Analyse av AtHIRD11 iboende forstyrrelse og bindende mot metall ioner av kapillær Gel gelelektroforese og affinitet kapillært geleelektroforese

Summary

Denne protokollen kombinerer karakterisering av et protein utvalg av kapillær gel gelelektroforese og en rask-bindende screening for ladet ligander ved affinitet kapillært geleelektroforese. Det anbefales for proteiner med en fleksibel struktur, som egentlig uordnede proteiner, å avgjøre eventuelle forskjeller i bindingen for forskjellige conformers.

Abstract

Planter er sterkt avhengig av miljøet. For å justere stressende endringer (f.eks, tørke og hřy salinitet), utvikles høyere planter klasser av egentlig uordnede proteiner (internt fordrevne) å redusere osmotisk og oksidativt stress. Denne artikkelen bruker en kombinasjon av kapillær gel gelelektroforese (CGE) og mobilitet Skift affinitet geleelektroforese (ACE) for å beskrive bindende atferden til ulike conformers av IDP-AtHIRD11 fra Arabidopsis thaliana. CGE brukes til å bekrefte renheten av AtHIRD11 og utelate fragmenter, posttranslational modifikasjoner og andre urenheter som årsaker til komplekse topp mønstre. I denne delen av eksperimentet, er forskjellige utvalg komponentene atskilt med en tyktflytende gel inne en kapillær av deres forskjellige massene og oppdaget med en diode array detektor. Etterpå er bindende virkemåten av prøven mot ulike metall ioner undersøkt av ACE. I dette tilfellet ligand legges til buffer løsning og skifte i overføringstid måles for å fastslå om en bindende hendelse har skjedd eller ikke. En av fordelene med å bruke kombinasjonen av CGE og ess til Renseinnstillingene bindende en IDP er muligheten til å automatisere gel gelelektroforese og bindende analysen. Videre CGE viser en nedre grense for påvisning enn klassisk gel geleelektroforese og ess er kjøpedyktig fastsette slags binding en ligand på en rask måte. I tillegg kan ess også brukes til andre ladet arter enn metall ioner. Men er bruk av denne metoden for bindende eksperimenter begrenset i sin evne til å bestemme antall bindende. Likevel, kombinasjonen av CGE og ess kan tilpasses for å karakterisere bindende virkemåten til enhver protein prøven mot mange ladet ligander.

Introduction

Planter er mer avhengig av miljøet enn mange andre livsformer. Siden planter ikke kan flytte til andre steder, må de justere endringer i deres omgivelser (f.eks, tørke, kald og høy salt konsentrasjoner). Derfor utviklet høyere planter spesialiserte stress proteiner som dehydrins, som oppfyller mange oppgaver for å redusere celle stress relatert til høyt salt. Disse proteinene binde vann og ioner i cellene, redusere oksidativt stress ved å binde Cu^{2 +}-ioner, og samhandle med fosfolipider som cytoskeletons. Videre bindende Zn^{2 +}-ioner lar disse proteinene som transkripsjonsfaktorer. Deres evne til å binde Ca^{2 +}-ioner etter fosforylering har også vært rapportert¹.

Multifunksjonelle virkemåten til disse proteinene er relatert til fravær av hydrofobe aminosyre rester. Derfor mangler de noen hydrofobe interaksjoner innenfor peptid kjeden samt en begrenset struktur. Fordi disse proteinene mangler en restriktiv struktur, kan de imidlertid oppta forskjellige conformers under like forhold. Derfor kan de beskrives best som et ensemble av strukturer i stedet for en enkelt konformasjon. Proteiner med disse egenskapene er kjent som egentlig uordnede proteiner (internt fordrevne) og er en mye brukt begrep for stress proteiner og crosstalk mellom forskjellige baner i eukaryote celler².

En av disse stress-relaterte internflyktninger er AtHIRD11. Det er en av Arabidopsis thalianade fleste svært tørke-uttrykt internflyktninger. Derfor de forskjellige conformers kan skilles av deres effektiv radius lade forholdet, og capillary geleelektroforese (CE) har blitt brukt for videre undersøkelser. Tidligere ess eksperimenter vist samspillet mellom AtHIRD11 og overgang metall ioner som Cu^{2 +}- Zn^{2 +}-, Co^{2 +}og Ni^{2 +}-ioner. Den detaljerte resultatet finner du i Hara et al. ³ og Nachbar et al. ⁴.

