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Biochemistry

Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Ce protocole combine la caractérisation d’un échantillon de protéines par électrophorèse capillaire et une projection de liaison rapide avec les ligands chargés par électrophorèse capillaire en affinité. Il est recommandé pour les protéines avec une structure souple, comme les protéines intrinsèquement désordonnées, afin de déterminer les différences dans la liaison des différents conformères.

Abstract

Les plantes sont fortement dépendantes de leur environnement. Pour s’adapter à des changements stressants (par exemple, la sécheresse et à une salinité élevée), les plantes supérieures évoluent classes de protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) pour réduire le stress oxydatif et osmotique. Cet article utilise une combinaison de l’électrophorèse capillaire (CGE) et de la mobilité Maj affinité électrophorèse (ACE) pour décrire le comportement de liaison de différents conformères de l’IDP AtHIRD11 d’Arabidopsis thaliana. CGE est utilisé pour confirmer la pureté de AtHIRD11 et d’exclure les fragments, modifications post-traductionnelles et autres impuretés comme raisons de modèles complexes de pointe. Dans cette partie de l’expérience, les différents exemples de composants sont séparés par un gel visqueux à l’intérieur d’un tube capillaire par leurs différentes masses et détectés par un détecteur à barrettes de diodes. Par la suite, le comportement de liaison de l’échantillon vers différents ions métalliques est étudié par l’ACE. Dans ce cas, le ligand est ajouté à la solution tampon et le décalage dans le temps de migration est mesuré afin de déterminer si un événement de liaison a eu lieu ou non. Un des avantages de l’utilisation de la combinaison de la CGE et ACE pour déterminer le comportement de liaison d’un PCI est la possibilité d’automatiser l’électrophorèse de gel et l’essai de liaison. En outre, CGE indique une limite inférieure de détection que l’électrophorèse de gel classique et ACE est en mesure de déterminer le mode de liaison d’un ligand d’une manière rapide. En outre, ACE peut également être appliqué à d’autres espèces chargées que les ions métalliques. Cependant, l’utilisation de cette méthode pour les expériences de liaison est limitée dans sa capacité à déterminer le nombre de sites de liaison. Néanmoins, la combinaison de la CGE et ACE peut être adaptée pour caractériser le comportement de liaison de n’importe quel échantillon de protéines vers nombreux ligands chargés.

Introduction

Les plantes sont plus dépendantes de leur environnement que beaucoup d’autres formes de vie. Étant donné que les plantes ne peuvent pas se déplacer à d’autres endroits, ils doivent s’adapter à des changements dans leur environnement (p. ex., sécheresse, froides et hautes concentrations salines). Par conséquent, plantes supérieures développé des protéines de stress spécialisés comme les alignements, qui remplissent des tâches multiples afin de réduire le stress cellulaire lié à une salinité élevée. Ces protéines se lient l’eau et des ions à l’intérieur des cellules, réduire le stress oxydatif en liant Cu2 +-ions et d’interagir avec les phospholipides ainsi que les cytosquelettes. En outre, liaison Zn2 +-ions permet ces protéines d’agir comme des facteurs de transcription. Leur capacité à fixer Ca2 +-ions après phosphorylation a été également rapporté1.

Le comportement multifonctionnel de ces protéines est lié à l’absence de résidus d’acides aminés hydrophobes. Par conséquent, ils n’ont pas toutes les interactions hydrophobes à l’intérieur de la chaîne peptidique et aussi une structure restreinte. Toutefois, étant donné que ces protéines n’ont pas une structure restrictive, ils peuvent occuper différents conformères dans les mêmes conditions. Donc, ils peuvent mieux décrits comme un ensemble de structures plutôt que comme une seule conformation. Les protéines possédant ces propriétés sont connues comme intrinsèquement désordonnées des protéines (PDI) et sont un concept largement utilisé pour les protéines de stress et de la diaphonie entre les différentes voies dans les cellules eucaryotes2.

