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Biochemistry

Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Dieses Protokoll verbindet die Charakterisierung einer Protein-Probe durch Kapillare Gelelektrophorese und ein schnell-Bindung-Screening für geladene Liganden durch Affinität Kapillarelektrophorese. Es empfiehlt sich für Proteine mit einer flexiblen Struktur, wie zum Beispiel intrinsisch ungeordneten Proteine, um irgendwelche Unterschiede für verschiedene Konformere verbindlich festzustellen.

Abstract

Pflanzen sind stark abhängig von ihrer Umgebung. Höhere Pflanzen entwickeln um stressige Veränderungen (z.B., Trockenheit und hohe Salzgehalt) anpassen, Klassen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs), oxidativen und osmotischen Stress zu reduzieren. In diesem Artikel verwendet eine Kombination von Kapillaren Gelelektrophorese (CGE) und Mobilität Verschiebung Affinität Elektrophorese (ACE) um das Bindungsverhalten von verschiedenen Umformer von IDP AtHIRD11 von Arabidopsis Thalianazu beschreiben. CGE wird verwendet, um die Reinheit des AtHIRD11 bestätigen und Fragmente, posttranslationale Modifikationen und andere Verunreinigungen als Gründe für komplexe Peak Muster auszuschließen. In diesem Teil des Experiments sind die verschiedenen Beispielkomponenten getrennt durch ein zähflüssiges Gel in einer Kapillare durch ihre unterschiedlichen Massen und mit einer Diode Array Detektor erkannt. Danach wird das Bindungsverhalten der Probe gegenüber verschiedenen Metallionen von ACE untersucht. In diesem Fall der Liganden wird hinzugefügt, um die Pufferlösung und die Verschiebung der Migrationszeit wird gemessen, um festzustellen, ob eine verbindliche Ereignis oder nicht aufgetreten ist. Einer der Vorteile der Verwendung von der Kombination von CGE und ACE um zu bestimmen, das Bindungsverhalten des IDP ist die Möglichkeit zur Automatisierung der Gelelektrophorese und Bindung-Assay. Darüber hinaus CGE zeigt eine Untergrenze der Erkennung als die klassische Gelelektrophorese und Ass ist in der Lage, die Art der Bindung eines Liganden in einer schnellen Weise bestimmen. ACE kann darüber hinaus auch auf andere geladene Spezies als Metallionen angewendet werden. Allerdings ist die Verwendung dieser Methode für verbindliche Experimente in seiner Fähigkeit, die Anzahl der Bindungsstellen bestimmen begrenzt. Dennoch kann die Kombination von CGE und ACE angepasst werden, charakterisieren das Bindungsverhalten einer Protein-Probe gegenüber zahlreichen geladenen Liganden.

Introduction

Pflanzen sind stärker abhängig von ihrer Umgebung als viele andere Lebensformen. Da Pflanzen auf andere Orte übertragen können, müssen sie auf Veränderungen in ihrem Umfeld (z.B., Trockenheit, Kälte und hohe Salzkonzentrationen) einzustellen. Daher entwickelt höhere Pflanzen spezialisierten Stress-Proteine wie Dehydrins, die vielfältige Aufgaben zur Zelle Stressabbau im Zusammenhang mit hohem Salzgehalt zu erfüllen. Diese Proteine binden Wasser und Ionen innerhalb der Zellen, reduzieren oxidativen Stress durch verbindliche Cu2 +-Ionen, und die Interaktion mit Phospholipide sowie die Cytoskeletons. Darüber hinaus binden Zn2 +-Ionen können diese Proteine, die als Transkriptionsfaktoren wirken. Ihre Fähigkeit, Ca2 +binden-Ionen nach Phosphorylierung auch wurde berichtet1.

Das multifunktionale Verhalten dieser Proteine bezieht sich auf das Fehlen von hydrophoben Aminosäurereste. Infolgedessen fehlt ihnen jede hydrophoben Wechselwirkungen innerhalb der Peptid-Kette und auch eine eingeschränkte Struktur. Aber weil diese Proteine eine restriktive Struktur fehlt, können sie verschiedene Konformere unter den gleichen Bedingungen belegen. Daher können sie am besten als ein Ensemble von Strukturen und nicht als eine einzelne Konformation beschrieben werden. Proteine mit diesen Eigenschaften werden als intrinsisch Proteine (IDPs ungeordneten) und sind ein weit verbreitetes Konzept für Stress-Proteine und Übersprechen zwischen verschiedene Wege in eukaryotischen Zellen2bezeichnet.

