Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

פרוטוקול זה משלב האפיון של מדגם חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל נימי הקרנה מחייב מהיר עבור ליגנדים טעון על ידי אלקטרופורזה נימי זיקה. מומלץ חלבונים עם מבנה גמיש, כגון חלבונים המתוסבכים ממהותם, כדי לקבוע את כל ההבדלים ביומן מחייב עבור conformers שונים.

Abstract

הצמחים תלויים חריפה לסביבה שלהם. על מנת להסתגל לשינויים מלחיץ (למשל, הבצורת, מליחות גבוהה), צמחים להתפתח כיתות של חלבונים המתוסבכים מהותית (IDPs) כדי להפחית סטרס חמצוני, osmotic. מאמר זה משתמש בשילוב של נימי בג'ל (CGE) ניידות shift זיקה אלקטרופורזה (ACE) כדי לתאר את התנהגות מחייב conformers שונים של AtHIRD11 IDP מ תודרנית לבנה. CGE משמש כדי לאשר את הטוהר של AtHIRD11 כדי לא לכלול שברים, שינויים posttranslational, זיהומים אחרים כמו סיבות דפוסי השיא מורכב. בחלק זה של הניסוי, הרכיבים דגימה שונים המופרדים באמצעות ג'ל צמיגה בתוך נימי על ידי ההמונים שונים שלהם, מזוהה עם גלאי מערך דיודות. לאחר מכן, אופן הפעולה של איגוד של המדגם כלפי יונים מתכתיים שונים נחקר על ידי אס. במקרה זה, ליגנד נוסף את בופר, המשמרת בזמן ההעברה נמדד על מנת לקבוע אם התרחש אירוע מחייב או לא. אחד היתרונות של שימוש השילוב של CGE ו- ACE כדי לקבוע את אופן הפעולה של איגוד של IDP הוא האפשרות להפוך את בג'ל ו איגוד וזמינותו. יתר על כן, CGE מראה מגבלה נמוכה יותר של זיהוי מאשר בג'ל קלאסית ו ACE יש אפשרות לקבוע את סיבת איגוד של ליגנד בצורה מהירה. בנוסף, ניתן להחיל ACE גם למינים אחרים טעונים יותר יונים מתכתיים. עם זאת, השימוש בשיטה זו עבור איגוד ניסויים היא מוגבלת ביכולתה לקבוע את מספר אתרי קישור. ובכל זאת, השילוב של CGE ו ACE ניתן להתאים עבור אפיון ההתנהגות איגוד של דוגמה חלבון לכיוון ליגנדים טעונה רבים.

Introduction

צמחים הם תלויות יותר לסביבתם מאשר צורות חיים רבות אחרות. מאז צמחים לא ניתן להעביר למקומות אחרים, הם נאלצים להסתגל לשינויים בסביבתם (למשל, הבצורת, ריכוז המלח גבוה וקר). כתוצאה מכך, צמחים פיתח חלבונים מיוחדים מתח כמו dehydrins, אשר למלא משימות סעפת להפחתת מתח התא הקשורים מליחות גבוהה. חלבונים אלה לאגד מים, יונים בתוך תאים, להפחית סטרס חמצוני על-ידי כריכת Cu2 +-יונים, אינטראקציה עם פוספוליפידים, כמו גם את cytoskeletons. יתר על כן, איגוד Zn2 +-יונים מאפשר חלבונים אלה לשמש גורמי שעתוק. היכולת שלהם לאגד Ca2 +-יונים לאחר זרחון היה גם דיווח1.

ההתנהגות משולבות של חלבונים אלה קשורה העדר של חומצת אמינו הידרופוביות משקעים. כתוצאה מכך, הם חסרי כל אינטראקציות הידרופוביות בתוך הרשת פפטיד, גם מבנה מאולצות. עם זאת, כי חלבונים אלה חסרים מבנה מגבילות, הם יכולים לכבוש conformers שונים תחת באותם התנאים. לכן, הם ניתן לתאר בצורה הטובה ביותר כמו הרכב של מבנים, ולא עם קונפורמציה יחיד. חלבונים עם מאפיינים אלה ידועים כמו ממהותם סמוקים חלבונים (IDPs) הם רעיון בשימוש נרחב עבור מתח חלבונים ואת crosstalk בין מסלולים שונים התאים האיקריוטים2.