Un de ces déplacés liés au stress est AtHIRD11. C’est un des déplacés de sécheresse fortement exprimés la plupart de Arabidopsis thaliana. Par conséquent, les conformères différents peuvent être séparées par leur rayon effectif pour charger le rapport et électrophorèse capillaire (EC) a été utilisé pour complément d’enquête. Des expériences antérieures de ACE a démontré les interactions entre les AtHIRD11 et les ions de métaux de transition tels que Cu2 +- Zn2 +-, Co2 +et Ni2 +-ions. Les résultats détaillés se trouvent dans le Hara et al. 3 et Nachbar et al. 4.

La méthode ACE qui sera utilisée ici est issue de nos plus tôt les œuvres publiées6. Toutefois, l’ajout de l’acétanilide de marqueur du folklore à l’échantillon de protéines n’est pas adapté. AtHIRD11 montre motifs pic large et ajouter le marqueur du folklore à l’échantillon serait dissimuler deux pics. Par conséquent, le marqueur est utilisé dans un run séparé. Avant que le comportement de liaison est examiné, il est confirmé que les pics trouvées au cours d’expériences précédentes proviennent de différents conformères. Ainsi, CGE est utilisé pour distinguer entre les conformères de protéine, le poteau-de translation modifiées protéine et impuretés, telles que des fragments de AtHIRD11, par leurs masses différentes. Ensuite, le comportement de liaison de l’échantillon AtHIRD11 caractérisée vers divers différents ions métalliques est étudiée.

Le but de cet article est de décrire un dispositif expérimental de distinguer entre un IDP et autres composants d’un échantillon afin d’évaluer les différences dans le comportement de liaison de différents conformères.

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Protocol

1. préparation des Instruments électrophorèse capillaire

  1. Préparer les capillaires
    1. Utilisez un coupe-verre pour couper une silice fondue nu capillaire avec un revêtement extérieur de polyimide et 50 µm de diamètre intérieur en 33 cm (pour l’expérience de la CGE) et les capillaires long de 30 cm (pour l’expérience ACE). Effectuer la coupe sur une plaque de verre.
      Remarque : Les 2 configurations expérimentales différentes ont été développées pour 2 instruments différents. Afin de les utiliser sur d’autres instruments, un transfert de méthode appropriée doit être effectuée et la longueur capillaire doit être adaptée à la longueur autorisée de l’instrument.
    2. Utilisez un stylo pour marquer au milieu d’une fenêtre de détection large de 1 cm à une distance de 24,5 cm d’une extrémité du capillaire pour l’expérience de la CGE et à 21,5 cm d’une extrémité du capillaire pour l’expérience ACE (longueur effective).
    3. Enlever le revêtement extérieur de polyimide des capillaires par brûler avec un chalumeau, 0,5 cm avant et après la marque. De même, utiliser le chalumeau pour enlever 1 cm de l’enduit aux deux extrémités des capillaires.
      Remarque : La longueur effective peut varier légèrement car il repose sur l’instrument de l’électrophorèse capillaire utilisé.
    4. Nettoyez l’extrémité des capillaires et les fenêtres de détection avec l’éthanol et des tissus mous.
      Remarque : Les capillaires non couchés sont moins flexibles et susceptibles de se briser.
  2. Installer les capillaires
    1. Installer un capillaire dans CE système avec la fenêtre de détection près de la sortie.
      Remarque : Les divers modèles d’instrument CE ont des systèmes d’exploitation différents pour les capillaires. Reportez-vous au manuel de l’instrument utilisé pour les instructions exactes.