Diese stressbedingte IDPs gehört AtHIRD11. Es ist eine der Arabidopsis Thalianadie meisten sehr Dürre ausgedrückt IDPs. Daher verschiedene Konformere getrennt werden können, durch ihre effektiven Radius, Verhältnis zu berechnen, und Kapillarelektrophorese (CE) für weitere Untersuchungen verwendet worden. Vorherigen ACE Experimente zeigten die Wechselwirkungen zwischen AtHIRD11 und Übergangsmetall-Ionen z. B. Cu2 +- Zn2 +-, Co2 +und Ni2 +-Ionen. Die detaillierten Ergebnisse finden Sie im Hara Et al. 3 und Nachbar Et al. 4.

Die ACE-Methode, die hier verwendet werden, basiert auf unseren früher veröffentlichten Werke6. Die Zugabe von EOF Marker Acetanilid zum Beispiel Protein ist jedoch nicht geeignet. AtHIRD11 zeigt Breite Spitze Muster, und Hinzufügen des EOF-Markers zur Probe zwei Gipfel verschleiern würde. Daher wird die Markierung in einem separaten Lauf verwendet. Bevor das Bindungsverhalten geprüft wird, wird es bestätigt, dass die Gipfel fand während der früheren Experimente aus verschiedenen Umformer sind. So CGE dient zur Unterscheidung zwischen der Protein-Umformer, die Post-translationale modifizierte Protein und Verunreinigungen, wie Fragmente von AtHIRD11, durch ihre unterschiedlichen Massen. Anschließend wird die gekennzeichneten AtHIRD11 Probe Bindungsverhalten gegenüber verschiedenen verschiedenen Metall-Ionen untersucht.

Der Zweck dieses Artikels soll ein Versuchsaufbau IDP und andere Bestandteile einer Probe unterscheiden, um die Unterschiede in der das Bindungsverhalten von verschiedene Konformere bewerten zu beschreiben.

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Protocol

1. Vorbereitung der Kapillarelektrophorese Instrumente

  1. Bereiten Sie die Kapillaren
    1. Verwenden Sie einen Glasschneider eine bare verschmolzen Kieselsäure in 33 cm (für die CGE-Experiment) und 30 cm (für das ACE-Experiment) langen Kapillaren Kapillare mit einem Polyimid-Außenbeschichtung und einem Innendurchmesser von 50 µm geschnitten. Führen Sie das Schneiden auf einer Glasplatte.
      Hinweis: Die 2 verschiedenen Versuchsaufbauten wurden für 2 verschiedene Instrumente entwickelt. Um sie an andere Instrumente benutzen, ist eine Übertragung der richtigen Methode durchzuführen und die Kapillarlänge hat die zulässige Länge des Instruments angepasst werden.
    2. Verwenden Sie einen Stift, um Mitte des einen 1 cm breiten Erkennung Fenster in einem Abstand von 24,5 cm von einem Ende der Kapillare für die CGE-Experiment und 21,5 cm von einem Ende der Kapillare für die ACE-Experiment (Nutzlänge) markieren.
    3. Entfernen Sie die Polyimid-Außenbeschichtung aus den Kapillaren durch Abbrennen mit einer Lötlampe, 0,5 cm vor und nach der Marke. In ähnlicher Weise verwenden Sie die Lötlampe um 1 cm der Beschichtung an beiden Enden der Kapillaren entfernen.
      Hinweis: Die effektive Länge kann leicht variieren, da es auf der Kapillarelektrophorese-Instrument verwendet.
    4. Reinigen Sie die Enden der Kapillaren und die Erkennung Fenster mit Ethanol und einem weichen Tuch.
      Hinweis: Die unbeschichteten Kapillaren sind weniger flexibel und wahrscheinlich zu brechen.
  2. Installieren Sie die Kapillaren
    1. Installieren einer Kapillare im CE-System mit der Erkennung Fenster in der Nähe der Steckdose.
      Hinweis: Die verschiedenen Modelle der CE-Instrument haben verschiedene Haltersysteme für die Kapillaren. Finden Sie im Handbuch des verwendeten Instruments für die genaue Anleitung.