ACE metoden som brukes her er basert på våre tidligere publiserte arbeider⁶. Men er tillegg av EOF markør acetanilide til protein prøven ikke egnet. AtHIRD11 viser bred topp mønstre og legge EOF markøren til prøven vil skjule to toppene. Derfor brukes markøren i en separat. Før bindingen virkemåten er undersøkt, er det bekreftet at toppene funnet under forrige eksperimenter er fra ulike conformers. Dermed CGE brukes til å skille mellom protein conformers, det post-translasjonell endret protein og urenheter, som fragmenter av AtHIRD11, av deres forskjellige massene. Deretter er preget AtHIRD11 prøvens bindende oppførsel mot ulike ulike metall ioner undersøkt.

Formålet med denne artikkelen er å beskrive en eksperimentelle oppsett for å skille mellom en IDP og andre komponenter i et utvalg for å vurdere forskjellene i bindingen virkemåten til forskjellige conformers.

Protocol

1. forberedelse av kapillær geleelektroforese instrumenter

1. Forberede kapillærene
   1. Bruk en glass kutter for å kutte en bart-smeltet silica kapillær med en polyimid (pi) eksterne belegg og en diameter på 50 µm i 33 cm (for CGE eksperimentet) og 30 cm (ess eksperimentet) lang kapillærer. Utfør kutte en glassplate.
      Merk: 2 annerledes eksperimentell oppsett ble utviklet for 2 ulike instrumenter. For å bruke dem på andre instrumenter, riktig metode overføring skal utføres og kapillær lengden justeres tillatte lengden på apparatet.
   2. Bruk en penn for å merke midt i en 1 cm bredt oppdagelsen vinduet i en avstand på 24,5 cm fra den ene enden av capillary for CGE eksperimentet og på 21,5 cm fra den ene enden av capillary for ACE eksperimentet (effektiv lengde).
   3. Fjern polyimid (pi) eksterne belegget fra kapillærene ved å brenne den med en blowtorch, 0,5 cm før og etter merket. Tilsvarende bruk av blowtorch for å fjerne 1 cm Beleggets i begge ender av kapillærer.
      Merk: Den effektive lengden kan variere litt siden den er avhengig av kapillær geleelektroforese apparatet brukes.
   4. Rengjør endene av kapillærene og gjenkjenning av windows med etanol og en myk vev.
      Merk: Ubestrøket kapillærene er mindre fleksible og sannsynlig brudd.
2. Installere kapillærene
   1. Installere en kapillær inn i CE system med oppdagelsen vinduet uttaket.
      Merk: Ulike CE instrument modellene har forskjellige holder systemer for kapillærene. Se manualen for brukte instrumentet for nøyaktige instruksjoner.

