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Biochemistry

Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Este protocolo combina a caracterização de uma amostra de proteínas por eletroforese em gel capilar e uma triagem rápida ligação para ligantes carregadas por eletroforese capilar de afinidade. É recomendável para proteínas com uma estrutura flexível, tais como proteínas intrinsecamente desordenadas, para determinar as diferenças de ligação para diferentes conformistas.

Abstract

As plantas são fortemente dependentes de seu ambiente. A fim de ajustar-se às mudanças estressantes (por exemplo, a seca e alta salinidade), plantas superiores evoluem classes de proteínas intrinsecamente desordenadas (deslocados internos) para reduzir o stress oxidativo e osmótico. Este artigo utiliza uma combinação de electroforese em gel capilar (CGE) e electroforese de afinidade de turno de mobilidade (ACE) para descrever o comportamento de vinculação de conformistas diferentes de AtHIRD11 o IDP da Arabidopsis thaliana. CGE é usado para confirmar a pureza da AtHIRD11 e para excluir fragmentos, modificações do posttranslational e outras impurezas como razões para padrões complexos de pico. Nesta parte do experimento, os componentes de amostra diferentes são separados por um gel viscoso dentro de um capilar por suas massas diferentes e detectados com um detector de matriz de diodo. Depois disso, o comportamento de vinculação da amostra para vários íons metálicos é investigado pela ACE. Neste caso, o ligante é adicionado à solução tampão e a mudança no tempo de migração é medida para determinar se ocorreu um evento de ligação ou não. Uma das vantagens de usar a combinação de CGE e ACE para determinar o comportamento de vinculação de um IDP é a possibilidade de automatizar a electroforese do gel e o ensaio. Além disso, o CGE mostra um menor limite de detecção do que a eletroforese em gel de clássica e ACE é capaz de determinar o modo de ligação de um ligante de forma rápida. Além disso, ACE também pode ser aplicado a outras espécies carregadas de íons metálicos. No entanto, o uso desse método para experimentos de associação é limitado em sua capacidade de determinar o número de locais obrigatórios. No entanto, a combinação da CGE e ACE pode ser adaptada para caracterizar o comportamento de vinculação de qualquer amostra de proteína para inúmeros ligantes carregadas.

Introduction

As plantas são mais dependentes de seu ambiente do que muitas outras formas de vida. Uma vez que as plantas não podem mover-se para outros lugares, eles têm para se adaptarem às mudanças em seu ambiente (por exemplo, seca, fria e alta concentração de sal). Por conseguinte, plantas superiores desenvolveram proteínas de estresse especializadas como dehydrins, que cumprir tarefas múltiplas para reduzir o estresse de célula relacionada com alta salinidade. Estas proteínas ligam íons e água no interior das células, reduzir o estresse oxidativo vinculando Cu2 +-íons e interagir com fosfolipídios, bem como o citoesqueleto. Além disso, a vinculação Zn2 +-íons permite que estas proteínas que atuam como fatores de transcrição. Sua capacidade de Ca2 +-íons após fosforilação também tem sido relataram que1.

O multifuncional comportamento destas proteínas está relacionado com a ausência de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Por conseguinte, falta-lhes qualquer interações hidrofóbicas dentro da cadeia peptídica e, também, uma estrutura restrita. No entanto, porque estas proteínas possuem uma estrutura restritiva, eles podem ocupar diferentes conformistas nas mesmas condições. Portanto, eles podem ser descritos melhor como um conjunto de estruturas em vez de uma única conformação. Proteínas com essas propriedades são conhecidas como intrinsecamente desordenado proteínas (deslocados internos) e são um conceito amplamente utilizado para proteínas de estresse e crosstalk entre diferentes caminhos em pilhas eukaryotic2.

Dentre estes deslocados internos relacionados com o stress é AtHIRD11. É uma de Arabidopsis thalianada maioria altamente seca-expresso deslocados. Portanto, os conformistas diferentes podem ser separados por seu raio eficaz de cobrar taxa, e eletroforese capilar (CE) tem sido utilizado para mais investigações. Experiências anteriores de ACE demonstraram que as interações entre os íons de metais de transição como Cu2 +- Zn2 +-, Co2 +e Ni2 +e AtHIRD11-íons. Os resultados detalhados podem ser encontrados no Hara et al . 3 e Nachbar et al 4.