2. bereiten Sie die Lösungen

  1. Bereiten Sie die Lösungen für die CGE Analyse
    1. Vorbereiten der Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethane (Tris)-SDS Puffers (100 mM/1% w/V) bei pH 8,0.
      1. Verwenden Sie eine Atemmaske und einen Stand zum Wiegen von 1,00 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in einen 100-mL-Becherglas.
      2. 1,21 g Tris in 100 mL-Becherglas und mit 50 mL entionisiertem Wasser und eine magnetische Stir Bar auf einen Magnetrührer auflösen.
      3. Legen Sie eine pH-Elektrode in die Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 8.0 mit 1,0 M HCl.
      4. Füllen Sie die Lösung in ein 100 mL volumetrischen Kolben und fügen Sie deionisiertes Wasser bis zur Markierung hinzu. Schütteln Sie sie vorsichtig, um Schaum bilden zu vermeiden.
    2. Bereiten Sie die 0,1 M NaOH Lösung.
      1. Wiegen Sie 4,0 g NaOH in einem 100 mL volumetrischen Kolben. Füllen Sie es bis zur Markierung mit entionisiertem Wasser, ein 1 M-Lager zu machen.
      2. Verwenden Sie eine 10-mL-Birne-Pipette 10 mL dieser Lösung in einem anderen 100 mL volumetrischen Kolben übertragen und deionisiertes Wasser bis zur Markierung einfüllen.
    3. Bereiten Sie die 0,1 M HCl-Lösung.
      1. 100 mL volumetrischen Kolben mit einer volumetrischen 10 mL-Pipette 10 mL 10 M HCl hineingesteckt und deionisiertes Wasser bis zur Markierung einfüllen. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die 0,1 M HCl zu erhalten.
    4. Bereiten Sie die Musterlösung.
      1. Wiegen Sie 0,5 mg des Proteins in einer 1-mL-Tube. 0,5 mL des Puffers Tris-SDS-Gel aus Schritt 2.1.1 mit einer Mikropipette hinzufügen.
      2. Lösen Sie das Protein durch Schütteln sanft um jegliche Bildung von Schaum und Abbau des Proteins zu vermeiden.
        Hinweis: Verwenden Sie Ultraschall, wenn das Protein nicht gelöst werden kann, wie beschrieben; vermeiden Sie jede Erwärmung der Lösung.
    5. Füllen Sie die Lösungen in die Flaschen.
      1. Jede Lösung durch einen 0,22 µm Polyvinylidenfluorid (PVDF) Filtern mit einer angemessenen Spritze direkt in die Flasche zu filtern.
        Hinweis: Für die Gel-haltigen Lösungen kann der Gegendruck aufgrund seiner hohen Viskosität hoch sein.
      2. Bereiten Sie insgesamt 15 Ampullen und markieren Sie jeweils um eine Verwechslung zu vermeiden.
        1. Füllen Sie 3 Fläschchen mit einem handelsüblichen Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Gel Puffer bei pH 8.
          Hinweis: Die Verwendung eines handelsüblichen SDS-Gel-Puffers liefert genauere Ergebnisse.
        2. 1 Durchstechflasche mit 0,1 M NaOH und 1 Durchstechflasche mit 0,1 M HCl für die Spülung zu füllen.
        3. Füllen Sie 1 Durchstechflasche mit der Probelösung.
        4. Füllen Sie 5 Ampullen mit entionisiertem Wasser und 4 Fläschchen mit 0,1 mL entionisiertem Wasser (Eintauchen Fläschchen).
          Hinweis: Die Dippen Fläschchen Abfall Ampullen dienen als während des Spülvorgangs der Kapillare vor jeder Fahrt. Die Kapillaren Enden sind in Wasser getaucht, um Rückstände Gel abspülen.
  2. Bereiten Sie die Lösungen für die ACE-Analyse
    1. Bereiten Sie die 1 M NaOH-Lösung.
      1. Wiegen Sie 4,0 g NaOH in einem 100 mL volumetrischen Kolben.
      2. Füllen Sie es bis zur Markierung mit entionisiertem Wasser, ein 1 M-Lager zu machen.
    2. Bereiten Sie die 0,1 M Ethylendiaminetetraacetic Säure (EDTA) in einer 0,1 M NaOH-Lösung.
      1. 10 mL 0,1 M NaOH in einem 100 mL volumetrischen Kolben mit einer Pipette 10 mL Birne zu übertragen. Mit entionisiertem Wasser bis zur Markierung füllen.
      2. Wiegt 2,42 g EDTA auf einem mit einem Gewicht von Boot und Auflösen der festen Verbindung in der 100 mL 0,1 M NaOH.
    3. Vorbereiten der Tris-Pufferlösung (30 mM).
      1. Fügen Sie 3,63 g Tris, 200 mL entionisiertem Wasser und rühren Bar in einen 500-mL-Becherglas. Stellen Sie den Becher auf einem Teller rühren und schalten Sie ihn ein.
      2. Eine pH-Meter-Elektrode in das Becherglas und Einstellen des pH-Werts 7,4 mit 0,1 M HCl.
      3. Füllen Sie die Lösung in eine Volumetrische 1 L Flasche und füllen Sie bis zur Markierung mit entionisiertem Wasser.