2. Forbered løsninger

1. Utarbeide løsninger for CGE analyse
   1. Forberede tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)-SDS buffer (100 mM/1% w/v) ved pH 8.0.
      1. Bruk en åndedretts maske og en messe for veiing 1.00 g av natrium dodecyl sulfate (SDS) i et 100-mL beaker.
      2. Legg 1.21 g Tris til 100 mL begeret og oppløse den med 50 mL deionisert vann og magnetic røre bar på en magnetisk rørestang.
      3. Sett en pH elektrode i løsningen og justere pH til 8.0 bruker 1,0 M HCl.
      4. Fylle ut løsningen i en 100 mL volumetriske kolbe og legge deionisert vann opp til merket. Riste den forsiktig for å unngå eventuelle skum dannes.
   2. Forberede 0.1 M NaOH løsningen.
      1. Veie 4.0 g av NaOH i en 100 mL volumetriske kolbe. Fylle den opp til merket med deionisert vann for å lage en 1 M lager.
      2. Bruke en 10 mL pære pipette Overfør 10 mL av denne løsningen i en annen 100 mL volumetriske kolbe og fylle den opp til merket med deionisert vann.
   3. Forberede 0.1 M HCl løsning.
      1. 10 mL av 10 M HCl inn en 100 mL volumetriske kolbe bruker en 10 mL volumetriske pipette og fylle den opp til merket med deionisert vann. Gjenta dette trinnet for å få den 0.1 M HCl.
   4. Forberede prøven løsningen.
      1. Veie 0,5 mg av proteinet i en 1 mL tube. Legg til 0,5 mL Tris-SDS gel bufferen fra trinn 2.1.1 brønnene med.
      2. Oppløse protein av risting forsiktig for å unngå skum dannes og nedbrytning av protein.
         Merk: Bruk ultrasonication hvis protein ikke kan løses som beskrevet; unngå alle oppvarming av løsningen.
   5. Fylle ut løsninger i hetteglass.
      1. Filtrere hver løsning gjennom en 0.22 µm polyvinylidene fluor (PVDF) filtrere ved hjelp av en tilstrekkelig sprøyte direkte i ampullen.
         Merk: For de gel inneholder løsningene, mottrykk være høyt på grunn av dens høy viskositet.
      2. Forberede 15 ampuller totalt og merke hver for å unngå eventuelle mix-ups.
         1. Fyll 3 ampuller med en kommersielt tilgjengelig natrium dodecyl sulfate (SDS) gel buffer ved pH 8.
            Merk: Bruk av en kommersielt tilgjengelig SDS gel buffer gir mer presise resultater.
         2. Fyll 1 hetteglass med 0.1 M NaOH og 1 hetteglass med 0.1 M HCl for spyling.
         3. Fyll 1 hetteglass med prøve løsningen.
         4. Fylle 5 ampuller med deionisert vann og 4 flasker med 0,1 mL deionisert vann (dipping ampuller).
            Merk: Dipping hetteglass brukes som avfall ampuller i spyle av kapillær før hver kjøre. Kapillær endene er dyppet i vann for å skyll av gel rester.
2. Utarbeide løsninger for ACE analyse
   1. Forberede 1 M NaOH løsningen.
      1. Veie 4.0 g av NaOH i en 100 mL volumetriske kolbe.
      2. Fylle den opp til merket med deionisert vann for å lage en 1 M lager.
   2. Forberede 0.1 M ethylendiaminetetraacetic syre (EDTA) i en 0.1 M NaOH løsning.
      1. Overfør 10 mL av 0.1 M NaOH i en 100 mL volumetriske bolle med en 10 mL pære pipette. Fylle den opp til merket med deionisert vann.
      2. Veie 2.42 g av EDTA på en veiing båt og oppløse solid sammensatte i den 100 mL 0.1 M NaOH.
   3. Forberede Tris buffer (30 mM) løsning.
      1. Legg 3.63 g Tris, 200 mL deionisert vann og rør bar i et 500 mL beaker. Plasser begeret på en røre plate og slå den på.
      2. En pH meter elektrode innlegge begeret og justere pH 7,4 bruker 0.1 M HCl.
      3. Fyll løsningen i en 1 L volumetriske kolbe og fyll opp til merket med deionisert vann.
         Merk: Denne fremgangsmåten må gjentas eller en større volumetriske kolbe er nødvendig siden mer enn 1 L er nødvendig for hele analysen.
   4. Forberede acetanilide electroosmotic strømmen (EOF)-markør (60 µM) løsning.
      1. Legge til 6 mg av acetanilide og 100 mL Tris buffer i en 100 mL volumetriske kolbe.
      2. Sett volumetriske kolbe i ultralydbad og slå den på i 30 min.
   5. Forberede prøven (1 mg/mL) løsningen.
      1. Sette en 0,5 mL microcentrifuge rør på en presisjon balanse og Legg 0,3 mg frysetørket AtHIRD11 pulver i røret.
      2. Bruk brønnene 0,3 mL av en 30 mM Tris buffer (pH 7.4) i røret. Riste røret nøye å oppløse protein.
   6. Forberede ligand løsninger.
      1. Forberede CaCl₂ (5 mM) lager løsningen.
         1. Ta veiing båten, satte den på en analytical balanse og veie 36.76 mg av CaCl₂* H₂O.
         2. Ved hjelp av brønnene, flush CaCl₂* H₂O fra vekt båt i en 50 mL volumetriske flasken tidligere utarbeidet Tris bufferen.
         3. Fyll volumetriske kolbe med Tris bufferen opp til merket.
      2. Forberede den gjenværende lager løsninger (5 mM).
         1. Gjenta trinn 2.2.6.1 med andre metall salter i stedet for CaCl₂* H₂O [MgCl₂: 23.80 mg, BaCl₂: 26.02 mg, Sr (ingen₃)₂: 52.91 mg, MnCl₂: 31.46 mg, SeCl₄: 52.91 mg, CoCl ₂* 2 H₂O: 41.47 mg, CuCl₂* 2 H₂O: 42.62 mg, ZnCl₂: 3.41 mg og NiCl₂* 6 H₂O: 59.43 mg].
            Merk: ZnCl₂ løsningen har en konsentrasjon av 0,5 mM. Siden sterk interaksjoner mellom ionene og indre kapillær veggen ble observert, konsentrasjonen ble redusert med en faktor på 10⁴.
      3. Forberede 500 µM CaCl₂ løsningen.
         1. Fyll 10 mL av CaCl₂ lager løsningen og putte den i en 100 mL volumetriske kolbe.
         2. Fyll volumetriske flasken med en Tris buffer til merke og riste flasken.
      4. Forberede 250 µM CaCl₂ løsningen.
         1. Fyll 5 mL av CaCl₂ lager løsningen og putte den i en 100 mL volumetriske kolbe.
         2. Fyll volumetriske flasken med en Tris buffer til merke og riste flasken.
      5. Gjenta trinn 2.2.6.3 og 2.2.6.4 for andre lager løsninger.
   7. Fyll løsningene i hetteglass.
      Merk: Hver gjentatte kjører trenger et sett med innløp og utløp hetteglass. Bruk av fersk ligand løsninger på innløp og utløp reduserer forskyvningene i overføringstiden etter hver.
      1. Fyll 250 µM CaCl₂ løsningen i en 10 mL sprøyte.
      2. Sette et 0.22 µm PVDF filter på sprøyten og trykk 2 mL løsningen gjennom filteret sprøyten for å forkaste denne filtrerte løsningen.
      3. Fyll 10 flasker til det maksimale tillatte volumet med gjenværende 250 µM CaCl₂ løsning av sprøyten. Merke hvert som 250 µM CaCl ₂ løsning innløp hetteglass.
      4. Fylle 10 ampuller før de er halv fylt med 250 µM CaCl₂ løsningen. Merke hvert som 250 µM CaCl ₂ løsning stikkontakt hetteglass.
      5. Gjenta trinn 2.2.7.1 - 2.2.7.4 de andre metall salt inneholder løsninger.
      6. Gjenta trinnene for hver par innløp og utløp ampuller bruke 30 mM Tris buffer (pH 7.4) løsning i stedet.
         Merk: 30 mmol/L Tris buffer pH 7.4 brukes mellom går for å få overføringen tidsdata for protein i fravær av metall ioner. Det er nødvendig for å overse endringer i EOF.
      7. Gjenta trinnene ovenfor for en flaske med acetanilide EOF-markør (60 µM) løsning i stedet. Også gjenta trinnene bruker utvalg (1 mg/mL)-løsning i stedet.