2. préparer les Solutions

  1. Préparer les solutions pour l’analyse de la CGE
    1. Préparer le tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris)-tampon de SDS (100 mM/1% p/v) à un pH de 8,0.
      1. Utiliser un masque respiratoire et une cabine pour le pesage 1,00 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans un bécher de 100 mL.
      2. Ajouter 1,21 g de Tris dans le bécher de 100 mL et dissoudre à l’aide de 50 mL d’eau désionisée et un bar d’agitation magnétique sur un agitateur magnétique.
      3. Mettre une électrode pH dans la solution et ajuster le pH à 8.0 avec 1,0 M HCl.
      4. Verser la solution dans une fiole jaugée de 100 mL et ajouter de l’eau désionisée jusqu'à la marque. Secouez-le doucement afin d’éviter toute formation de mousse.
    2. Préparer la solution de NaOH 0,1 M.
      1. Environ 4,0 g de NaOH dans une fiole jaugée de 100 mL. Remplir jusqu’au trait avec de l’eau déminéralisée pour faire un stock de 1 M.
      2. Utiliser une pipette de 10 mL ampoule transférer 10 mL de cette solution dans une fiole jaugée de 100 mL et le remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée.
    3. Préparer la solution de HCl 0,1 M.
      1. Mettre 10 mL de 10 M HCl dans une fiole jaugée de 100 mL à l’aide d’une pipette jaugée de 10 mL et remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée. Répétez cette étape pour obtenir le 0,1 M HCl.
    4. Préparer la solution de l’échantillon.
      1. Peser 0,5 mg de la protéine dans un tube de 1 mL. Ajouter 0,5 mL du tampon Tris-SDS gel de l’étape 2.1.1 avec une micropipette.
      2. Dissoudre la protéine en agitant doucement afin d’éviter toute formation de mousse et la dégradation de la protéine.
        Remarque : Utilisez ultrasonication si la protéine ne peut pas être dissous comme décrit ; éviter tout échauffement de la solution.
    5. Remplissez les solutions dans les flacons.
      1. Filtrer chaque solution à travers un 0,22 µm Polyfluorure de vinylidène (PVDF) filtre en utilisant une seringue adéquate directement dans le flacon.
        NOTE : Pour les solutions contenant du gel, la pression de retour peut être élevée en raison de sa haute viscosité.
      2. Préparer 15 flacons au total et marquez-les pour éviter toute confusion.
        1. Remplir 3 flacons avec un tampon de gel disponibles dans le commerce de sodium dodecyl sulfate (SDS) à un pH de 8.
          NOTE : L’utilisation d’un tampon de gel SDS disponible dans le commerce donne des résultats plus précis.
        2. Remplissez 1 flacon avec NaOH 0,1 M et 1 flacon de 0,1 M HCl pour le rinçage.
        3. Remplissez 1 flacon avec la solution de l’échantillon.
        4. Remplir 5 fioles d’eau désionisée et 4 flacons avec 0,1 mL d’eau désionisée (trempage des flacons).
          Remarque : Les flacons de trempage sont utilisés comme déchets flacons pendant le rinçage du capillaire avant chaque course. Les extrémités capillaires sont trempées dans l’eau afin de rincer les résidus de gel.
  2. Préparer les solutions pour l’analyse de l’ACE
    1. Préparer la solution de NaOH 1 M.
      1. Environ 4,0 g de NaOH dans une fiole jaugée de 100 mL.
      2. Remplir jusqu’au trait avec de l’eau déminéralisée pour faire un stock de 1 M.
    2. Préparer l’acide ethylendiaminetetraacetic de 0,1 M (EDTA) dans une solution de NaOH 0,1 M.
      1. Transférer 10 mL de NaOH 0,1 M dans une fiole jaugée de 100 mL à l’aide d’une pipette d’ampoule de 10 mL. Remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée.
      2. Environ 2,42 g d’EDTA sur un bateau de pesage et dissoudre le composé solide dans le 100 mL de NaOH 0,1 M.
    3. Préparer le tampon Tris (30 mM).
      1. Ajouter 3,63 g de Tris, 200 mL d’eau désionisée et un bar en émoi dans un bécher de 500 mL. Placer le bécher sur une plaque de remuer et allumez-le.
      2. Mettre une électrode de pH dans le bécher et ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 M HCl.