        Hinweis: Dieses Verfahren muss wiederholt werden oder ein größerer volumetrischer Kolben ist notwendig, da mehr als 1 L für die gesamte Analyse erforderlich ist.
    4. Bereiten Sie den Acetanilid Elektroosmotischer Fluss (EOF)-Marker (60 µM) Lösung.
      1. 6 mg Acetanilid und 100 mL Tris-Puffer in einem 100 mL volumetrischen Kolben hinzufügen.
      2. Den volumetrischen Kolben in einem Ultraschallbad legen und für 30 min. einschalten.
    5. Vorbereitung der Probenlösung (1 mg/mL).
      1. Eine Präzisionswaage einen 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufsetzen und Hinzufügen von 0,3 mg gefriergetrockneten AtHIRD11 Pulver in die Röhre.
      2. Mithilfe einer Mikropipette 0,3 mL einer 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4) in der Röhre hinzu. Schütteln Sie das Rohr sorgfältig durch, um das Protein zu lösen.
    6. Bereiten Sie die Liganden-Lösungen.
      1. Bereiten Sie das CaCl2 (5 mM)-Stammlösung.
        1. Mit einem Gewicht von Boot zu nehmen, legen Sie es auf einer Analysenwaage und wiegen 36,76 mg CaCl2* H2O.
        2. Spülen mit einer Mikropipette das CaCl2* H2O von der Verwiegung Boot in einem 50 mL volumetrischen Kolben mit dem vorbereiteten Tris-Puffer.
        3. Der Tris-Puffer auf dem neuesten Stand die volumetrische Flasche einfüllen.
      2. Bereiten Sie die restlichen Stammlösungen (5 mM).
        1. Wiederholen Sie Schritt 2.2.6.1 mit anderen metallischen Salze anstelle von CaCl2* H2O [MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr (Nr.3)2: 52,91 mg, MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl 2* 2 H2o: 41,47 mg, CuCl2* 2 H2o: 42,62 mg, ZnCl2: 3,41 mg und NiCl2* 6 H2o: 59,43 mg].
          Hinweis: Die ZnCl-2 -Lösung hat eine Konzentration von 0,5 mM. Da starke Wechselwirkungen zwischen den Ionen und die Kapillare Innenwand zu beobachten waren, war die Konzentration um den Faktor 10 verringert4.
      3. Bereiten Sie die 500 µM CaCl2 -Lösung.
        1. Füllen Sie 10 mL der Vorratslösung CaCl2 und steckte es in eine Volumetrische 100 mL-Flasche.
        2. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit einem Tris-Puffer bis zur Markierung zu und schütteln Sie die Flasche.
      4. Bereiten Sie die 250 µM CaCl2 -Lösung.
        1. 5 mL der CaCl2 Vorratslösung zu füllen, und steckte es in eine Volumetrische 100 mL-Flasche.
        2. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit einem Tris-Puffer bis zur Markierung zu und schütteln Sie die Flasche.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6.3 und 2.2.6.4 für andere Lagerlösungen.
    7. Füllen Sie die Lösungen in den Fläschchen.
      Hinweis: Jedem wiederholten Lauf braucht eine Reihe von Einlass und Auslass Fläschchen. Die Verwendung von frischen Liganden Lösungen auf den Einlass und Auslass reduziert die Verschiebungen in der Migrationszeit nach jedem Lauf.
      1. Füllen Sie die 250 µM CaCl2 -Lösung in einer 10 mL Spritze.
      2. Setzen Sie einen 0,22 µm PVDF-Filter auf die Spritze und schieben 2 mL der Lösung durch den Filter mit der Spritze um diese filtrierte Lösung zu verwerfen.
      3. Die restlichen 250 µM CaCl2 -Lösung der Spritze 10 Fläschchen bis die maximale zulässige Lautstärke einfüllen. Markieren Sie jeweils als 250 µM CaCl 2 -Lösung Einlass Fläschchen.
      4. 10 Fläschchen zu füllen, bis sie halb gefüllt mit 250 µM CaCl2 -Lösung sind. Markieren Sie jeweils als 250 µM CaCl 2 -Lösung Outlet Fläschchen.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.7.1 - 2.2.7.4 für die anderen Metall Salz-haltigen Lösungen.
      6. Wiederholen Sie die Schritte für jedes Paar von Einlass und Auslass Fläschchen mit 30 mM Tris Pufferlösung (pH 7,4) statt.
        Hinweis: 30 Mmol/L Tris-Puffer pH 7.4 wird zwischen den Läufen verwendet, um Migration Zeitdaten für das Protein in Abwesenheit von Metall-Ionen zu erhalten. Es ist notwendig, um Veränderungen in der EOF zu vernachlässigen.
      7. Wiederholen Sie die obigen Schritte für eine Durchstechflasche mit Acetanilid EOF-Marker (60 µM) Lösung statt. Auch, wiederholen Sie diese Schritte mit der Probelösung (1 mg/mL) statt.