3. kapillær Gel Electrophoretic separasjon

Merk: Forberede separasjon etter metoden beskrevet i tidligere arbeid av Nachbar et al. ⁴.

1. Forberede analyse
   1. Tilstand av kapillær
      1. Angi termostaten til 23 ° C.
      2. Skyll av kapillær i 10 min på 2,5 bar med 0.1 M NaOH.
      3. Skyll av kapillær i 5 min på 2,0 bar med 0.1 M HCl.
      4. Skyll av kapillær i 2 minutter på 2,0 bar med deionisert vann.
   2. Fyll ut SDS gel bufferen
      1. Fyll en kapillær i 10 min 2.0 baren med den kommersielt tilgjengelige SDS gel bufferen ved pH 8.0.
   3. Flush av kapillær før hver separasjon kjøre
      1. Skyll av kapillær for 3 min 4.0 bar med 0.1 M NaOH.
      2. Skyll av kapillær for 1 min 4.0 bar med 0.1 M HCl.
      3. Skyll av kapillær for 1 min 4.0 bar med deionisert vann.
      4. Skyll av kapillær i 10 min 4.0 bar med SDS gel bufferen.
2. Kjøre separasjon
   1. Injisere prøve løsningen for CGE eksperimenter (trinn 2.1.4) hydrodynamically ved å bruke 0,1 bar 4 min på innløpet.
   2. Bruke-16.5 kV og et trykk 2.0 bar i begge ender av kapillær for 25 min.