O método ACE que será usado aqui baseia-se em nossos trabalhos anteriormente publicados6. No entanto, a adição da acetanilida de marcador EOF para a amostra de proteína não é adequada. AtHIRD11 mostra padrões de pico largo, e adicionar o marcador EOF para a amostra seria disfarçar dois picos. Portanto, o marcador é usado em uma execução separada. Antes do comportamento de vinculação é examinado, confirma-se que os picos encontrados durante as experiências anteriores são de diferentes conformistas. Assim, CGE é usado para distinguir entre os conformistas de proteína, o borne-translational modificado, proteína e as impurezas, tais como fragmentos de AtHIRD11, por suas massas diferentes. Posteriormente, o comportamento de vinculação do exemplo AtHIRD11 caracterizadas para vários diferentes íons metálicos é investigado.

O objetivo deste artigo é descrever uma instalação experimental para distinguir entre um IDP e outros componentes de uma amostra para avaliar as diferenças entre o comportamento de vinculação de conformistas diferentes.

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Protocol

1. preparação dos instrumentos de eletroforese capilar

  1. Preparar os capilares
    1. Use um cortador de vidro para corte de sílica fundida-bare capilar com um revestimento externo de poliimida e um diâmetro interno de 50 µm em 33 cm (para o experimento CGE) e 30 cm (para o experimento ACE) longo capilares. Execute o corte em uma placa de vidro.
      Nota: As 2 configurações experimentais diferentes foram desenvolvidas para 2 diferentes instrumentos. Para utilizá-los em outros instrumentos, uma transferência de método adequado tem de ser realizada e o comprimento capilar deve ser ajustado para o tamanho permitido do instrumento.
    2. Use uma caneta para marcar no meio de uma janela de deteção de largura de 1 cm a uma distância de 24,5 cm de uma extremidade do capilar para o experimento da CGE e a 21,5 cm de uma extremidade do capilar para o experimento ACE (comprimento efectivo).
    3. Remova o revestimento externo de poliimida os capilares por queimá-lo com um maçarico, 0,5 cm antes e depois da marca. Da mesma forma, use o maçarico para remover 1 cm do revestimento em ambas as extremidades dos capilares.
      Nota: O comprimento efectivo pode variar ligeiramente desde que baseia-se no instrumento eletroforese capilar usado.
    4. Limpe as extremidades dos capilares e as janelas de deteção com etanol e um tecido macio.
      Nota: Os capilares não revestidos são menos flexível e mais propensos a quebrar.
  2. Instalar os capilares
    1. Instale um capilar no sistema com a janela de deteção perto da saída do CE.
      Nota: Os vários modelos de instrumento de CE têm sistemas de exploração diferente para os capilares. Consulte o manual do instrumento utilizado para as instruções exatas.