3. Kapillare Gel elektrophoretische Trennung

Hinweis: Bereiten Sie die Trennung nach der Methode, die in früheren Arbeiten von Nachbar Et Al. beschrieben 4.

  1. Vorbereitung der analysis
    1. Zustand der Kapillare
      1. Stellen Sie den Thermostat auf 23 ° C.
      2. Spülen Sie die Kapillare für 10 min bei 2,5 Bar mit 0,1 M NaOH.
      3. Spülen Sie die Kapillare für 5 min bei 2,0 Bar mit 0,1 M HCl.
      4. Spülen Sie die Kapillare für 2 min bei 2,0 Bar mit entionisiertem Wasser.
    2. In der SDS-Gel-Puffer zu füllen
      1. Füllen Sie eine Kapillare für 10 min bei 2,0 Bar mit dem handelsüblichen SDS-Gel-Puffer bei pH 8,0.
    3. Spülen Sie die Kapillare vor jeder Trennung Lauf
      1. Spülen Sie die Kapillare für 3 min bei 4,0 Bar mit 0,1 M NaOH.
      2. Spülen Sie die Kapillare für 1 min bei 4,0 Bar mit 0,1 M HCl.
      3. Spülen Sie die Kapillare für 1 min bei 4,0 Bar mit entionisiertem Wasser.
      4. Spülen Sie die Kapillare für 10 min bei 4,0 Bar mit dem SDS-Gel-Puffer.
  2. Führen Sie die Trennung
    1. Injizieren Sie die Musterlösung für die CGE-Experimente (Schritt 2.1.4) hydrodynamisch durch die Anwendung von 0,1 Bar für 4 min am Einlass.
    2. Bewerben -16.5 kV und einem Druck von 2,0 Bar an beiden Enden der Kapillare 25 min. lang.

(4) Affinität elektrophoretischen Kapillaranalyse

Hinweis: Bereiten Sie die Trennung nach der Methode in früheren Werken von Nachbar Et Al. beschrieben 4 und Alhazmi Et al. 5.