אחד IDPs אלה הקשורות ללחץ הוא AtHIRD11. זה אחד של תודרנית לבנהרוב מאוד לידי ביטוי בצורת IDPs. לפיכך, ניתן להפריד את conformers שונים על ידי שלהם רדיוס אפקטיבי לחייב יחס, נימי אלקטרופורזה (CE) שימש לחקירה נוספת. ניסויים אייס קודמות הדגימו את האינטראקציות בין AtHIRD11 יונים של מתכות המעבר כגון Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +2 +Ni-יונים. ניתן למצוא את התוצאות המפורטות ב. ההרה et al. 3 ו. Nachbar et al. 4.

שיטת אס שבה ייעשה שימוש כאן מבוסס על עבודותיו שפורסמו קודם לכן6. עם זאת, התוספת של acetanilide סמן EOF לדגימת חלבון אינה מתאימה. AtHIRD11 מראה רחב שיא תבניות, הוספת סמן EOF המדגם להסוות שתי הפסגות. לכן, משמש הסמן ריצה נפרדת. לפני הפעולה מחייב נבדק, הוא אישר כי הפסגות נמצאו במהלך ניסויים קודמים הם מן conformers שונים. לפיכך, CGE משמש כדי להבחין בין conformers חלבון, ששינה post-translational חלבון, זיהומים, כמו שברי AtHIRD11, על-ידי ההמונים שלהם שונה. לאחר מכן, התנהגות AtHIRD11 של המדגם מאופיין מחייב כלפי שונים יונים מתכתיים שונים הוא חקר.

מטרת המאמר היא לתאר את התקנה ניסיונית להבחין בין IDP ורכיבים אחרים של מדגם על מנת להעריך את ההבדלים בהתנהגות איגוד של conformers שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הכלים אלקטרופורזה נימי

  1. להכין את נימי הדם
    1. השימוש לחיתוך זכוכית לחתוך סיליקה התמזגו חשופים נימי עם ציפוי חיצוני פוליאימיד וקוטר פנימי של 50 מיקרומטר 33 ס מ (עבור הניסוי CGE), נימים זמן 30 ס מ (עבור הניסוי ACE). לבצע החיתוך על צלחת זכוכית.
      הערה: 2 כיוונונים ניסיוני שונים פותחו עבור 2 מכשירים שונים. כדי להשתמש בהם על כלים אחרים, העברה שיטה נכונה צריך להתבצע ויש אורך נימי יותאם האורך המותר של המכשיר.
    2. השתמש בעט כדי לסמן באמצע חלון זיהוי רחב 1 ס"מ ממרחק של 24.5 ס"מ מקצה לקצה נימי לניסוי. CGE ו- 21.5 ס מ מקצה לקצה נימי לניסוי אייס (אורך).
    3. הסר את ציפוי חיצוני פוליאימיד הנימים מאת לשרוף אותו עם מבער, 0.5 ס מ לפני ואחרי הסימן. באופן דומה, להשתמש במבער כדי להסיר 1 ס מ של הציפוי בשני הקצוות של הנימים.
      הערה: אורך יעיל עשוי להשתנות מעט מאז זה מסתמך על מכשיר נימי אלקטרופורזה.
    4. לנקות את הקצוות של הנימים והחלונות זיהוי עם אתנול וביו -רקמה רכה.
      הערה: הנימים ללא ציפוי הן פחות גמיש וסביר לשבור.
  2. להתקין את נימי הדם
    1. התקן של נימי לתוך מערכת לספירה עם החלון זיהוי ליד השקע.
      הערה: CE לכלי מודלים שונים יש מערכות אחזקה שונות הנימים. עיין במדריך של המכשיר בשימוש על ההוראות המדויקות.