2. prepare as soluções

  1. Preparar as soluções para a análise da CGE
    1. Preparar o tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-reserva de SDS (100 mM/1% w/v) em pH 8.0.
      1. Use uma máscara respiratória e um estande para a pesagem de 1,00 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) em um copo de 100 mL.
      2. Adicionar 1,21 g de Tris para o copo de 100 mL e dissolvê-lo usando 50 mL de água desionizada e uma barra de agitação magnética em um agitador magnético.
      3. Colocar um eletrodo de pH na solução e ajustar o pH a 8.0 usando 1,0 M de HCl.
      4. Preencher a solução para um balão volumétrico de 100 mL e adicionar água desionizada até ao traço. Agitá-lo com cuidado para evitar qualquer formação de espuma.
    2. Prepare a solução de NaOH 0,1 M.
      1. Pese de 4,0 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL. Preenchê-lo até ao traço com água desionizada para fazer um estoque de 1 M.
      2. Use uma pipeta de bulbo de 10ml para transferir 10 mL desta solução para um balão volumétrico de 100 mL e encha-o até a marca com água desionizada.
    3. Prepare a solução de HCl 0,1 M.
      1. Colocar 10 mL de 10 M de HCl em um balão volumétrico de 100 mL com uma pipeta volumétrica de 10 mL e encha-o até a marca com água desionizada. Repita esta etapa para obter a 0.1 M HCl.
    4. Prepare a solução de amostra.
      1. Um tubo de 1 mL, pese 0,5 mg de proteína. Adicione 0,5 mL de tampão de gel de Tris-SDS da etapa 2.1.1 com uma micropipeta.
      2. Dissolva a proteína agitando suavemente para evitar qualquer formação de espuma e a degradação da proteína.
        Nota: Usar ultrasonication se a proteína não pode ser dissolvida conforme descrito; Evite qualquer aquecimento da solução.
    5. Preencha as soluções para os frascos.
      1. Filtre cada solução através de um 0,22 µm fluoreto de polivinilideno (PVDF) filtrar usando uma seringa adequada diretamente dentro do frasco.
        Nota: Para as soluções contendo gel, o pressão de retorno pode ser elevado devido à sua alta viscosidade.
      2. Prepare 15 frascos no total e marcar cada um para evitar quaisquer confusões.
        1. Encha 3 frascos com um amortecedor de gel disponível comercialmente sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) a pH 8.
          Nota: A utilização de um amortecedor de gel SDS comercialmente disponível fornece resultados mais precisos.
        2. Encha 1 frasco com 0.1 M NaOH e 1 frasco com 0.1 M HCl para irrigação.
        3. Encha 1 frasco com a solução de amostra.
        4. Encha 5 frascos com água desionizada e 4 frascos com 0,1 mL de água desionizada (mergulhando frascos).
          Nota: Os frascos de imersão são usados como frascos de resíduos durante a lavagem do capilar antes de cada corrida. As extremidades do capilares são mergulhadas em água para enxaguar os resíduos de gel.
  2. Preparar as soluções para a análise ACE
    1. Prepare a solução de NaOH 1 M.
      1. Pese de 4,0 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL.
      2. Preenchê-lo até ao traço com água desionizada para fazer um estoque de 1 M.
    2. Prepare o ácido de ethylendiaminetetraacetic de 0,1 M (EDTA) em uma solução de NaOH 0,1 M.
      1. Transferi 10 mL de 0.1 M NaOH num balão volumétrico de 100 mL com uma pipeta de bulbo de 10 mL. Preenchê-lo até ao traço com água desionizada.
      2. Pesar de 2,42 g de EDTA em um barco de pesagem e dissolver o composto sólido a 100 mL de 0.1 M de NaOH.
    3. Prepare o tampão Tris (30 mM).
      1. Adicione 3,63 g de Tris, 200 mL de água desionizada e uma barra de agitação em um copo de 500 mL. Coloque o copo sobre um prato de celeuma e ligá-lo.
      2. Colocar um eletrodo pH no copo e ajustar o pH para 7,4 usando 0.1 M HCl.
      3. Preencha a solução em um balão volumétrico de 1 L e encha até ao traço com água desionizada.
        Nota: Este procedimento tem de ser repetida ou num balão volumétrico de maior é necessária, já que mais de 1 L é necessário para a análise de toda.
    4. Preparar o fluxo de electroosmotic de acetanilida (EOF)-solução de marcador (60 µM).
      1. Adicione 6 mg de acetanilida e 100 mL de tampão Tris num balão volumétrico de 100 mL.
      2. Colocar o balão aferido em um banho ultra-sônico e ligue-o por 30 min.
    5. Prepare a solução de amostra (1 mg/mL).
      1. Coloque um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL em balança de precisão e adicione 0,3 mg de pó liofilizado AtHIRD11 dentro do tubo.
      2. Use uma micropipeta para adicionar 0,3 mL de um tampão Tris de 30 mM (pH 7,4) no tubo. Agite o tubo cuidadosamente para dissolver a proteína.
    6. Prepare as soluções de ligante.
      1. Prepare a solução CaCl2 (5 mM).
        1. Pegar um barco de pesagem, colocá-lo em uma balança analítica e pesar 36,76 mg de CaCl2* H2O.
        2. Utilizando uma micropipeta, irrigue o CaCl2* H2O partir com o peso do barco em um balão volumétrico de 50 mL com o tampão Tris previamente preparado.
        3. Encha o balão volumétrico com o tampão Tris até à marca.
      2. Prepare as soluções estoque restantes (5 mM).
        1. Repita a etapa 2.2.6.1 usando o outro metal sais em vez de CaCl2* H2O [MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr (NO3)2: 52,91 mg, MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl 2* 2 H2O: mg 41,47, CuCl2* 2 H2O: mg 42,62, ZnCl2: 3,41 mg e NiCl2* 6 H2O: mg 59,43].
          Nota: A ZnCl2 solução tem uma concentração de 0,5 mM. Uma vez que observaram-se fortes interações entre os íons e a parede interna do capilar, a concentração foi reduzida por um fator de 104.
      3. Prepare a solução de2 500 µM CaCl.
        1. 10 mL da solução-mãe CaCl2 e colocá-lo num balão volumétrico de 100 mL.
        2. Encha o balão aferido com um tampão Tris para a marca e agitar o frasco.
      4. Prepare a solução-250 µM CaCl2 .
        1. 5 mL de solução-mãe CaCl2 e colocá-lo num balão volumétrico de 100 mL.
        2. Encha o balão aferido com um tampão Tris para a marca e agitar o frasco.
      5. Repita as etapas 2.2.6.3 e 2.2.6.4 para outras soluções estoque.
    7. Preencha as soluções em frascos.
      Nota: Cada execução repetida precisa de um conjunto de entrada e saída de frascos. O uso de soluções de ligante fresco na entrada e na saída reduz as mudanças em tempo de migração após cada execução.
      1. Preencha a solução de2 250 µM CaCl em uma seringa de 10 mL.
      2. Coloque o filtro 0.22 µm PVDF na seringa e empurrar 2 mL da solução através do filtro, utilizando a seringa para descartar esta solução filtrada.
      3. Enchem o restante 250 µM CaCl2 da solução da seringa de 10 frascos até o volume máximo permitido. Marca todos como 250 µM CaCl 2 solução entrada tubo de ensaio.
      4. Preencha 10 frascos até que eles são meio-contém a 250 µM CaCl2 solução. Marca todos como 250 µM CaCl 2 solução saída tubo de ensaio.
      5. Repita os passos de 2.2.7.1 - 2.2.7.4 para as outras soluções metais contendo sal.
      6. Repita as etapas para cada par de frascos de entrada e saída usando o tampão Tris (pH 7,4) de 30 mM em vez disso.
        Nota: O 30 mmol/L Tris tampão pH 7,4 é usado entre as execuções, a fim de obter dados de tempo de migração para a proteína na ausência de íons metálicos. É necessário a fim de negligenciar as mudanças no EOF.
      7. Repita as etapas acima para um frasco usando a acetanilida solução de EOF-marcador (60 µM) em vez disso. Além disso, repita essas etapas usando a solução da amostra (1 mg/mL) em vez disso.

