verandering de inlaat en uitlaat flesjes aan de buffer ligand-bevattende flesjes.
- Toepassen van 0,05 bar voor 2.4 s om de oplossing van acetanilide vanaf de punt van de capillaire verdere binnenkant.
- Toepassen van 10,0 kV voor 6 min en detecteren de acetanilide piek bij een golflengte van 200 nm.
- Herhaal stap 4.2.2.1 - 4.2.2.6 met behulp van de eiwitSteekproef in plaats van de oplossing van acetanilide en detecteren alle pieken van het eiwit.
- Afwisselend Herhaal stap 4.2.1 en 4.2.2 ter berekening van de verandering in de verhoudingen van de charge-grootte van de verschillende interacties van de eiwit-metaal ion (beschreven onder Vertegenwoordiger resultaten).
- De eiwit-oplossing na elke 60 h u wilt wijzigen in een vers.
Opmerking: op dit punt, het experiment kan worden onderbroken. Deze procedure is ten minste herhaalde 10 x voor elke concentratie van de liganden sinds de piek patroon enigszins van run naar run verschilt. Als de oplossing meer dan 60 h gebruikt is, wordt de variaties te groot geworden.
- De eiwit-oplossing na elke 60 h u wilt wijzigen in een vers.
-
Uitvoeren van de methoden
- Voer de methode beschreven onder stap 4.2.2, met behulp van de alkaline earth ligand oplossingen (CaCl2, MgCl2, BaCl2en SrCl2 oplossingen).
- Blijven met behulp van de methode beschreven onder stap 4.2.2, met behulp van de MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2en NiCl2 oplossingen in plaats van de alkaline earth ligand oplossingen.
Opmerking: De laatste overgangsmetalen chloriden bleek sterker interacties met het capillair en kunnen niet volledig worden verwijderd. Het resultaat van deze interacties in verschuivingen in de migratietijd van run naar run. Daarom werden ze onderzocht na de andere metaalionen.
- De methode voor de metingen zonder liganden voor te bereiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de electropherogram voor het AtHIRD11 monster verkregen tijdens de CGE experimenten. De grootte van de peptide neemt toe van links naar rechts. Piek nummer 4 heeft de grootste massa en geeft aan het intact eiwit. De kleinere pieken 2 en 3 vormen kleinere onzuiverheden (bv, afbraakproducten daarvan). De eerste piek en de inconsistentie van de basislijn voor kunnen ook worden gereproduceerd zonder de eiwitSteekproef. Dus, het is verwant met de SDS gel zelf en niet leidt tot een monster-geassocieerde onzuiverheden.
Figuur 2 geeft de electropherogram voor acetanilide tijdens de ACE-experimenten. De oplossing van acetanilide toont slechts 1 hoge piek, aangezien er geen onzuiverheden. De detectie-tijd voor de top van de piek geeft de migratietijd van de stroom van de electroosmotic (tEOF) en wordt gebruikt voor de berekening van de interactie.
Figuur 3 is de electropherogram van het monster AtHIRD11 tijdens de ACE-experiment in de afwezigheid van SDS en metaalionen. Het toont, naast de 2 onzuiverheden uit de CGE electropherogram, ten minste 5 toppen die gerelateerd zijn aan het eiwit zelf. Piek 1 en 2 kan worden toegewezen aan onzuiverheden, aangezien hun migratie tijden geven dat zij kleine of zeer positief geladen zijn. Deze aanname wordt ondersteund door de toename van de piekhoogte en het gebied na verloop van tijd. Aangezien AtHIRD11 pieken 3 en 4 dicht bij het EOF zijn, ze betalen nauwelijks en in elke run niet los kunnen worden gezien. Ze bijna geen interacties Toon en vertegenwoordigen conformaties zonder toegankelijk residuen essentieel is voor de interactie met de metaalionen. AtHIRD11 ziet u verscheidene verschillende gratis-te-grootte-ratio's als gevolg van verschillende effectieve stralen van verschillende conformeren. Deze conformeren kunnen continu samenvoegen. Vervolgens zijn pieken 5-7 ruimer dan de gebruikelijke eiwit pieken. De brede pieken geeft een hint op de kinetiek van de interacties. Aangezien de pieken niet smal, kunnen een snelle en een zeer trage omzetting tussen de verschillende conformeren worden uitgesloten. In beide gevallen zou de pieken basislijn gescheiden4. In dit geval een pre evenwichtsinstelling stap kunt wijzigen het patroon van de piek en een beter inzicht in de interactie met langzamere kinetiek zou geven.