2. מכינים את הפתרונות

  1. להכין את הפתרונות לניתוח CGE
    1. להכין את טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס)-מאגר מרחביות (100 mM/1% w/v) ב- pH 8.0.
      1. להשתמש מסכה הנשימה ואת תא במשקל 1.00 גר' dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) בתוך 100-מ.
      2. הוסף 1.21 גר' טריס לתוך כשהספל 100 מל ' להמיס באמצעות 50 מ של מים יונים ובר מערבבים מגנטי פגים.
      3. מכניסים אלקטרודה pH של הפתרון ולהתאים את ה-pH ל 8.0 באמצעות 1.0 M HCl.
      4. למלא את הפתרון לתוך בקבוקון הנפחי 100 מ ל ומוסיפים מים יונים עד לסימון. לנער את זה בעדינות כדי למנוע כל ויוצרים קצף.
    2. להכין את הפתרון NaOH 0.1 M.
      1. לשקול g 4.0 של NaOH בבקבוקון הנפחי 100 מ. למלא אותו עד כדי לסמן יונים מים כדי ליצור מניה 1 מ'.
      2. השתמש פיפטה הנורה של 10 מ"ל כדי להעביר 10 מ"ל של פתרון זה עוד 100 מ ל סטריליות ולמלא אותה עד כדי לסמן עם מים יונים.
    3. להכין את הפתרון HCl 0.1 M.
      1. להכניס 10 מיליליטר 10 M HCl 100 מ ל סטריליות באמצעות פיפטה הנפחי של 10 מ"ל ולמלא אותה עד כדי לסמן עם מים יונים. חזור על שלב זה כדי להשיג את ה-M HCl 0.1.
    4. להכין את הפתרון הדגימה.
      1. שוקלים 0.5 מ ג של החלבון לתוך צינור 1 מ"ל. להוסיף 0.5 mL המאגר ג'ל טריס-מרחביות מהשלב 2.1.1 עם micropipette.
      2. להמיס את החלבון ע י ניעור בעדינות כדי למנוע כל ויוצרים קצף והשפלה של החלבון.
        הערה: השתמש ultrasonication אם לא יכול להיות מומס החלבון כפי שמתואר; הימנע כל חימום של הפתרון.
    5. למלא את הפתרונות לתוך הבקבוקונים.
      1. לסנן כל פתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר polyvinylidene פלואוריד (PVDF) סינון באמצעות מזרק נאותה של ישירות לתוך המבחנה.
        הערה: על פתרונות המכיל ג'ל, הלחץ חזרה יכולה להיות גבוהה לאור שלו צמיגות גבוהה.
      2. מכינים צלוחיות 15 בסך ולסמן כל כדי למנוע טעויות בכל.
        1. למלא 3 צלוחיות עם dodecyl זמינים מסחרית נתרן גופרתי (מרחביות) ג'ל בופר ב- pH 8.
          הערה: השימוש חיץ ג'ל מרחביות זמינים מסחרית מספק תוצאות מדויקות יותר.
        2. למלא מבחנה 1 0.1 M NaOH ו- 1 בקבוקון עם 0.1 M HCl עבור שטיפה.
        3. למלא מבחנה 1 הפתרון הדגימה.
        4. למלא 5 מבחנות מים יונים ו- 4 בקבוקונים עם 0.1 מ ל מים יונים (טובלים בקבוקונים).
          הערה: הבקבוקונים וטבלו משמשים בקבוקונים פסולת במהלך שטיפה של נימי לפני כל הפעלה. הקצוות נימי טבל במים כדי לשטוף מכל משקעים ג'ל.
  2. להכין את הפתרונות עבור ניתוח ACE
    1. להכין את הפתרון NaOH 1 מ'.
      1. לשקול g 4.0 של NaOH בבקבוקון הנפחי 100 מ.
      2. למלא אותו עד כדי לסמן יונים מים כדי ליצור מניה 1 מ'.
    2. להכין את החומצה ethylendiaminetetraacetic 0.1 M (EDTA) בפתרון NaOH 0.1 M.
      1. העברת 10 מ"ל של NaOH 0.1 M בבקבוקון הנפחי 100 מ ל באמצעות פיפטה הנורה של 10 מ"ל. למלא אותו עד כדי לסמן את המים יונים.
      2. שוקל 2.42 גר' במשקל בסירה EDTA, לפזר את המתחם מלא ב- 100 מ של 0.1 M NaOH.
    3. הכינו את טריס (30 מ מ) בופר.
      1. להוסיף 3.63 ש g של טריס, 200 מ של מים יונים, וכן בר מערבבים גביע 500 מ"ל. מניחים את הספל על צלחת stir, הפעילו את זה.
      2. מכניסים אלקטרודה מד pH כשהספל ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 0.1 M HCl.
      3. למלא את הפתרון 1 ליטר סטריליות, מילוי עד כדי לסמן את המים יונים.