  1. Zustand der Kapillare
    1. Stellen Sie den Thermostat auf 23 ° C.
      Hinweis: Die Temperatur nach veröffentlichten Protokolle verwendet und kann auf andere Temperaturen4,5geändert werden. Jedoch die Wechselwirkungen sind abhängig von der Temperatur und ändert sich entsprechend.
    2. Spülen einer Kapillare für 40 min bei 2,5 Bar mit 0,1 M NaOH.
    3. Spülen Sie die Kapillare für 10 min bei 1,0 Bar mit entionisiertem Wasser.
    4. Spülen Sie die Kapillare für 30 min bei 1,0 Bar mit einem 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4).
  2. Vorbereitung für die ACE-Methoden
    1. Bereiten Sie die Methode für die Messung ohne Liganden.
      Hinweis: Acetanilid war nicht die Beispiellösung hinzugefügt da es 2 Protein Spitzen verkleidet.
      1. Spülen Sie die Kapillare für 1 min bei 2,5 Bar mit einer 0,1 M EDTA Lösung.
      2. Spülen Sie die Kapillare für 1 min bei 2,5 Bar mit entionisiertem Wasser.
      3. Spülen Sie die Kapillare für 1,5 min bei 2,5 Bar mit einem Tris-Puffer für Gleichgewichtherstellung.
      4. Die Acetanilid Lösung für 6 s an 0,05 Bar und ändern den Einlass und Auslass Fläschchen, Tris-Puffer-Fläschchen zu injizieren.
      5. Anwenden von 0,05 Bar für 2,4 s um die Acetanilid-Lösung von der Spitze der Kapillare weiter innen schieben.
      6. Anwenden von 10,0 kV 6 min und erkennen der Acetanilid Peak bei einer Wellenlänge von 200 nm.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.1.1. -4.2.1.6. mit Hilfe des Proteins statt Acetanilid Lösung probieren Sie und erkennen Sie die Protein-Gipfel.
    2. Bereiten Sie die Methode für die Messungen mit Liganden.
      1. Spülen Sie die Kapillare für 1 min bei 2,5 Bar mit einer 0,1 M EDTA Lösung.
      2. Spülen Sie die Kapillare für 1 min bei 2,5 Bar mit entionisiertem Wasser.
      3. Spülen Sie die Kapillare für 1,5 min bei 2,5 Bar mit der Liganden-Lösung für Gleichgewichtherstellung.
      4. Die Acetanilid Lösung für 6 s an 0,05 Bar und ändern den Einlass und Auslass Fläschchen zu den Liganden-haltigen Puffer Fläschchen zu injizieren.
      5. Anwenden von 0,05 Bar für 2,4 s um die Acetanilid-Lösung von der Spitze der Kapillare weiter innen schieben.
      6. Anwenden von 10,0 kV 6 min und erkennen der Acetanilid Peak bei einer Wellenlänge von 200 nm.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2.1 - 4.2.2.6. mit der Protein-Probe statt Acetanilid Lösung und erkennen Sie die Protein-Gipfel zu.
    3. Abwechselnd wiederholen Sie Schritt 4.2.1 und 4.2.2 um die Änderung in der kostenlos-Größe-Verhältnis für die verschiedenen Protein-Metall Ionen-Interaktionen (beschrieben unter Vertreter Ergebnisse) zu berechnen.
      1. Ändern Sie die Proteinlösung nach jeweils 60 h um eine frische.
        Hinweis: an dieser Stelle kann das Experiment angehalten werden. Dieses Verfahren ist mindestens wiederholte 10 X für jede Konzentration der Liganden da das Peak-Muster leicht von Ausführung zu Ausführung variiert. Wenn die Lösung mehr als 60 h verwendet wird, die Unterschiede zu groß geworden.
    4. Führen Sie die Methoden
      1. Führen Sie die unter Schritt 4.2.2, mit den Alkaline Erde Liganden Lösungen (CaCl2, MgCl2BaCl2und SrCl2 Lösungen) beschriebene Methode.
      2. Weiter mit der unter Schritt 4.2.2, MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2und NiCl2 Lösungen anstelle von Alkaline Erde Liganden Lösungen beschriebenen Methode.
        Hinweis: Die letzteren Übergangsmetall-Chloride zeigte stärkere Wechselwirkungen mit der Kapillare und können nicht vollständig entfernt werden. Diese Wechselwirkungen führen zu Verschiebungen in der Migration der Zeit von Ausführung zu Ausführung. Infolgedessen wurden sie nach der Metall-Ionen untersucht.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Electropherogram für die AtHIRD11 Probe während der CGE-Experimente. Die Peptid-Größe erhöht sich von links nach rechts. Gipfel Nummer 4 hat die größte Masse und zeigt das intakte Protein. Die kleineren Gipfel 2 und 3 Stellen kleinere Verunreinigungen (z.B. Abbauprodukte). Der erste Gipfel und die Widersprüchlichkeit der Baseline vor könnte auch ohne die Protein-Probe reproduziert werden. Daher ist es im Zusammenhang mit der SDS gel selbst und stellt keine Verunreinigungen Probe verbunden.

Abbildung 2 stellt die Electropherogram für Acetanilid während der ACE-Experimente. Die Acetanilid Lösung zeigt nur 1 hohen Gipfel, da es keine Verunreinigungen haben sollte. Die Erkennungszeit für Peakmaximum zeigt die Migration von den Elektroosmotischer Fluss (EOFt) und dient zur Berechnung der Wechselwirkung.