Figuur 4 ziet u dat de grafische evaluatie van de gemeten migratietijd verschuivingen in het bijzijn van de verschillende metaalionen voor piek 6. Het wordt vertegenwoordigd door de berekende waarde ΔR/Rf. Deze waarde geeft aan hoe sterk een verschuiving is (door haar waarde) en de totale verandering van de eiwit-metaal ion complexen heffing (door het teken). Om te differentiëren tussen een belangrijke interactie en een toevallige verschuiving, de betrouwbaarheidsintervallen voor α = 0,05 ook worden berekend. In gevallen waar het betrouwbaarheidsinterval voor het niet met de nullijn is snijden, de interactie wordt beschouwd als zo belangrijk. Resultaten zijn in aanmerking genomen als de top aanwezig in ten minste 6 uit 10 electropherograms was. Piek 6 was niet aanwezig in een run met 500 µM Co2 +. De volledige lijst van de interacties voor elke AtHIRD11 piek is gepubliceerd in een eerder werk door Nachbar et al. 4.
ΔR/Rf wordt berekend met behulp van de migratie tijd verhoudingen Rik (in aanwezigheid van de ligand) en de migratie tijd ratio's Rf (bij gebrek aan de ligand):
Rik en Rf worden berekend met behulp van de piek top tijden teiwit voor de eiwit monster toppen en de overeenkomstige piek hoogste tijd voor de EOF-marker tEOF:
Voor Rikzijn de tijden in de aanwezigheid van het ligand gebruikt en voor Rf, de tijden in afwezigheid.
Figuur 1 : Electropherogram voor de CGE scheiding van het monster AtHIRD11 in gel buffer. Piek 1 en de toppen aan de linkerkant kunnen zelfs zonder injectie van een monster, dus ze artefacten zijn worden waargenomen. Sinds de massa's en de totale piek gebieden van piek 2 en 3 zijn kleiner dan die van piek 4, ze zijn waarschijnlijk onzuiverheden, zoals afbraakproducten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Electropherogram van de EOF-marker acetanilide uitvoeren. De figuur toont slechts 1 piek voor de compound zonder metaalionen en SDS gel-buffer. De tijd van de top van de piek markeert de electroosmotic stroom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Voorbeeld van een electropherogram van de scheiding van het monster tijdens de experimenten van de ACE een complexe piek patroon in de afwezigheid van eventuele metaalionen tonen. Ten minste 7 pieken kunnen worden geïdentificeerd en met betrekking tot het eiwit en de 2 verontreinigingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Grafische evaluatie van het bindingsgedrag richting de onderzochte metaalionen met behulp van een concentratie van 500 µM voor piek 6. De waarden van ΔR/Rf geeft een hint op de intensiteit van de timeshift van de migratie en dus op de sterkte van de conformationele wijzigingen op metaal-ion binding. Het teken van ΔR/Rf geeft aan het complex meer positief dan wel negatief in rekening ten opzichte van de niet-afhankelijke eiwitten gebracht is. De foutbalken geven de betrouwbaarheidsintervallen voor α = 0,05. Vervolgens, zij tonen het gebied waar de ware ΔR/Rf-waarde kan worden gevonden met een zekerheid van 95%. De rode balken geven de berekende resultaten verkregen door onvoldoende gegevens (de piek was aanwezig in minder dan 6 electropherograms). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor alle CE experimenten is de voorbereiding van het capillair een cruciale stap. Aangezien het een glazen buis met een kleine diameter, kan het gemakkelijk breken op de plekken waar de coating wordt verwijderd wanneer het wordt behandeld. De installatie van het capillair in het instrument moet zeer zorgvuldig gebeuren.