      3. Remplissez la solution dans une fiole jaugée de 1 L et remplir jusqu’au trait avec de l’eau désionisée.
        Remarque : Cette procédure doit être répétée ou une fiole jaugée de plus grande est nécessaire, car plus de 1 L est nécessaire pour l’analyse entière.
    4. Préparer l’électroosmotique acétanilide (EOF)-solution de marqueur (60 µM).
      1. Ajouter 6 mg d’acétanilide et 100 mL de tampon Tris dans une fiole jaugée de 100 mL.
      2. Placer la fiole dans un bain à ultrasons et l’allumer pendant 30 min.
    5. Préparer la solution d’échantillon (1 mg/mL).
      1. Mettez un tube à microcentrifugation 0,5 mL sur une balance de précision et ajoutez 0,3 mg de poudre lyophilisée de AtHIRD11 dans le tube.
      2. Utiliser une micropipette pour ajouter 0,3 mL de tampon Tris 30 mM (pH 7,4) dans le tube. Agiter le tube soigneusement afin de dissoudre les protéines.
    6. Préparer les solutions de ligand.
      1. Préparer la solution mère de CaCl2 (5 mM).
        1. Prendre un bateau de pesage, le mettre sur une balance analytique et peser 36,76 mg de CaCl2* H2O.
        2. À l’aide d’une micropipette, rincer le CaCl2* H2O de la pesée en bateau dans une fiole jaugée de 50 mL avec le tampon Tris préalablement préparée.
        3. Remplir la fiole jaugée avec le tampon Tris jusqu’au repère.
      2. Préparer les solutions restantes (5 mM).
        1. Répétez l’étape 2.2.6.1 à l’aide de l’autre métal sels au lieu de CaCl2* H2O [MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr (NO3)2: 52,91 mg, MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl 2* 2 H2o : 41,47 mg, CuCl2* 2 H2o : 42,62 mg, ZnCl2: 3,41 mg et NiCl2* 6 H2o : 59,43 mg].
          Remarque : La solution de ZnCl2 a une concentration de 0,5 mM. Étant donné les fortes interactions entre les ions et la paroi capillaire ont été observées, la concentration a été réduite d’un facteur 104.
      3. Préparer la solution de2 500 µM CaCl.
        1. Compléter à 10 mL de la solution mère de CaCl2 et le mettre dans une fiole jaugée de 100 mL.
        2. Remplir la fiole jaugée avec un tampon Tris au trait et agiter la fiole.
      4. Préparer la solution de2 250 µM CaCl.
        1. Remplir 5 mL de la solution mère de CaCl2 et le mettre dans une fiole jaugée de 100 mL.
        2. Remplir la fiole jaugée avec un tampon Tris au trait et agiter la fiole.
      5. Répétez les étapes 2.2.6.3 et 2.2.6.4 pour les autres solutions courantes.
    7. Remplissez les solutions dans les flacons.
      Remarque : Chaque passage répété a besoin d’une série de flacons d’entrée et de sortie. L’utilisation de solutions de ligand fraîches à l’entrée et la sortie permet de réduire les déplacements dans le temps de migration après chaque course.
      1. Remplissez la solution de2 250 µM CaCl dans une seringue de 10 mL.
      2. Mettre un filtre PVDF 0,22 µm sur la seringue et le poussoir 2 mL de la solution à travers le filtre à l’aide de la seringue afin d’écarter cette solution filtrée.
      3. Remplir 10 flacons à la concurrence de la quantité autorisée avec la solution restante de2 ACIC de 250 µM de la seringue. Marquez-les comme 250 vial µM CaCl 2 solution inlet.
      4. Remplir 10 flacons jusqu'à ce qu’ils sont remplis à moitié avec la solution de2 250 µM CaCl. Marquez-les comme 250 vial µM CaCl 2 solution prise.
      5. Répétez les étapes 2.2.7.1 - 2.2.7.4 pour d’autres les solutions métalliques contenant du sel.
      6. Répétez les étapes pour chaque paire de flacons d’entrée et de sortie à l’aide de la solution tampon (pH 7,4) Tris de 30 mM au lieu de cela.
        Remarque : Le 30 mmol/L de tampon Tris pH 7,4 est utilisé entre les pistes afin d’obtenir des données de temps de migration de la protéine en absence d’ions métalliques. Il est nécessaire pour négliger les changements dans les expressions du folklore.
      7. Répétez les étapes ci-dessus pour un flacon à l’aide de l’acétanilide solution (60 µM) EOF-marqueur à la place. En outre, répétez ces étapes en utilisant la solution d’échantillon (1 mg/mL) à la place.