        הערה: הליך זה יש צורך לחזור או בקבוקון נפח גדול יותר יש צורך מאז יותר מ 1 ליטר נדרש עבור כל ניתוח.
    4. להכין את הזרימה electroosmotic acetanilide (EOF)-מרקר (60 מיקרומטר) פתרון.
      1. להוסיף 6 מ ג של acetanilide ו- 100 מ של טריס מאגר 100 מ ל סטריליות.
      2. לשים על סטריליות באמבט אולטראסוני, הפעילו את זה במשך 30 דקות.
    5. להכין את הפתרון מדגם (1 mg/mL).
      1. לשים צינור microcentrifuge 0.5 mL איזון דיוק והוסף 0.3 מ ג של אבקת AtHIRD11 הליחה לתוך הצינור.
      2. השתמש micropipette כדי להוסיף mL 0.3 של בופר טריס 30 מ מ (pH 7.4) בצינור. לנער את הצינור בקפידה כדי להמיס את החלבון.
    6. הכינו את הפתרונות ליגנד.
      1. להכין את הפתרון CaCl מניות2 (5 מ מ).
        1. לקחת סירה במשקל, שים את זה על איזון האנליטי, שוקל 36.76 מ"ג CaCl2* H2O.
        2. שימוש של micropipette, לשטוף את CaCl2* H2O משקילת סירה לתוך בקבוקון נפח 50 מ עם המאגר טריס מוכן קודם לכן.
        3. למלא את סטריליות המאגר טריס עד לסימון.
      2. הכינו את הפתרונות המניות הנותרים (5 מ מ).
        1. וחזור על שלב מספר 2.2.6.1 באמצעות המתכת אחרים מלחי במקום CaCl2* H2O [MgCl2: מ ג 23.80, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)2: מ ג 52.91, MnCl2: 31.46 מ"ג, SeCl4: מ ג 52.91, CoCl 2* 2 H2o: 41.47 מ"ג, CuCl2* 2 H2o: 42.62 מ"ג, ZnCl2: 3.41 מ"ג, ו- NiCl2* 6-אייץ '-2o: מ"ג 59.43].
          הערה: הפתרון2 ZnCl יש ריכוז של 0.5 מ מ. מאז נצפו חזק אינטראקציות בין היונים נימי החומה הפנימית, הריכוז צומצם לפי פקטור של 104.
      3. להכין את הפתרון2 CaCl מיקרומטר 500.
        1. למלא 10 מ"ל של הפתרון מניות של2 CaCl ולשים אותו סטריליות 100 מ.
        2. למלא את סטריליות בופר טריס לסימן ומנערים את הבקבוקון.
      4. להכין את הפתרון2 CaCl 250 מיקרומטר.
        1. מילוי מ של הפתרון מניות של2 CaCl ולשים אותו סטריליות 100 מ.
        2. למלא את סטריליות בופר טריס לסימן ומנערים את הבקבוקון.
      5. חזור על שלבים 2.2.6.3 ו- 2.2.6.4 עבור מניות פתרונות אחרים.
    7. למלא את פתרונות הבקבוקונים.
      הערה: כל הפעלה חוזרת ונשנית צריך ערכה של כניסת ולשקע בקבוקונים. השימוש של פתרונות ליגנד טריים כניסת, שקע מפחית את המשמרות בזמן ההעברה לאחר כל הפעלה.
      1. למלא את הפתרון2 CaCl מיקרומטר 250 ב מזרק 10 מ"ל.
      2. שם מסנן PVDF מיקרומטר 0.22 על המזרק, לדחוף 2 מ"ל של הפתרון דרך המסנן בעזרת המזרק כדי למחוק פתרון מסונן זה.
      3. למלא 10 מבחנות עד האחסון המרבי המותר הפתרון2 CaCl מיקרומטר 250 הנותרים של המזרק. לסמן כל אחת 250 מיקרומטר CaCl 2 פתרון המבחנה מפרץ צר.
      4. תמלא בקבוקונים 10 עד שהם חצי ממולא עם הפתרון2 CaCl 250 מיקרומטר. לסמן כל אחת 250 מיקרומטר CaCl 2 פתרון המבחנה עודפים.
      5. חזור על שלבים 2.2.7.1 - 2.2.7.4 לפתרונות אחרים מתכת המכילים מלח.
      6. חזור על השלבים עבור כל זוג של בקבוקונים כניסת ולשקע להשתמש במקום זאת את 30 מ מ טריס בופר (pH 7.4).
        הערה: 30 mmol/L טריס מאגר pH 7.4 משמש בין שלשול על מנת לקבל נתונים זמן ההעברה עבור החלבון בהעדר יונים מתכתיים. זה הכרחי כדי להזניח את השינויים ב- EOF.
      7. חזור על השלבים שלעיל בקבוקון אחד להשתמש במקום זאת את acetanilide EOF-מרקר (60 מיקרומטר) פתרון. כמו כן, חזור על שלבים אלה באמצעות הפתרון מדגם (1 מ"ג/מ"ל) במקום.