3. capilar Gel separação eletroforética

Nota: Preparar a separação de acordo com o método descrito no trabalho anterior por Nachbar et al 4.

  1. Preparar a análise
    1. Condição do capilar
      1. Ajuste o termostato de 23 ° C.
      2. Irrigue o capilar durante 10 minutos a 2,5 bar com 0.1 M NaOH.
      3. Irrigue o capilar por 5 min em 2,0 bar com 0.1 M HCl.
      4. Irrigue o capilar por 2 min em 2,0 bar com água desionizada.
    2. Preencher o buffer do gel de SDS
      1. Encha um capilar por 10 min em 2,0 bar com o amortecedor de gel SDS comercialmente disponível em pH 8.0.
    3. Irrigue o capilar antes de cada corrida de separação
      1. Irrigue o capilar para 3 min 4,0 bar com 0.1 M NaOH.
      2. Irrigue o capilar para 1 min no 4.0 bar com 0.1 M HCl.
      3. Irrigue o capilar para 1 min no 4.0 bar com água desionizada.
      4. Irrigue o capilar para 10 min a 4.0 bar com o amortecedor do gel de SDS.
  2. Executar a separação
    1. Injecte a solução de amostra para os experimentos CGE (etapa 2.1.4) direccionado aplicando 0.1 bar por 4 min na entrada.
    2. Aplicar-se -16.5 kV e uma pressão de 2,0 bar em ambas as extremidades do capilar por 25 min.