Abbildung 3 ist die Electropherogram der AtHIRD11 Probe während des ACE-Experiment in der Abwesenheit von SDS und Metall-Ionen. Es zeigt neben den 2 Verunreinigungen aus der CGE Electropherogram mindestens 5 Spitzen, die an das Protein selbst zusammenhängen. Peak 1 und 2 kann Verunreinigungen zugeordnet werden, da ihre Migration Zeiten zeigen, dass sie klein oder sehr positiv geladen sind. Diese Annahme stützt sich auf die Erhöhung der Scheitelhöhe und der Umgebung im Laufe der Zeit. Da AtHIRD11 Gipfel 3 und 4 in der Nähe der EOF sind, sie werden kaum belastet und nicht in jedem Lauf getrennt werden. Sie fast keine Wechselwirkungen zeigen und repräsentieren Konformationen zugänglich rückstandsfrei unerlässlich für die Interaktionen mit den Metallionen. AtHIRD11 zeigt mehrere unterschiedliche kostenlos-zu-Größe-Verhältnisse durch verschiedene effektive Radien von verschiedene Konformere. Diese Umformer können kontinuierlich zusammenführen. Danach sind Spitzen 5-7 breiter als die üblichen Protein-Gipfel. Die breiten Gipfel geben einen Hinweis auf die Kinetik der Interaktionen. Da die Gipfel nicht eng sind, können eine schnelle und eine sehr langsame Konvertierung zwischen verschiedenen Konformere ausgeschlossen werden. In beiden Fällen wäre der Gipfel Basislinie getrennt4. In diesem Fall würde ein Pre Gleichgewichtherstellung Schritt das Peak-Muster zu ändern und einen besseren Einblick in die Interaktionen mit langsameren Kinetik.

Abbildung 4 zeigt die grafische Auswertung der gemessenen Migrationszeit im Beisein der verschiedenen Metallionen für Peak 6 verschiebt. Es wird durch den berechneten Wert ΔR/Rfdargestellt. Dieser Wert gibt an, wie stark eine Verschiebung (durch seinen Wert) ist und die Änderung der Protein-Metall-Ionen komplexe kostenlos (von seinem Zeichen). Zur Unterscheidung eine signifikante Wechselwirkung und eine zufällige Verschiebung, die Konfidenzintervalle für α = 0,05 werden ebenfalls berechnet. In Fällen wo das Konfidenzintervall mit der Null-Linie nicht schneidenden ist, wird die Interaktion als signifikant betrachtet. Ergebnisse werden berücksichtigt, wenn der Gipfel in mindestens 6 von 10 Electropherograms vorhanden war. Peak 6 war nicht anwesend in jedem Lauf mit 500 µM Co2 +. Die vollständige Liste der Interaktionen für jedes AtHIRD11 Peak ist in einer früheren Arbeit von Nachbar Et Al. veröffentlicht. 4.

ΔR/Rf wird anhand der Migration Zeit Verhältnisse Rich (in Anwesenheit von den Liganden) und die Migration-Zeit-Verhältnisse Rf (in Abwesenheit des Liganden):

Equation 1

Rich und Rf werden anhand der Spitze Top-Zeiten tProtein für die Protein-Probe-Gipfel und die entsprechenden Peak-Bestzeit für die EOF-Marker tEOF:

Equation 2

Richsind die Zeiten im Beisein der Liganden verwendet und für Rf, die Zeiten in Abwesenheit.

Figure 1
Abbildung 1 : Electropherogram für die CGE Trennung der Probe im Gel-Puffer AtHIRD11. Peak 1 und den Gipfeln auf der linken Seite können auch ohne eine probeninjektion beobachtet werden, so dass sie Artefakte sind. Seit der Massen und der gesamten Peakflächen von Peak 2 und 3 sind kleiner als die des Peak 4, sind sie wahrscheinlich Verunreinigungen, wie z. B. Abbauprodukte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Electropherogram die EOF-Marker Acetanilid laufen. Die Abbildung zeigt nur 1 Peak für die Verbindung ohne Metall-Ionen und SDS-Gel-Puffer. Die Zeit von der Spitze-Spitze markiert den Elektroosmotischer Fluss. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Beispiel für eine Electropherogram für die Trennung der Probe während der ACE-Experimente zeigen eine komplexe Peak-Muster in Ermangelung Metall-Ionen. Mindestens 7 Gipfel konnten identifiziert und im Zusammenhang mit dem Protein und seine 2 Verunreinigungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Grafische Auswertung der das Bindungsverhalten in Richtung der untersuchten Metall-Ionen mit einer Konzentration von 500 µM für Peak 6. Die Werte der ΔR/Rf geben einen Hinweis auf die Intensität der Migration Timeshift und damit auf die Stärke der Konformationsänderungen auf Metall-Ionen Bindung. Das Zeichen des ΔR/Rf gibt an, ob die Anlage positiv oder negativ im Vergleich zu den ungebundenen Protein geladen ist. Die Fehlerbalken zeigen die Konfidenzintervalle für α = 0,05. Anschließend zeigen sie den Bereich wo die wahren ΔR/Rf-Wert finden Sie mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 %. Die roten Balken zeigen die berechneten Ergebnisse keine ausreichenden Daten (der Gipfel war in weniger als 6 Electropherograms). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Für alle CE-Experimente ist die Vorbereitung der Kapillare ein entscheidender Schritt. Da es ein Glasrohr mit kleinem Durchmesser ist, kann es leicht an den Stellen brechen, wo die Beschichtung entfernt wird, wenn es behandelt wird. Die Installation der Kapillare in das Instrument sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden.