3. capillaire Gel séparation électrophorétique

Remarque : Préparer la séparation selon la méthode décrite dans une étude antérieure par Nachbar et al. 4.

  1. Préparer l’analyse
    1. Condition du capillaire
      1. Réglez le thermostat à 23 ° C.
      2. Rincez le capillaire pendant 10 min à 2,5 bars avec NaOH 0,1 M.
      3. Rincez le capillaire pendant 5 min à 2,0 bar avec du HCl 0,1 M.
      4. Rincez le capillaire pendant 2 min à 2,0 bar avec de l’eau désionisée.
    2. Remplir le tampon de gel SDS
      1. Remplir un capillaire pendant 10 min à 2,0 bar avec le tampon de gel SDS disponible dans le commerce à un pH de 8,0.
    3. Rincer le tube capillaire avant chaque course de séparation
      1. Rincez le capillaire pendant 3 min à 4,0 bar avec NaOH 0,1 M.
      2. Rincez le capillaire pendant 1 min à 4,0 bar avec du HCl 0,1 M.
      3. Rincez le capillaire pendant 1 min à 4,0 bar avec de l’eau désionisée.
      4. Rincez le capillaire pendant 10 min à 4,0 bar avec le tampon de gel SDS.
  2. Exécutez la séparation
    1. Injecter la solution de l’échantillon pour les expériences de la CGE (étape 2.1.4) hydrodynamique en appliquant 0.1 bar pendant 4 min à l’entrée.
    2. Appliquer -16,5 kV et une pression de 2,0 bars aux deux extrémités du capillaire pendant 25 min.

4. l’analyse par électrophorèse capillaire affinity

Remarque : Préparer la séparation selon la méthode décrite dans des travaux antérieurs par Nachbar et al. 4 et Alhazmi et al. 5.