4. affinitet kapillær Electrophoretic analyse

Merk: Forberede separasjon etter metoden beskrevet i tidligere arbeider av Nachbar et al. ⁴ og Alhazmi et al. ⁵.

1. Tilstand av kapillær
   1. Angi termostaten til 23 ° C.
      Merk: Temperaturen brukes ifølge publiserte protokoller og kan endres til andre temperaturer^4,5. Men interaksjoner er avhengig av temperaturen og endres tilsvarende.
   2. Tømme en kapillær for 40 min på 2,5 bar med 0.1 M NaOH.
   3. Skyll av kapillær i 10 min på 1,0 bar med deionisert vann.
   4. Skyll av kapillær i 30 min på 1,0 bar med en 30 mM Tris buffer (pH 7.4).
2. Forberedelse til metodene ess
   1. Forberede metoden for målingene uten ligander.
      Merk: Acetanilide ble ikke lagt til prøve løsningen, som det forkledninger 2 protein topper.
      1. Skyll av kapillær for 1 min på 2,5 bar med en 0.1 M EDTA løsning.
      2. Skyll av kapillær for 1 min på 2,5 bar med deionisert vann.
      3. Skyll av kapillær for 1,5 min på 2,5 bar med en Tris buffer for balanse.
      4. Injisere den acetanilide løsningen for 6 s på 0,05 bar og endre innløp og utløp ampuller til Tris buffer hetteglass.
      5. Bruke 0,05 bar for 2.4 s for å presse den acetanilide løsningen fra spissen av kapillær ytterligere innsiden.
      6. Bruke 10.0 kV for 6 min og oppdage acetanilide toppen på en bølgelengde på 200 nm.
      7. Gjenta 4.2.1.1. -4.2.1.6. bruke protein smak i stedet for den acetanilide løsningen og oppdage alle protein toppene.
   2. Forberede metoden for målingene med ligander.
      1. Skyll av kapillær for 1 min på 2,5 bar med en 0.1 M EDTA løsning.
      2. Skyll av kapillær for 1 min på 2,5 bar med deionisert vann.
      3. Skyll av kapillær for 1,5 min på 2,5 bar med ligand løsningen for balanse.
      4. Injisere den acetanilide løsningen for 6 s på 0,05 bar og endre innløp og utløp ampuller til ligand inneholder bufferen hetteglass.
      5. Bruke 0,05 bar for 2.4 s for å presse den acetanilide løsningen fra spissen av kapillær ytterligere innsiden.
      6. Bruke 10.0 kV for 6 min og oppdage acetanilide toppen på en bølgelengde på 200 nm.
      7. Gjenta 4.2.2.1 - 4.2.2.6 med protein prøven i stedet for den acetanilide løsningen og oppdage alle protein toppene.
   3. Vekselvis Gjenta trinn 4.2.1 og 4.2.2 for å beregne endringen i kostnad-størrelse prosenter for ulike protein-metal ion samhandlinger (beskrevet under Representant resultater).
      1. Endre protein løsningen etter hver 60 h til en ny en.
         Merk: på dette punktet, eksperimentet kan pauses. Denne fremgangsmåten er minst gjentatte 10 x for hver konsentrasjon av ligander siden mønster topp varierer litt fra kjøre å kjøre. Hvis løsningen brukes lenger enn 60 h, blitt variasjonene for stor.
   4. Kjøre metodene
      1. Kjør metoden beskrevet under trinn 4.2.2, bruker alkaliske ligand løsninger (CaCl₂, MgCl₂, BaCl₂og SrCl₂ løsninger).
      2. Fortsett å bruke metoden beskrevet under trinn 4.2.2, med MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂og NiCl₂ løsninger i stedet for alkaliske ligand løsninger.
         Merk: De siste transisjonsmetall klorider viste sterkere interaksjon med av kapillær og kan ikke fjernes helt. Disse interaksjoner gir skift i overføringstid fra kjøre å kjøre. Derfor ble de undersøkt etter andre metall ioner.