3. ההפרדה Electrophoretic ג'ל נימי

הערה: להכין את ההפרדה על פי השיטה המתוארת בעבודה הקודמת על-ידי. Nachbar et al. 4.

  1. להכין את הניתוח
    1. במצב נים
      1. הגדר את התרמוסטט 23 ° C.
      2. לרוקן את נימי 10 דקות בבר 2.5 עם 0.1 M NaOH.
      3. לרוקן את נימי עבור 5 דקות בבר 2.0 עם 0.1 M HCl.
      4. לרוקן את נימי למשך 2 דקות בבר 2.0 עם מים יונים.
    2. למלא את מאגר ג'ל מרחביות
      1. למלא עם נימי 10 דקות בבר 2.0 עם המאגר ג'ל מרחביות זמינים מסחרית ב- pH 8.0.
    3. לשטוף את נימי לפני כל הפעלה ההפרדה
      1. לרוקן את נימי למשך 3 דקות בבר 4.0 עם 0.1 M NaOH.
      2. לרוקן את נימי עבור 1 דקות בבר 4.0 עם 0.1 M HCl.
      3. לרוקן את נימי עבור 1 דקות בבר 4.0 עם מים יונים.
      4. לרוקן את נימי 10 דקות בבר 4.0 עם המאגר ג'ל מרחביות.
  2. הפעל את ההפרדה
    1. להזריק את הפתרון דוגמת הניסויים CGE (שלב 2.1.4) hydrodynamically על-ידי החלת בר 0.1 במשך 4 דקות על הים.
    2. החל-16.5 kV, בלחץ של 2.0 בר בשני קצוות נימי במשך 25 דקות.

4. זיקה ניתוח Electrophoretic נימי

הערה: להכין את ההפרדה על פי השיטה המתוארת בעבודות קודמות על ידי. Nachbar et al. 4 ועמנואל ואח . 5.