  1. Condition du capillaire
    1. Réglez le thermostat à 23 ° C.
      Remarque : La température est utilisée selon les protocoles publiés et peut être modifiée à d’autres températures4,5. Cependant, les interactions dépendent de la température et changeront en conséquence.
    2. Rincer un capillaire pendant 40 min à 2,5 bars avec NaOH 0,1 M.
    3. Rincez le capillaire pendant 10 min à 1,0 bar avec de l’eau désionisée.
    4. Rincez le capillaire pendant 30 min à 1,0 bar avec un tampon Tris de 30 mM (pH 7,4).
  2. Préparation pour les méthodes de l’ACE
    1. Préparer la méthode pour la mesure sans ligands.
      Remarque : Acétanilide n’a pas ajouté à la solution de l’échantillon, comme il déguise 2 pics de protéines.
      1. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars avec une solution d’EDTA 0,1 M.
      2. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars à l’eau désionisée.
      3. Rincez le capillaire pendant min 1,5 à 2,5 bars avec un tampon Tris d’équilibration.
      4. Injecter la solution acétanilide pour de 6 s à 0,05 bar et change l’entrée et sortie pour les flacons de tampon Tris.
      5. Appliquer 0,05 bar pour 2.4 s afin de pousser la solution acétanilide de la pointe de l’intérieur plu capillaire.
      6. Appliquer 10.0 kV pendant 6 min et détecter le pic de l’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nm.
      7. Répétez les étapes 4.2.1.1. -4.2.1.6. en utilisant la protéine Goûtez au lieu de la solution de l’acétanilide et détecter tous les sommets de la protéine.
    2. Préparer la méthode pour les mesures avec les ligands.
      1. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars avec une solution d’EDTA 0,1 M.
      2. Rincez le capillaire pendant 1 min à 2,5 bars à l’eau désionisée.
      3. Rincez le capillaire pendant min 1,5 à 2,5 bars avec la solution de ligand pour l’équilibration.
      4. Injecter la solution acétanilide pour de 6 s à 0,05 bar et change l’entrée et sortie pour les flacons contenant du ligand de tampon.
      5. Appliquer 0,05 bar pour 2.4 s afin de pousser la solution acétanilide de la pointe de l’intérieur plu capillaire.
      6. Appliquer 10.0 kV pendant 6 min et détecter le pic de l’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nm.
      7. Répétez les étapes 4.2.2.1 - 4.2.2.6 à l’aide de l’échantillon de protéine au lieu de la solution de l’acétanilide et détecter tous les sommets de la protéine.
    3. Alternativement, répétez étapes 4.2.1 et 4.2.2 afin de calculer le changement dans les rapports de charge-taille pour les diverses interactions de protéine-metal ion (décrites sous la rubrique Résultats représentant).
      1. Remplacez la solution protéique après toutes les 60 h une nouvelle.
        Remarque : À ce stade, l’expérience peut être suspendue. Cette procédure est répétée au moins 10 x pour chaque concentration des ligands comme le modèle de pointe varie légèrement d’une exécution à l’exécution. Si la solution est utilisée plus de 60 h, les variations deviennent trop grandes.
    4. Exécutez les méthodes
      1. Exécutez la méthode décrite dans l’étape 4.2.2, en utilisant les solutions de ligand alcalino-terreux (CaCl2, MgCl2, BaCl2et LVERS2 solutions).
      2. Continuer à utiliser la méthode décrite dans l’étape 4.2.2, utilisant le MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2et NiCl2 solutions au lieu des solutions de ligand alcalino-terreux.
        Remarque : Les chlorures de métaux de transition ce dernier montrent des rapports plus étroits entre le capillaire et ne peuvent être éliminés complètement. Ces résultat d’interactions dans se déplace dans le temps de la migration d’une exécution à l’exécution. Par conséquent, ils ont été étudiés après les autres ions métalliques.

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Representative Results

La figure 1 montre l’électrophorégramme pour l’échantillon de AtHIRD11 obtenu au cours des expériences de la CGE. La taille de peptide augmente de gauche à droite. Nombre maximum 4 possède la plus grosse masse et indique la protéine intacte. Les petits pics 2 et 3 représentent les impuretés plus petites (p. ex., produits de dégradation). Le premier pic et l’incohérence de la ligne de base avant pourraient également être reproduites sans l’échantillon de protéine. Par conséquent, il est lié à la SDD gel lui-même et ne représente pas toutes les impuretés associées à échantillon.

La figure 2 représente l’électrophorégramme pour acétanilide au cours des expériences de l’ACE. La solution de l’acétanilide montre seulement 1 pic élevé puisqu’il ne devrait avoir aucune impureté. Le temps de détection pour la pic maximal indique le temps de migration de l’écoulement électroosmotique (EOFt) et est utilisé pour le calcul de l’interaction.