Representative Results

Figur 1 viser electropherogram for AtHIRD11 prøven fikk under CGE eksperimenter. Peptid størrelsen øker fra venstre til høyre. Topp nummer 4 har den største massen og angir intakt protein. Mindre toppene 2 og 3 representerer mindre urenheter (f.eks, nedbrytningsprodukter). Første toppen og uten den opprinnelige planen før kunne også gjengis uten protein prøven. Derfor det er relatert til SDS gel seg selv og ikke representerer urenheter sample-forbundet.

Figur 2 representerer electropherogram for acetanilide under ACE eksperimenter. Acetanilide løsningen viser bare 1 høy topp siden den burde har ingen urenheter. Gjenkjenning tiden for toppen maksimal angir overføring av electroosmotic (t_EOF) og brukes for beregning av samhandlingen.

Figur 3 er electropherogram av AtHIRD11 prøven under ACE eksperimentet i fravær av SDS og metall ioner. Det viser, foruten 2 urenheter fra CGE electropherogram, minst 5 topper som er knyttet til protein selv. Topp 1 og 2 kan tilordnes urenheter siden deres Overføringstidspunkt indikerer at de er små eller svært positivt ladet. Denne antakelsen er støttet av økt peak høyden og området over tid. Siden AtHIRD11 topper 3 og 4 er nær EOF, de er knapt ladet og kan ikke skilles i hvert løp. De nesten viser ingen interaksjoner og representerer konformasjonen uten tilgjengelig rester avgjørende for samspillet med metall ioner. AtHIRD11 viser flere forskjellige gratis-å-størrelse-forhold på grunn av ulike effektiv radier av forskjellige conformers. Disse conformers kan flette kontinuerlig. Deretter er topper 5-7 bredere enn de vanlige protein toppene. Bred toppene gir et hint på the kinetics av samhandlinger. Siden toppene ikke er trange, kan en rask og svært langsom konvertering mellom de forskjellige conformers utelukkes. I begge tilfeller ville toppene være atskilt med planlagte⁴. I dette tilfellet en pre balanse trinn kan endre mønster topp og vil gi et bedre innblikk i samhandlingen med tregere kinetics.

Figur 4 viser grafisk evalueringen av den målte overføringstiden skift i nærvær av ulike metall ioner for topp 6. Den representeres av den beregnede verdi ΔR/R_f. Denne verdien angir hvor sterk en endring er (ved sin verdi) og total endring av protein-metal ion komplekser tillegget (ved fortegn). For å skille mellom en vesentlig grad av samhandling og et tilfeldig SKIFT, konfidensintervaller for α = 0,05 beregnes også. I tilfeller der konfidensintervallet ikke er overlappende med null som samhandlingen like viktig. Resultatene er tatt hensyn hvis toppen var i minst 6 av 10 electropherograms. Topp 6 var ikke tilstede i alle løp med 500 µM Co^{2 +}. Den komplette listen over samhandlingene for hver AtHIRD11 topp er publisert i et tidligere verk av Nachbar et al. ⁴.

ΔR/R_f beregnes ved hjelp av overføring tid forholdstall R_jeg (i nærvær av ligand) og overføring tid forholdstallene R_f (i fravær av ligand):

R_jeg og R_f er beregnet med topp beste tider t_protein for protein eksempel toppene og tilsvarende topp topp tid for EOF-markøren t_EOF:

For R_jeger tiden i nærvær av ligand brukes, og for R_f, tiden i fravær.