4. afinidade capilar análise eletroforética

Nota: Preparar a separação de acordo com o método descrito em trabalhos anteriores por Nachbar et al 4 e Alhazmi et al 5.

  1. Condição do capilar
    1. Ajuste o termostato de 23 ° C.
      Nota: A temperatura é usada de acordo com protocolos publicados e pode ser alterada para outras temperaturas4,5. No entanto, as interações são dependentes da temperatura e vão mudar nesse sentido.
    2. Liberar um capilar por 40 min em 2,5 bar com 0.1 M NaOH.
    3. Irrigue o capilar durante 10 minutos a 1,0 bar com água desionizada.
    4. Irrigue o capilar por 30 min em 1,0 bar com um tampão de 30 mM Tris (pH 7,4).
  2. Preparação para os métodos ACE
    1. Prepare o método para as medições sem ligantes.
      Nota: Acetanilida não foi adicionada à solução de amostra, como ele disfarça 2 picos de proteína.
      1. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com uma solução de EDTA 0,1 M.
      2. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com água desionizada.
      3. Enxágue do capilar para min 1,5 2,5 bar com um tampão Tris para equilibração.
      4. Injecte a solução de acetanilida para 6 s 0,05 bar e alterar a entrada e saída frascos para os frascos de tampão Tris.
      5. Aplicar 0,05 bar para 2.4 s para promover a solução de acetanilida da ponta do capilar mais dentro.
      6. Aplicar 10,0 kV para 6 min e detectar o pico de acetanilida no comprimento de onda de 200 nm.
      7. Repita os passos de 4.2.1.1. -4.2.1.6. usando a proteína da amostra em vez da solução de acetanilida e detectar todos os picos de proteína.
    2. Prepare o método para as medições com ligantes.
      1. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com uma solução de EDTA 0,1 M.
      2. Enxágue o capilar para 1 min 2,5 bar com água desionizada.
      3. Enxágue do capilar para min 1,5 2,5 bar com a solução de ligante para a equilibração.
      4. Injecte a solução de acetanilida para 6 s 0,05 bar e alterar a entrada e saída frascos para os frascos de tampão contendo ligand.
      5. Aplicar 0,05 bar para 2.4 s para promover a solução de acetanilida da ponta do capilar mais dentro.
      6. Aplicar 10,0 kV para 6 min e detectar o pico de acetanilida no comprimento de onda de 200 nm.
      7. Repita as etapas 4.2.2.1 - 4.2.2.6 usando a amostra de proteína em vez da solução de acetanilida e detectar todos os picos de proteína.
    3. Alternadamente, repita as etapas 4.2.1 e 4.2.2 para calcular a mudança nas relações custo-tamanho para várias interações proteína-metal íon (descritas na secção Resultados representante).
      1. Altere a solução de proteína após cada 60h para uma fresca.
        Nota: neste momento, o experimento pode ser pausado. Este procedimento é repetido pelo menos 10 x para cada concentração de ligantes desde que o padrão de pico varia ligeiramente de execução para execução. Se a solução é utilizada em mais de 60 h, as variações tornam-se muito grandes.
    4. Executar os métodos
      1. Execute o método descrito no passo 4.2.2, usando as soluções de ligante de terra alcalina (CaCl2, MgCl2, SrCl2 soluções e BaCl2).
      2. Continue usando o método descrito no passo 4.2.2, usando o MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2e NiCl2 soluções em vez das soluções de ligante de terra alcalina.
        Nota: Os cloretos de metais de transição este último mostraram interações mais fortes com o capilar e não podem ser removidos completamente. Estes resultam de interações em turnos na época de migração de execução para execução. Consequentemente, eles foram investigados após os outros íons metálicos.

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Representative Results

A Figura 1 mostra a electroferograma para a amostra de AtHIRD11 obtida durante os experimentos da CGE. O tamanho do peptídeo aumenta da esquerda para a direita. Pico número 4 tem a maior massa e indica a proteína intacta. Os menores picos de 2 e 3 representam as impurezas menores (por exemplo, produtos de degradação). O primeiro pico e a inconsistência de linha de base antes também podem ser reproduzidas sem a amostra de proteína. Portanto, está relacionada com o SDS do gel em si e não representa qualquer impurezas associadas a amostra.