De kritische stappen betrokken bij het gebruik van de ACE-methode voornamelijk betrekking hebben op de experimentele opzet. Een andere belangrijke stap is het vinden van de juiste monster injectie parameters. De ingespoten hoeveelheid van het monster moet genoeg zijn voor hoge toppen. Echter zou het overbelasting resulteren in een slecht opgelost piek patroon met overlappende pieken. Als u mindert het geïnjecteerde volume, is het aanbevolen om het verlagen van de druk van de injectie in plaats van de injectie tijd aangezien het duurt enige tijd voor het instrument om te bereiken van de geprogrammeerde injectie druk.
Ongewoon brede pieken kunnen worden gevonden voor verschillende EiwitSteekproeven. Dit patroon kan worden beïnvloed door het verhogen van de spanning. Bijgevolg de pieken krijgen smaller en de tijd van de scheiding wordt verminderd. Niettemin, de scheiding korter kan resulteren in niet-opgelost pieken en de hogere spanning verhoogt de Joule verwarming en beperkt het effect van smalle pieken door elektroforetische dispersie7,8. Daarom moeten de juiste voorwaarden worden bepaald voor elke nieuwe eiwit onderzocht.
De combinatie van CGE en ACE om informatie te verzamelen over het intrinsiek ongeordende karakter van een eiwit en haar bindingsgedrag is een nieuwe benadering. De karakterisering van het monster door gelelektroforese is een noodzakelijke stap om te bewijzen dat elke meerdere pieken waargenomen zijn niet gerelateerd aan onzuiverheden. Het voordeel van CGE is de mogelijkheid om te automatiseren, de korte voorbereidingstijd en een hogere resolutie ten opzichte van de klassieke gel elektroforese9. Met behulp van ACE voor IDP bindend experimenten toont zijn superioriteit tegenover andere testen (bijvoorbeeldmetalen affiniteitchromatografie in de resultaten geïmmobiliseerd) sinds ACE niet alleen bindende gebeurtenissen weergegeven. Bovendien, het scheidt van verschillende conformeren van een eiwit en kan onthullen verschillen in bindende liganden van uiteenlopende conformeren. Dit probleem kan niet worden gedetecteerd door methoden zonder een scheiding tijdens het experiment bindend. Bovendien, is de tijd van de analyse slechts 6 minuten; Daarom kunnen de resultaten worden berekend in een korte hoeveelheid tijd10. Aan de andere kant, komt de snelle analyse met beperkingen bij het schatten van het aantal sites11bindend.
De toekomst van deze benadering ligt in de mogelijkheid om scherm potentiële bindende partners voor eiwitten, met name ontheemden, op een snelle manier. Het geeft een snel overzicht van de verschillende bindende gedrag van de verschillende conformeren aanwezig in een monster. Het gebruik van een grootte-afhankelijke scheiding (bijvoorbeeldCGE) voor de karakterisering van het monster is verplicht omdat ACE zelf geen onderscheid tussen de verontreinigingen en het eiwit zelf maken. CGE geeft echter een idee over het aantal soorten verschillen in de grootte. De toepassing van de aas als een bindende bepaling heeft verlengd al van metaalion liganden tot elk geladen ligand-12. Dus, het u meer informatie wilt over de interacties kunt toevoegen aan een gekenmerkt bindend, aangezien de combinatie van de scheiding en de bindende bepaling in één methode kan getuigen van alle gewijzigde bindingsgedrag van verschillende conformeren en posttranslationele modificaties, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij dankbaar dank Masakuza Hara (het Research Institute of Green Science and Technology, Universiteit van Shizuoka, Japan) voor het verstrekken van de AtHIRD11 EiwitSteekproeven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | - | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
- Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
- Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
- Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
- Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
- Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
- Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
- Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
- Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
- Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
- Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
- Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
- Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).