  1. במצב נים
    1. הגדר את התרמוסטט 23 ° C.
      הערה: הטמפרטורה משמש על פי פרוטוקולים שפורסמו, ניתן לשנות אחרים הטמפרטורות4,5. עם זאת, הגומלין תלויים בטמפרטורה, ישתנו בהתאם.
    2. ריקון של נימי למשך 40 דקות בבר 2.5 עם 0.1 M NaOH.
    3. לרוקן את נימי 10 דקות בבר 1.0 עם מים יונים.
    4. לרוקן את נימי למשך 30 דקות בבר 1.0 באמצעות בופר טריס 30 מ מ (pH 7.4).
  2. הכנה השיטות אייס
    1. הכינו את שיטת המדידות ללא ליגנדים.
      הערה: Acetanilide לא נוספה הפתרון הדגימה, כפי שהוא הטוב 2 חלבון פסגות.
      1. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות בבר 2.5 עם פתרון EDTA 0.1 M.
      2. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות ב- 2.5 בר עם מים יונים.
      3. לשטוף את נימי עבור מינימום 1.5-2.5 בר עם בופר טריס עבור equilibration.
      4. להזריק את הפתרון acetanilide 6 s-בר 0.05 ושינוי לים ו עודפים הבקבוקונים על הבקבוקונים מאגר טריס.
      5. החל בר 0.05 עבור 2.4 s כדי לדחוף את הפתרון acetanilide מהקצה הפנימי נוספת נימי.
      6. החלת 10.0 kV במשך 6 דקות לזהות הפסגה acetanilide באורך-גל של 200 ננומטר.
      7. חזור על שלבים 4.2.1.1. -4.2.1.6. בעזרת החלבון לדגום במקום הפתרון acetanilide ולגלות את כל הפסגות חלבון.
    2. הכינו את שיטת המדידות עם ליגנדים.
      1. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות בבר 2.5 עם פתרון EDTA 0.1 M.
      2. יש לשטוף את נימי עבור 1 דקות ב- 2.5 בר עם מים יונים.
      3. לשטוף את נימי עבור מינימום 1.5-2.5 בר עם הפתרון ליגנד equilibration.
      4. להזריק את הפתרון acetanilide 6 s-בר 0.05 ושינוי לים ו עודפים הבקבוקונים על הבקבוקונים מאגר המכיל ליגנד.
      5. החל בר 0.05 עבור 2.4 s כדי לדחוף את הפתרון acetanilide מהקצה הפנימי נוספת נימי.
      6. החלת 10.0 kV במשך 6 דקות לזהות הפסגה acetanilide באורך-גל של 200 ננומטר.
      7. חזור על שלבים 4.2.2.1 - 4.2.2.6 באמצעות המדגם חלבון במקום הפתרון acetanilide, לזהות את כל הפסגות חלבון.
    3. לסירוגין חזור על שלבים 4.2.1 ו 4.2.2 כדי לחשב את השינוי שחל יחס גודל תשלום עבור אינטראקציות חלבון-מטאל יון שונים (המתוארים תחת נציג תוצאות).
      1. לשנות את הפתרון חלבון לאחר h 60 בכל אחד טרי.
        הערה: בשלב זה, הניסוי ניתן להשהות. ההליך זה חוזר ונשנה לפחות 10 x עבור כל ריכוז ליגנדים מאז דפוס שיא משתנה מעט מן לרוץ לרוץ. אם הפתרון משמש יותר מ 60 h, הווריאציות יגדל יתר על המידה.
    4. הפעל את השיטות
      1. הפעל את השיטה המתוארת תחת שלב 4.2.2, באמצעות הפתרונות ליגנד עפרורית (CaCl2, MgCl2, BaCl2, ופתרונות SrCl2 ).
      2. המשך באמצעות השיטה המתוארת תחת שלב 4.2.2, באמצעות את MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2ו- NiCl2 פתרונות במקום הפתרונות ליגנד עפרורית.
        הערה: כלורידים מתכות מעבר האחרון הראה אינטראקציות חזקה עם נימי ואין אפשרות להסירה לחלוטין. התוצאה אינטראקציות אלה משמרות בזמן ההעברה לרוץ לרוץ. כתוצאה מכך, הם נחקרו לאחר יונים מתכתיים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את electropherogram עבור הדגימה AtHIRD11 שהתקבל במהלך הניסויים CGE. גודל פפטיד עולה משמאל לימין. שיא מספר 4 כולל הכמות הגדולה ביותר, מציין את חלבון שלם. הפסגות קטנים 2 ו- 3 מייצגים זיהומים קטנים יותר (למשל, השפלה מוצרים). השיא הראשון, את חוסר העקביות של התוכנית הבסיסית לפני יכול גם להיות לשכפל ללא המדגם חלבון. לכן, זה קשור זמנים תוססים ג'ל עצמה, לא מייצג כל הטומאות הקשורים הדגימה.

איור 2 מייצג את electropherogram עבור acetanilide במהלך הניסויים אייס. הפתרון acetanilide מציג רק 1 שיא מאז. צריך להיות ללא זיהומים. זיהוי זמן מרבי הפסגה מציין את זמן ההעברה של הזרם electroosmotic (tEOF) והוא משמש לחישוב של האינטראקציה.

איור 3 הוא electropherogram של המדגם AtHIRD11 במהלך הניסוי אייס בהיעדר מרחביות, יונים מתכתיים. זה מראה, מלבד הטומאה 2 מ- electropherogram CGE, לפחות 5 פסגות אשר קשורות החלבון עצמו. ניתן להקצות שיא 1 ו- 2 דברים טמאים מאז זמני ההעברה שלהם לציין שהן קטנות או הטעון חיובית מאוד. הנחה זו נתמכת על ידי עליית גובה שיא ואזור לאורך זמן. מאז פסגות AtHIRD11 3 ו- 4 קרובים EOF, הם בקושי מחויב ולא ניתן להפרידה לטווח הארוך בכל. הם כמעט להראות אין אינטראקציות ולייצג הייצורים החיים ללא חיוני שהאינטראקציות עם היונים מתכת נגיש משקעים. AtHIRD11 מציג מספר תשלום-כדי-גודל-יחסים שונים עקב רדיוס אפקטיבי שונים של conformers שונים. Conformers אלה ניתן למזג באופן רציף. לאחר מכן, פסגות 5-7 עובדים מהאוכלוסיה הפסגות חלבון הרגיל. הפסגות רחבה לתת רמז על קינטיקה של האינטראקציות. מאז הפסגות אינם צרים, מהיר, המרה איטית מאוד בין conformers שונים יכול להיות לא נכלל. בשני המקרים, הפסגות יהיה מופרד בסיסית4. במקרה זה, צעד equilibration מראש יכול לשנות את דפוס שיא, היה נותן תובנה טובה יותר לתוך שהאינטראקציות עם קינטיקה איטית יותר.