La figure 3 est l’électrophorèse de l’échantillon AtHIRD11 pendant l’expérience ACE en l’absence de SDS et des ions métalliques. Il montre, outre les 2 impuretés de l’électrophorégramme CGE, au moins 5 pics qui sont liées à la protéine elle-même. PIC 1 et 2 peut être assigné à impuretés puisque leur temps de migration indiquent qu’ils sont petits ou très positivement chargés. Cette hypothèse est soutenue par l’augmentation de la hauteur du PIC et de la région au fil du temps. AtHIRD11 pics 3 et 4 étant à proximité de l’EOF, ils sont facturés guère et ne peuvent être séparés dans chaque course. Ils ont presque aucune interaction et représentent des conformations sans résidus accessibles essentiels pour les interactions avec les ions métalliques. AtHIRD11 montre plusieurs différentes-à-taille-rapports charge en raison de différents rayons efficaces des différents conformères. Ces conformères peuvent fusionner en permanence. Par la suite, pics de 5 à 7 sont plus larges que les pics de protéines habituelles. Les pics larges donnent un indice sur la cinétique des interactions. Étant donné que les sommets ne sont pas étroits, un rapide et une conversion très lente entre les différents conformères peuvent être exclus. Dans les deux cas, les pics serait séparée de base4. Dans ce cas, une étape préalable d’équilibration peut changer le modèle de pointe et donnerait une meilleure compréhension des interactions avec une cinétique plus lente.

La figure 4 montre que l’évaluation graphique du temps mesuré migration déplace en présence de différents ions métalliques pour max. 6. Il est représenté par la valeur calculée ΔR/Rf. Cette valeur indique la force un changement est (par sa valeur) et le changement global de la charge de complexes protéine-metal ions (par son signe). Afin de différencier une interaction significative et un changement d’une coïncidence, les intervalles de confiance pour α = 0,05 sont calculées ainsi. Dans les cas où l’intervalle de confiance n’est pas intersection avec la ligne du zéro, l’interaction est considérée comme aussi importante. Résultats sont pris en compte si le Sommet était présent dans au moins 6 des 10 électrophérogrammes. PIC 6 n’était pas présent à n’importe quel terme avec 500 µM Co2 +. La liste complète des interactions pour chaque pic AtHIRD11 est publiée dans un ouvrage antérieur par Nachbar et al. 4.

ΔR/Rf est calculée d’après les rapports de temps de migration Rj’ai (en présence du ligand) et les rapports de temps de migration Rf (en l’absence du ligand) :

Equation 1

Rj’ai et Rf sont calculés à l’aide de la pointe fois supérieure tprotéine pour les pics d’échantillon de protéines et le dépaysement de pic correspondant pour le marqueur EOF- tEOF :

Equation 2

Pour Rj’ai, le temps en présence du ligand est utilisé pour le Rfet le times en absence.

Figure 1
Figure 1 : Electrophoregramme pour la séparation de la CGE de l’échantillon de AtHIRD11 dans le tampon de gel de. PIC 1 et les sommets de son gauche peuvent être observés même sans une injection de l’échantillon, alors qu’ils sont des objets d’art. Depuis les masses et l’ensemble des pics du pic 2 et 3 sont plus petits que celui du pic 4, ce sont les impuretés probables, tels que les produits de dégradation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Électrophorèse de l’acétanilide EOF-marqueur exécuter. La figure montre seulement 1 pic du composé sans ions métalliques et tampon de gel SDS. Le temps du haut sommet marque l’écoulement électroosmotique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple d’électrophorégramme de la séparation de l’échantillon au cours des expériences ACE montrant un motif complexe pointe en l’absence de toute ions métalliques. Au moins 7 pics pourraient être identifiés et associés à la protéine et de ses 2 impuretés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Graphical évaluer le comportement de liaison vers les ions métalliques étudiés en utilisant une concentration de 500 µM pour max. 6. Les valeurs de ΔR/Rf donner un indice sur l’intensité de la Maj de temps de migration et par conséquent sur la force des changements conformationnels sur la liaison de l’ion métallique. Le signe de ΔR/Rf indique si le complexe est plus positivement ou négativement chargé par rapport à la protéine non liée. Les barres d’erreur indiquent les intervalles de confiance pour α = 0,05. Par la suite, ils montrent la zone où le vrai ΔR/Rf-valeur peut être trouvée avec une certitude de 95 %. Les barres rouges indiquent les résultats calculés obtenus par insuffisant (le pic était présent dans moins de 6 électrophérogrammes). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour toutes les expériences de CE, la préparation du capillaire est une étape cruciale. Puisque c’est un tube de verre de petit diamètre, il peut facilement se casser dans les endroits où le revêtement est supprimé lorsqu’il est contrôlé. L’installation du capillaire dans l’instrument devrait être faite très soigneusement.