A Figura 2 representa a electroferograma de acetanilida durante os experimentos ACE. A solução de acetanilida mostra apenas 1 pico elevado desde que não deve ter nenhuma impureza. O tempo de detecção para o pico máximo indica o tempo de migração do fluxo de electroosmotic (t.EOF) e é usado para o cálculo da interação.

A Figura 3 é a electroferograma da amostra AtHIRD11 durante o experimento ACE na ausência de SDS e íons metálicos. Mostra, além das 2 impurezas do electroferograma a CGE, pelo menos 5 picos que estão relacionados com a proteína em si. Pico 1 e 2 pode ser atribuído a impurezas desde seus tempos de migração indicam que eles são pequenos ou carga altamente positiva. Esta hipótese é suportada pelo aumento da altura do pico e a área ao longo do tempo. Desde picos de AtHIRD11 3 e 4 estão perto o EOF, eles quase não são cobrados e não podem ser separados em cada execução. Eles quase mostram sem interações e representam conformações sem resíduos acessíveis essenciais para as interações com os íons metálicos. AtHIRD11 mostra vários carga-para-tamanho-proporções diferentes devido a diferentes raios eficazes de diferentes conformistas. Estes conformistas podem mesclar continuamente. Posteriormente, picos de 5-7 são mais amplos do que os picos de proteína normal. Os grandes picos dar uma dica sobre a cinética das interações. Desde os picos não são estreitos, um rápido e uma conversão muito lenta entre os conformistas diferentes podem ser excluídos. Em ambos os casos, os picos seria separada da linha de base4. Neste caso, um passo de pré-equilíbrio pode alterar o padrão de pico e daria uma visão melhor sobre as interações com cinética mais lenta.

A Figura 4 mostra que a avaliação gráfica do tempo medido migração desloca-se na presença de vários íons metálicos para pico de 6. É representado pelo valor calculado ΔR/Rf. Esse valor indica o quanto uma mudança é forte (por seu valor) e a mudança global da carga de complexos de proteína-metal íon (pelo seu sinal). A fim de diferenciar entre uma interação significativa e uma mudança de uma coincidência, os intervalos de confiança para α = 0,05 são calculados também. Em casos onde o intervalo de confiança não é interseção com a linha zero, a interação é considerada significativa. Resultados são tidos em conta se o pico estava presente pelo menos 6 dos 10 electropherograms. Pico 6 não estava presente em qualquer corrida com 500 µM Co2 +. A lista completa das interações para cada pico AtHIRD11 é publicada em um trabalho anterior por Nachbar et al 4.

ΔR/Rf é calculado usando os rácios do tempo de migração Reu (na presença do ligante) e os rácios de tempo de migração Rf (na ausência do ligante):

Equation 1

Reu e Rf são calculados usando o pico superior vezes tproteína para os picos de amostra de proteína e o correspondente pico máximo para o marcador EOF- tEOF:

Equation 2

Para Reu, as vezes na presença do ligante são usado para o R,fe as vezes na ausência.

Figure 1
Figura 1 : Electroferograma para a separação de CGE da amostra no gel de buffer AtHIRD11. Pico 1 e os picos na sua esquerda podem ser observados mesmo sem uma injeção de amostra, para que sejam artefatos. Desde as massas e global áreas de pico do pico, 2 e 3 são menores do que a de pico 4, são prováveis impurezas, tais como produtos de degradação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Electroferograma da acetanilida EOF-marcador executar. A figura mostra apenas 1 pico para o composto sem amortecedor de gel de SDS e íons metálicos. Altura da parte superior do pico marca o fluxo electroosmotic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Exemplo para um electroferograma da separação da amostra durante os experimentos ACE, mostrando um padrão complexo de pico na ausência de qualquer metais íons. Pelo menos 7 picos poderiam ser identificados e relacionados com a proteína e suas 2 impurezas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Avaliação gráfica do comportamento de vinculação para os íons metálicos investigados usando uma concentração de 500 µM para pico 6. Os valores de ΔR/Rf dar uma dica sobre a intensidade do deslocamento do tempo da migração e, portanto, com a força as mudanças conformacionais na ligação do íon do metal. O sinal de ΔR/Rf indica se o complexo é mais positivamente ou negativamente carregado em comparação com a proteína não acoplada. As barras de erro indicam os intervalos de confiança para α = 0,05. Posteriormente, eles mostram a área onde o verdadeiro ΔR/Rf-valor pode ser encontrado com uma certeza de 95%. As barras vermelhas indicam os resultados calculados obtidos por dados insuficientes (o pico estava presente em menos de 6 electropherograms). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Para todos os experimentos do CE, a preparação do capilar é uma etapa crítica. Uma vez que é um tubo de vidro com um diâmetro pequeno, pode facilmente quebrar nos pontos onde o revestimento é removido quando está a ser tratado. A instalação do capilar dentro do instrumento deve ser feita com muito cuidado.