Mit der ACE-Methode vor allem kritische Schritte beziehen sich auf den Versuchsaufbau. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die richtige Probe Spritzparameter finden. Die eingespritzte Menge der Probe muss genügen hohen Gipfeln. Überlastung, es würde jedoch in einem schlecht aufgelöste Peak-Muster mit überlappenden Peaks führen. Wenn das injizierte Volumen zu verringern, empfiehlt es sich, den Einspritzdruck statt die Einspritzzeit zu verringern, da es einige Zeit für das Instrument braucht, um die programmierte Einspritzdruck zu erreichen.

Für die verschiedenen Proteinproben finden Sie ungewöhnlich breiten Gipfel. Dieses Muster kann durch Erhöhung der Spannung beeinflusst werden. Infolgedessen die Gipfel bekommen schmaler und die Trennung verkürzt. Dennoch, die kürzere Zeit der Trennung kann dazu führen, dass nicht gelöst-Gipfel und die höhere Spannung erhöht die Joule Heizung und beschränkt den Effekt der schmalen Peaks durch elektrophoretische Dispersion7,8. Daher müssen die richtigen Bedingungen für jedes neue Protein untersucht bestimmt werden.

Kombination von CGE und ACE zum Sammeln von Informationen über den intrinsisch ungeordneten Charakter eines Proteins und seiner Bindungsverhalten ist ein neuartiger Ansatz. Die Charakterisierung der Probe durch Gelelektrophorese ist ein notwendiger Schritt zu beweisen, dass jeder mehrere Gipfel beobachtet Verunreinigungen nicht verwandt sind. Der Vorteil der CGE ist die Möglichkeit, die kürzere Zubereitungszeit und eine höhere Auflösung im Vergleich zu den klassischen Gel-Elektrophorese9zu automatisieren. Mit ACE für IDP verbindliche Experimente zeigt seine Überlegenheit gegenüber anderen Tests (z. B.immobilisiert Metall Affinitätschromatographie in den Ergebnissen) seit ACE nicht nur verbindliche Veranstaltungen zeigt. Darüber hinaus trennt verschiedene Konformere eines Proteins und kann zeigen Unterschiede in bindenden Liganden der vielfältigen Umformer. Dieses Verhalten kann nicht durch Methoden ohne eine Trennung während der Bindung Experiment nachgewiesen werden. Darüber hinaus ist die Analysezeit nur 6 min; Daher können die Ergebnisse in kürzester Zeit10berechnet werden. Auf der anderen Seite kommt die schnelle Analyse mit Einschränkungen bei der Schätzung der Zahl der Websites11verbindlich.

Die Zukunft dieses Ansatzes liegt in der Möglichkeit, Bildschirm möglichen Bindungspartner für Proteine, insbesondere Binnenvertriebene, in einer schnellen Weise. Es gibt einen schnellen Überblick über die unterschiedlichen Bindungsverhalten von den verschiedenen Umformer in einer Probe vorhanden. Die Verwendung einer größenabhängigen Trennung (z.B.CGE) für die Charakterisierung der Probe ist obligatorisch, da ACE sich Verunreinigungen und das Protein selbst unterscheiden kann. CGE bietet jedoch eine Vorstellung über die Anzahl der verschieden großen Arten. Die Anwendung von ACE als eine Bindung-Assay wurde bereits von Metall-Ionen Liganden auf alle geladenen Liganden12erweitert. Deshalb es können zusätzliche Informationen über die Wechselwirkungen zu jeder zeichnet sich verbindlich, da die Kombination der Trennung und der verbindlichen Test in einer Methode kann Beweise für jede geänderte Bindungsverhalten von verschiedene Konformere geben und posttranslationale Modifikationen, beziehungsweise.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Für die Bereitstellung der AtHIRD11 Proteinproben danken wir dankbar Masakuza Hara (Research Institute of Green Science and Technology, Universität von Shizuoka, Japan).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

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References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

Frage 138 intrinsisch ungeordneten Proteine Affinität Kapillarelektrophorese Biochemie Kapillare Gelelektrophorese verbindliche Assay Metall Liganden Dehydrins AtHIRD11
Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese
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Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

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