איור 4 מראה שגרפי הערכת זמן ההעברה נמדד משמרות בנוכחות יונים מתכתיים שונים עבור שיא 6. זה מיוצג על ידי ΔR/Rfהערך המחושב. ערך זה מציין משמרת כמה חזק הוא (על-ידי הערך שלה) ואת השינוי הכולל של עלות מתחמי יון מתכת חלבון (על-ידי הסימן שלו). על מנת להבדיל בין של אינטראקציה משמעותית, שינוי מקרי, מרווחי הביטחון α = 0.05 מחושבים גם כן. במקרים שבהם הסמך לא מצטלבים עם קו אפס, האינטראקציה נחשב משמעותי. תוצאות נלקחים בחשבון אם השיא היה נוכח לפחות 6 מתוך 10 electropherograms. שיא 6 לא היה נוכח בכל ריצה עם 500 מיקרומטר Co2 +. הרשימה המלאה של האינטראקציות עבור כל שיא AtHIRD11 לאור בעבודה קודמת. Nachbar et al. 4.

ΔR/Rf מחושבת באמצעות יחסי זמן ההעברה Rאני (בנוכחות ליגנד) ולא את היחס זמן ההעברה Rf (בהיעדר ליגנד):

Equation 1

Rאני ו- Rf מחושבים באמצעות פעמים בראש הפסגה tחלבון הפסגות מדגם חלבון ואת הזמן העליון המקביל שיא עבור דה מרקר-EOF tEOF:

Equation 2

עבור Rאני, הטיימס בנוכחות ליגנד הן בשימוש עבור Rf, טיימס בהעדרו.

Figure 1
איור 1 : Electropherogram לצורך הקמת מכשול ההפרדה CGE מדגם AtHIRD11 במאגר ג'ל. הפסגה 1 ואל הפסגות בצד שמאל שלו ניתן לצפות גם בלי זריקה לדוגמה, ולכן הם חפצים. מאז ההמונים לבין הכולל תחומי שיא שיא 2 ו- 3 הם קטנים יותר מאשר זו של שיא 4, הם זיהומים סביר, כמו מוצרי השפלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Electropherogram של acetanilide EOF-marker לרוץ. האיור מציג רק 1 שיא עבור המתחם ללא יונים מתכתיים כל מאגר ג'ל מרחביות. שעת שיא העליון מסמן את הזרימה electroosmotic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : לדוגמה עבור electropherogram ההפרדה מדגם במהלך הניסויים אייס מציג תבנית שיא מורכבים, בהעדר כל יונים מתכתיים. לפחות 7 פסגות יכול להיות מזוהה, הקשורים החלבון וזוהמה 2 שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : הערכה גרפי של התנהגות מחייב כלפי היונים מתכת ובדוקים באמצעות ריכוז של מיקרומטר 500 עבור שיא 6. הערכים של ΔR/Rf לתת רמז על האינטנסיביות של משמרת זמן ההעברה ולכן על השינויים הסתגלותי על יון מתכת מחייב. הסימן של ΔR/Rf מציין אם המתחם יותר באופן חיובי או שלילי מחויב בהשוואה החלבון לא מאוגד. קווי השגיאה מצביעות על מרווחי הביטחון של α = 0.05. לאחר מכן, הם מראים את האזור שבו אמת ΔR/Rf-ערך ניתן למצוא בוודאות של 95%. הסורגים האדומים מציינים מחושבים התוצאות המתקבלות על-ידי נתונים מספיקים (השיא היה נוכח electropherograms פחות מ 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבור כל הניסויים לסה נ, הכנת נימי הוא שלב קריטי. מאז זה צינור זכוכית עם קוטר קטן, יכול להינתק בקלות בנקודות היכן הציפוי יוסר בעת זה בטיפול. התקנת נימי לתוך הכלי צריך להיעשות בזהירות רבה.