Os passos críticos envolvidos em usando o método ACE principalmente referem-se à instalação experimental. Outro passo crítico é encontrar os parâmetros de injeção de amostra certo. A quantidade injetada da amostra tem de ser suficiente para picos altos. No entanto, sobrecarregá-lo resultaria em um padrão de pico mal resolvidos com sobreposição de picos. Quando diminuir o volume injetado, é recomendável para diminuir a pressão de injeção em vez do tempo de injeção desde que demora algum tempo para o instrumento alcançar a pressão de injeção programada.

Invulgarmente grandes picos podem ser encontrados para amostras diferentes da proteína. Este padrão pode ser influenciado pelo aumento da tensão. Consequentemente, os picos ficar mais estreitos e o tempo de separação é reduzido. No entanto, o menor tempo de separação pode resultar em picos não-resolvidos e a tensão mais alta aumenta o aquecimento Joule e limita o efeito de picos estreitos por dispersão eletroforética7,8. Portanto, as condições têm de ser determinado para cada nova proteína examinada.

Combinando a CGE e ACE para reunir informações sobre o caráter intrinsecamente desordenado de uma proteína e seu comportamento de vinculação é uma nova abordagem. A caracterização da amostra por eletroforese em gel é um passo necessário para provar que qualquer vários picos observados não estão relacionados com impurezas. A vantagem da CGE é a possibilidade de automatizar, o menor tempo de preparação e uma resolução mais alta em comparação com a eletroforese de gel clássica9. Usando ACE para IDP vinculação experimentos mostra sua superioridade no sentido de outros ensaios (por exemplo, cromatografia de afinidade de metal nos resultados de imobilizada) desde ACE não só mostra eventos de ligação. Além disso, ele separa conformistas diferentes de uma proteína e pode revelar diferenças de ligantes de vinculação de diversas conformistas. Esse comportamento não pode ser detectado por métodos sem uma separação durante a experiência de vinculação. Além disso, o tempo de análise é apenas 6 min; Portanto, os resultados podem ser calculados em um curto espaço de tempo de10. Por outro lado, a análise rápida vem com limitações em estimar o número de ligação de sites11.

O futuro desta abordagem reside na possibilidade de potenciais parceiros de ligação tela para proteínas, especialmente os deslocados internos, de forma rápida. Dá uma visão geral do comportamento de ligação diferente dos conformistas vários presentes em uma amostra. O uso de uma separação de tamanho-dependente (por exemplo, CGE) para a caracterização da amostra é obrigatório desde que ACE em si não pode distinguir entre as impurezas e a proteína em si. No entanto, a CGE dá uma ideia sobre o número de espécies de diferentes tamanhos. A aplicação de ACE como um ensaio foi estendida já de ligantes do íon do metal para qualquer ligante carregado12. Portanto, pode adicionar informações adicionais sobre as interações para qualquer caracterizada vinculativa, desde que a combinação da separação e o ensaio em um método pode dar provas de qualquer comportamento de vinculação alterada de conformistas diferentes e modificação pós-traducional, respectivamente.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Grato agradecemos Masakuza Hara (Instituto de pesquisa de verde ciência e tecnologia, Universidade de Shizuoka, Japão) para fornecer as amostras de proteínas AtHIRD11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

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References

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Bioquímica edição 138 intrinsecamente desordenadas proteínas eletroforese capilar de afinidade eletroforese em gel capilar vinculando o ensaio ligantes de metal dehydrins AtHIRD11
Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar
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Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

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