Les étapes critiques liés à l’utilisation de la méthode ACE principalement concernent le montage expérimental. Une autre étape cruciale consiste à trouver les paramètres d’injection échantillon droit. La quantité injectée de l’échantillon doit être suffisant pour les hauts sommets. Toutefois, une surcharge il se traduirait par un modèle de pointe mal résolus avec chevauchement des pics. Pour diminuer le volume injecté, il est recommandé de diminuer la pression d’injection au lieu du temps d’injection, car il faut du temps pour l’instrument atteindre la pression d’injection programmée.

On trouvera des pics inhabituellement larges pour échantillons de protéines différentes. Ce modèle peut être influencé par l’augmentation de la tension. En conséquence, les sommets obtenir plus étroits et le temps de séparation est réduit. Néanmoins, la durée de la séparation peut entraîner des sommets n’est pas résolue et une tension plus élevée augmente le Joule chauffage et limite l’effet des pics étroits par dispersion électrophorétique7,8. Donc, les conditions doivent être déterminés pour chaque nouvelle protéine examiné.

Combinant la CGE et ACE pour recueillir des informations sur le caractère intrinsèquement désordonné d’une protéine et son comportement de liaison est une nouvelle approche. La caractérisation de l’échantillon par électrophorèse sur gel est une étape nécessaire pour prouver que n’importe quel pics multiples observés ne sont pas liées aux impuretés. L’avantage de la CGE est la possibilité d’automatiser, le temps de préparation plus court et une résolution plus élevée par rapport à l' électrophorèse de gel classique9. En utilisant ACE pour IDP contraignant expériences montre sa supériorité envers les autres épreuves (p. ex., immobilisée par chromatographie d’affinité métallique dans les résultats) depuis ACE non seulement montre la liaison des événements. De plus, il sépare les différents conformères d’une protéine et peut révéler des différences dans les ligands de liaison des différents conformères. Ce comportement ne peut être détecté par des méthodes sans une séparation pendant l’expérience de liaison. En outre, le temps d’analyse est seulement 6 min ; par conséquent, les résultats peuvent être calculées en un court laps de temps10. En revanche, l’analyse rapide est livré avec limitations dans l’estimation du nombre de liaison de sites11.

L’avenir de cette approche réside dans la possibilité d’éventuels partenaires de liaison écran pour les protéines, en particulier les personnes déplacées, d’une manière rapide. Il donne un aperçu rapide du comportement des différents conformères présents dans un échantillon de liaison différente. L’utilisation d’une séparation de la fonction de la taille (p. ex., CGE) pour la caractérisation des échantillons est obligatoire puisque l’ACE lui-même ne peut pas distinguer les impuretés et la protéine elle-même. Cependant, CGE donne une idée sur le nombre d’espèces de taille différente. L’application de ACE comme un essai de liaison a été prorogée déjà de ligands de l’ion métallique à n’importe quel ligand chargé12. Par conséquent, il peut ajouter des informations supplémentaires sur les interactions quelle caractérisé binding, depuis la combinaison de la séparation et l’essai de liaison dans une seule méthode peut témoigner de tout comportement de liaison modifiée des différents conformères et les modifications post-traductionnelles, respectivement.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions remercier Masakuza Hara (Research Institute of Green Science et technologie, Université de Shizuoka, Japon) pour fournir les échantillons de protéine AtHIRD11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

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References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

Biochimie numéro 138 protéines intrinsèquement désordonnées électrophorèse capillaire affinité électrophorèse capillaire contraignant le dosage les ligands métalliques les alignements AtHIRD11
Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité
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Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

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