Figur 1 : Electropherogram for CGE separasjon av AtHIRD11 prøven i gel buffer. Topp 1 og toppene på venstre kan observeres selv uten en eksempel injeksjon, så de er gjenstander. Siden massene og total topp topp 2 og 3 er mindre enn topp 4, de er sannsynlig urenheter, som nedbrytningsprodukter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Electropherogram av EOF-markør acetanilide kjøre. Figuren viser bare 1 topp for sammensatt uten metall ioner og SDS gel buffer. Tidspunktet for de topp markerer electroosmotic flyten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Eksempel på en electropherogram av prøven separasjon under ACE eksperimentene viser et mønster komplekse topp i fravær av noen metall ioner. Minst 7 toppene kan identifiseres og protein og dens 2 urenheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Grafisk evaluering av bindende mot undersøkte metall ioner i en konsentrasjon av 500 µM Topp 6. Verdiene for ΔR/R_f gir et hint på intensiteten av tidsforskyvningen migrasjon og derfor styrken conformational endringene på metall ion binding. Tegn på ΔR/R_f angir hvis komplekset er mer positivt eller negativt ladet sammenlignet med ubundet protein. Feilfeltene angi konfidensintervaller for α = 0,05. Deretter de viser området der den sanne ΔR/R_f-verdi finnes i en sikkerhet på 95%. De røde linjene indikerer beregnede resultatene av utilstrekkelige data (toppen var i mindre enn 6 electropherograms). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For alle CE eksperimenter er utarbeidelse av av kapillær en avgjørende skritt. Siden det er røret med liten diameter, kan det lett bryte på stedene hvor belegget fjernes når den blir behandlet. Installasjon av av kapillær inn i apparatet bør gjøres veldig nøye.

Kritisk trinnene involvert i med metoden ACE hovedsakelig forbundet eksperimentelle oppsettet. Et annet viktig skritt er å finne rett eksempel injeksjon parameterne. Den injiserte utvalget har å være nok for høye topper. Imidlertid vil overbelastning det resultere i et mønster med dårlig løst topp med overlappende topper. Når reduserer injisert volumet, anbefales det å redusere injeksjon i stedet for injeksjon tiden siden det tar litt tid for instrumentet å nå programmert injeksjon press.

Uvanlig bred topper finnes for annet protein prøver. Dette mønsteret kan bli påvirket ved å øke spenningen. Følgelig toppene få smalere og den separasjon er redusert. Likevel kortere separasjon tid kan resultere i ikke-løst topper og høyere spenning øker Joule oppvarming og begrenser effekten av trange topper av electrophoretic spredning^7,8. Derfor har de rette forholdene skal fastsettes for hver nye protein undersøkt.

Kombinere CGE og ess å samle informasjon om egentlig uordnede karakter av et protein og virkemåten binding er en roman tilnærming. Karakterisering av utvalget av gel geleelektroforese er nødvendig for å bevise at noen flere topper observert ikke gjelder urenheter. Fordelen med CGE er muligheten til å automatisere det kortere Forberedelsestid og høyere oppløsning sammenlignet med klassisk gel geleelektroforese⁹. Bruke ACE for IDP bindende eksperimenter viser sin overlegenhet overfor andre analyser (f.eksimmobilisert metall affinitet Ture i resultatene) siden ess ikke bare viser bindende hendelser. Videre er det skiller ulike conformers av et protein og kan avdekke forskjeller i bindingen ligander av ulike conformers. Dette kan ikke oppdages av metoder uten en separasjon under binding eksperimentet. I tillegg er analyse tiden bare 6 minutter; resultatene kan derfor beregnes på kort tid¹⁰. På den annen side, kommer rask analyse med begrensninger i estimering av antallet bindende områder¹¹.

Fremtiden for denne tilnærmingen ligger i muligheten til skjermen potensielle bindende partnere for proteiner, særlig internflyktninger, på en rask måte. Det gir en rask oversikt over ulike bindende atferden til de ulike conformers i et utvalg. Bruk av en størrelse avhengig av separasjon (f.eksCGE) for eksempel karakterisering er obligatorisk siden ess selv ikke kan skille mellom urenheter og protein selv. Imidlertid gir CGE en idé om hvor mange ulike størrelser arter. Anvendelsen av ess som en bindende analysen er utvidet allerede fra metall ion ligander noen ladet ligand¹². Derfor det kan legge til tilleggsinformasjon om interaksjoner alle preget bindende, siden kombinasjonen av separasjon og bindende analysen i en metode kan gi bevis for noen endret bindende atferd av forskjellige conformers og posttranslational endringer, henholdsvis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it