הצעדים קריטיים הכרוכים אייס בשיטת בעיקר מתייחסים הגדרת הניסוי. עוד צעד קריטי הוא מציאת הפרמטרים הזרקה מדגם הנכון. הסכום מוזרק המדגם צריך להיות מספיק בשביל פסגות גבוהות. עם זאת, עומס יתר זה יגרום תבנית שיא לקוי נפתרה עם חופפים פסגות. כאשר הפחתת האחסון מוזרק, מומלץ להקטין את הלחץ הזרקת הזמן הזרקת מאז זה לוקח קצת זמן עבור כלי להגיע הלחץ הזרקת מתוכנתים.

פסגות הרחב ניתן למצוא דוגמאות חלבונים שונים. דפוס זה יכול להיות מושפע על ידי הגדלת המתח. כתוצאה מכך, הפסגות להיות צר יותר, הפעם ההפרדה מצטמצם. ובכל זאת, הפעם ההפרדה קצרה עלולה לגרום פיקס לא נפתרה, המתח גבוה יותר מגדיל את ג'ול חימום ומגביל את ההשפעה של פסגות צר על ידי פיזור electrophoretic7,8. לכן, התנאים הנכונים צריך להיקבע עבור כל חלבון חדש בדק.

שילוב CGE ו ACE כדי לאסוף מידע אודות הדמות ממהותם המתוסבכים של חלבון, אופן הפעולה שלו מחייב הוא גישה מוזרה. אפיון המדגם על ידי אלקטרופורזה בג'ל היא שלב הכרחי כדי להוכיח כי כל פסגות מרובים נצפתה שאינן קשורות לזיהומים. היתרון של CGE הוא האפשרות להפוך אותו, זמן הכנה קצר יותר, ו ברזולוציה גבוהה יותר בהשוואה קלאסית ג'ל אלקטרופורזה9. באמצעות אס עבור IDP מחייב ניסויים מראה את עליונותה לקראת מבחני אחרים (למשל, מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת בתוצאות) מאז אייס לא רק מראה איגוד אירועים. יתר על כן, הוא מפריד בין conformers שונים של חלבון, יכול לגלות הבדלים ליגנדים איגוד של conformers מגוונות. התנהגות זו לא ניתן לאתרם באמצעות שיטות ללא הפרדה במהלך הניסוי מחייב. בנוסף, הזמן ניתוח הוא רק 6 דקות; לכן, ניתן לחשב את התוצאות כמות קצרה של זמן10. מצד שני, ניתוח מהיר מגיע עם מגבלות להערכת מספר מחייב אתרי11.

העתיד של גישה זו טמונה האפשרות לשותפים איגוד פוטנציאליים מסך, חלבונים, במיוחד IDPs, באופן מהיר. זה נותן סקירה מהירה על התנהגות קישור שונים conformers שונים הנוכח במדגם. השימוש של פרידה תלויי-גודל (למשל, CGE) עבור דוגמה האפיון הוא חובה מאז אייס עצמו לא יכול להבחין בין זיהומים לבין החלבון עצמו. עם זאת, CGE נותן מושג על מספר המינים בגדלים שונים. היישום של אייס כמו איגוד וזמינותו הוארכה כבר מ יון מתכת ליגנדים ליגנד טעונה כל12. לכן, זה יכול להוסיף פרטים נוספים בקשר הגומלין לכל מאופיין מחייב, מאז השילוב של ההפרדה ואת וזמינותו מחייבת בשיטה אחת יכולה לתת עדות כל התנהגות מחייב שינוי של conformers שונים, שינויים posttranslational, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו אסירי תודה Masakuza ההרה (מחקר מכון של ירוק המדע והטכנולוגיה, אוניברסיטת של שיזאוקה, יפן) למתן את דגימות חלבון AtHIRD11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

ביוכימיה גיליון 138 חלבונים המתוסבכים ממהותם זיקה נימי אלקטרופורזה בג'ל נימי איגוד וזמינותו ליגנדים מתכת dehydrins AtHIRD11
ניתוח של הפרעה פנימית AtHIRD11 ואיגוד לקראת יוני מתכת על ידי נימי אלקטרופורזה בג'ל אלקטרופורזה נימי זיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter