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Biochemistry

Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Questo protocollo combina la caratterizzazione di un campione della proteina mediante elettroforesi capillare e uno screening rapido legante per ligandi caricate mediante elettroforesi capillare di affinità. È consigliabile per le proteine con una struttura flessibile, quali proteine intrinsecamente disordinati, per determinare eventuali differenze nell'associazione per diversi conformeri.

Abstract

Piante dipendono fortemente dal loro ambiente. Al fine di adeguarsi ai cambiamenti stressanti (per esempio, siccità e salinità elevata), piante superiori si evolvono classi di proteine intrinsecamente disordinate (IDP) per ridurre lo stress ossidativo e osmotico. Questo articolo utilizza una combinazione di elettroforesi capillare (CGE) e l'elettroforesi di mobilità MAIUSC affinità (ACE) al fine di descrivere il comportamento di associazione di diversi conformeri dell'AtHIRD11 di IDP da Arabidopsis thaliana. CGE viene utilizzato per confermare la purezza del AtHIRD11 e per escludere frammenti, modifiche di posttranslational e altre impurità come motivi per modelli complessi di picco. In questa parte dell'esperimento, i componenti differenti del campione sono separati da un gel viscoso all'interno di un capillare dalle loro diverse masse e rilevati con un rivelatore a serie di diodi. In seguito, il comportamento di associazione del campione verso vari ioni metallici è studiato da ACE. In questo caso, il ligando viene aggiunto alla soluzione tampone e lo spostamento nel tempo di espansione viene misurato per determinare se si è verificato un evento di associazione o no. Uno dei vantaggi di usando la combinazione di CGE e ACE per determinare il comportamento di associazione di un IDP è la possibilità di automatizzare l'elettroforesi del gel e l'analisi di associazione. Inoltre, CGE Mostra un limite inferiore di rilevamento rispetto la classica elettroforesi e ACE è in grado di stabilire la modalità di associazione di un ligando in maniera veloce. Inoltre, ACE può applicarsi anche ad altre specie cariche di ioni metallici. Tuttavia, l'uso di questo metodo per l'associazione di esperimenti è limitato nella sua capacità di determinare il numero di siti di legame. Tuttavia, la combinazione di CGE e ACE può essere adattata per caratterizzare il comportamento di associazione di qualsiasi campione di proteina nei confronti dei numerosi ligandi caricate.

Introduction

Le piante sono più dipendenti dal loro ambiente rispetto a molte altre forme di vita. Dal momento che le piante non possono spostare in altri luoghi, hanno di adeguarsi ai cambiamenti nel loro ambiente (ad esempio, siccità, freddi e alte concentrazione di sale). Di conseguenza, piante superiori sviluppato proteine dello stress specializzati come dehydrins, che si attengono a molteplici attività per ridurre lo stress cellulare legato alla elevata salinità. Queste proteine legano acqua e ioni all'interno delle cellule, ridurre lo stress ossidativo legando Cu2 +-ioni e interagire con i fosfolipidi come pure il cytoskeletons. Inoltre, associazione Zn2 +-ioni permette queste proteine di agire come fattori di trascrizione. Loro capacità di legare il Ca2 +-ioni dopo fosforilazione è stato anche segnalato1.

Multifunzionale di queste proteine è correlato all'assenza di residui dell'amminoacido idrofobo. Di conseguenza, essi mancano eventuali interazioni idrofobiche all'interno della catena peptidica e anche una struttura vincolata. Tuttavia, perché queste proteine hanno una struttura restrittiva, che può essere occupata diversi conformeri alle stesse condizioni. Pertanto, essi possono essere descritti meglio come un insieme di strutture, piuttosto che come una conformazione unica. Proteine con queste proprietà sono conosciute come intrinsecamente disordinati proteine (IDP) e sono un concetto ampiamente utilizzato per proteine dello stress e diafonia tra vie differenti in cellule eucariotiche2.

Uno di questi sfollati interni legati allo stress è AtHIRD11. È uno degli sfollati interni altamente siccità-espresso più di Arabidopsis thaliana. Quindi, i diversi conformeri possono essere separati dal loro raggio effettivo rapporto di addebitare, ed elettroforesi capillare (CE) è stato utilizzato per ulteriori indagini. Precedente ACE gli esperimenti hanno dimostrato le interazioni tra AtHIRD11 e ioni di metalli di transizione quali Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +e Ni2 +-ioni. I risultati dettagliati possono essere trovati in Hara et al. 3 e Nachbar et al. 4.

Il metodo ACE che verrà utilizzato qui si basa su nostri precedenti lavori pubblicati6. Tuttavia, l'aggiunta dell'acetanilide indicatore EOF per il campione della proteina non è adatto. AtHIRD11 Mostra modelli di vasto picco, e aggiunta l'indicatore EOF all'esempio sarebbe travestimento due picchi. Pertanto, l'indicatore è utilizzato in un oggetto run separato. Prima viene esaminato il comportamento di associazione, è confermato che i picchi rilevati durante esperimenti precedenti sono da diversi conformeri. Così, CGE è utilizzato per distinguere tra i conformisti della proteina, modificato il post-traduzionali proteina e impurità, come frammenti di AtHIRD11, di loro masse diverse. Successivamente, è indagato il comportamento di associazione del campione AtHIRD11 caratterizzata verso vari ioni metallici diversi.

Lo scopo di questo articolo è di descrivere un setup sperimentale per distinguere tra un IDP e altri componenti di un campione al fine di valutare le differenze nel comportamento associazione dei diversi conformeri.

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Protocol

1. preparazione degli strumenti elettroforesi capillare

  1. Preparare i capillari
    1. Utilizzare una taglierina di vetro per tagliare una silice fusi con bare capillare con un rivestimento esterno di polyimide e un diametro interno di 50 µm in 33 cm (per l'esperimento CGE) e capillari lungo 30 cm (per l'esperimento ACE). Eseguire il taglio su una lastra di vetro.
      Nota: I 2 differenti setup sperimentale sono stati sviluppati per 2 diversi strumenti. Al fine di utilizzarli su altri strumenti, deve essere effettuato un trasferimento di metodo corretto e la lunghezza capillare deve essere impostata la lunghezza consentita dello strumento.
    2. Utilizzare una penna per segnare il centro di una finestra di rilevazione largo 1 cm ad una distanza di 24,5 cm da un'estremità del capillare per l'esperimento CGE e a 21,5 cm da un'estremità del capillare per l'esperimento ACE (lunghezza effettiva).
    3. Rimuovere il rivestimento esterno di polyimide dai vasi capillari di bruciare con una fiamma ossidrica, 0,5 cm prima e dopo il segno fuori. Analogamente, è possibile utilizzare la fiamma ossidrica per rimuovere 1 cm del rivestimento ad entrambe le estremità dei capillari.
      Nota: La lunghezza effettiva può variare leggermente dato che si basa sullo strumento elettroforesi capillare usato.
    4. Pulire le estremità dei capillari e le finestre di rilevamento con etanolo e un tessuto morbido.
      Nota: I capillari non rivestiti sono meno flessibili e probabilità di rompersi.
  2. Installare i capillari
    1. Installare un capillare nel sistema CE con la finestra di rilevamento vicino alla presa.
      Nota: I vari modelli di strumento CE hanno sistemi di portautensili diversi per i capillari. Consultare il manuale dello strumento usato per le istruzioni esatte.

2. preparare le soluzioni

  1. Preparare le soluzioni per l'analisi CGE
    1. Preparare il tris (idrossimetil) amminometano (Tris)-tampone di SDS (100 mM/1% p/v) a pH 8.0.
      1. Utilizzare una maschera respiratoria e una cabina per pesata 1,00 g di sodio dodecil solfato (SDS) in un becher da 100 mL.
      2. Aggiungere 1,21 g di Tris nel bicchiere graduato 100 mL e scioglierla utilizzando 50 mL di acqua deionizzata e un'ancoretta magnetica su un agitatore magnetico.
      3. Mettere un elettrodo di pH nella soluzione e regolare il pH a 8.0 utilizzando 1,0 M HCl.
      4. Riempire la soluzione in un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere acqua deionizzata fino al marchio. Agitare delicatamente per evitare qualsiasi formazione di schiuma.
    2. Preparare la soluzione di NaOH 0,1 M.
      1. Pesare 4,0 g di NaOH in un matraccio tarato da 100 mL. Riempirlo fino al segno con acqua deionizzata per fare uno stock di 1m.
      2. Utilizzare una pipetta 10ml per trasferire 10 mL di questa soluzione in un altro matraccio tarato da 100 mL e riempire fino al segno con acqua deionizzata.
    3. Preparare la soluzione di HCl 0,1 M.
      1. Mettere 10 mL di 10 M HCl in un matraccio tarato da 100 mL utilizzando una pipetta volumetrica 10ml e riempire fino al segno con acqua deionizzata. Ripetere questo passaggio per ottenere l'HCl 0,1 M.
    4. Preparare la soluzione di esempio.
      1. Peso 0,5 mg della proteina in una provetta 1 mL. Aggiungere 0,5 mL di tampone Tris-SDS gel dal passaggio 2.1.1 con una micropipetta.
      2. Sciogliere la proteina agitando delicatamente per evitare qualsiasi formazione di schiuma e la degradazione della proteina.
        Nota: Utilizzare ultrasuoni se la proteina non può essere sciolto come descritto; evitare qualsiasi riscaldamento della soluzione.
    5. Riempire le soluzioni in fiale.
      1. Filtrare ogni soluzione attraverso un 0,22 µm fluoruro di polivinilidene (PVDF) filtrare utilizzando un'adeguata siringa direttamente nel flaconcino.
        Nota: Per le soluzioni contenenti gel, la contropressione può essere elevata a causa della sua elevata viscosità.
      2. Preparare i flaconcini di 15 in totale e contrassegnare ciascuno per evitare eventuali confusioni.
        1. Riempire 3 flaconcini con un buffer di gel disponibili in commercio sodio dodecil solfato (SDS) a pH 8.
          Nota: L'uso di un buffer di gel SDS commercialmente disponibile fornisce risultati più precisi.
        2. Riempire 1 flaconcino con 0,1 M NaOH e 1 fiala con 0.1 M HCl per vampate di calore.
        3. Riempire 1 flaconcino con la soluzione di esempio.
        4. Riempire 5 flaconcini con acqua deionizzata e 4 flaconcini con 0,1 mL di acqua deionizzata (immersione fiale).
          Nota: Le fiale tuffantesi vengono utilizzate come fiale dei rifiuti durante il risciacquo del vaso capillare prima di ogni esecuzione. Le estremità capillare vengono immerse in acqua per lavare via i residui di gel.
  2. Preparare le soluzioni per l'analisi ACE
    1. Preparare la soluzione di NaOH 1 M.
      1. Pesare 4,0 g di NaOH in un matraccio tarato da 100 mL.
      2. Riempirlo fino al segno con acqua deionizzata per fare uno stock di 1m.
    2. Preparare l'acido etilendiamminotetracetico di 0.1 M (EDTA) in una soluzione di NaOH 0,1 M.
      1. Trasferire 10 mL di NaOH 0,1 di M in un matraccio tarato da 100 mL, utilizzando una pipetta da 10 mL. Riempirlo fino al segno con acqua deionizzata.
      2. Pesare 2,42 g di EDTA su una barca di pesatura e sciogliere il composto solido in 100 mL di 0.1 M NaOH.
    3. Preparare il tampone di Tris (30 mM).
      1. Aggiungere 3,63 g di Tris, 200 mL di acqua deionizzata e un ancoretta in un becher da mL 500. Porre il becher su un piatto di mescolare e accenderlo.
      2. Mettere un elettrodo di pH nel becher e regolare il pH a 7.4 utilizzo 0.1 M HCl.
      3. Riempire la soluzione in un matraccio tarato da 1 L e riempire fino al segno con acqua deionizzata.
        Nota: Questa procedura deve essere ripetuta o un matraccio tarato più grande è necessaria in quanto più di 1 L è necessaria per l'intera analisi.
    4. Preparare il flusso elettroosmotico acetanilide (EOF)-soluzione di indicatore (60 µM).
      1. Aggiungere 6 mg di acetanilide e 100 mL di tampone Tris in un matraccio tarato da 100 mL.
      2. Mettere il matraccio in un bagno ad ultrasuoni e accenderlo per 30 min.
    5. Preparare la soluzione del campione (1 mg/mL).
      1. Mettere un tubo del microcentrifuge 0,5 mL su una bilancia di precisione e aggiungere 0,3 mg di polvere liofilizzata AtHIRD11 nel tubo.
      2. Utilizzare una micropipetta per aggiungere 0,3 mL di un tampone Tris di 30 mM (pH 7,4) nel tubo. Agitare il tubo con attenzione per sciogliere la proteina.
    6. Preparare le soluzioni di ligando.
      1. Preparare la soluzione di riserva di CaCl2 (5 mM).
        1. Prendere una barca di pesatura, messo su una bilancia analitica e pesare 36,76 mg di CaCl2* H2O.
        2. Usando una micropipetta, sciacquare il CaCl2* H2O dalla pesatura in barca in un matraccio tarato da 50 mL con il tampone Tris precedentemente preparato.
        3. Riempire il matraccio tarato con il tampone Tris all'altezza del marchio.
      2. Preparare le soluzioni stock rimanente (5 mM).
        1. Ripetere il passaggio 2.2.6.1 utilizzando l'altro metallo sali invece di CaCl2* H2O [MgCl2: 23,80 mg, BaCl2: 26,02 mg, Sr (NO3)2: 52,91 mg, di MnCl2: 31,46 mg, SeCl4: 52,91 mg, CoCl 2* 2 H2o: 41,47 mg, Cuclo2* 2 H2o: 42,62 mg, ZnCl2: 3,41 mg e Burundi2* 6 H2o: 59,43 mg].
          Nota: La soluzione di2 ZnCl ha una concentrazione di 0,5 mM. Poiché sono state osservate forti interazioni tra gli ioni e la parete capillare interiore, la concentrazione è stata ridotta di un fattore 104.
      3. Preparare la soluzione di 500 µM CaCl2 .
        1. Riempire 10 mL della soluzione madre CaCl2 e metterla in un matraccio tarato da 100 mL.
        2. Riempire il matraccio tarato con un tampone Tris al contrassegno ed agitare la beuta.
      4. Preparare la soluzione di2 250 µM CaCl.
        1. Riempire 5 mL della soluzione madre CaCl2 e metterla in un matraccio tarato da 100 mL.
        2. Riempire il matraccio tarato con un tampone Tris al contrassegno ed agitare la beuta.
      5. Ripetere i passaggi 2.2.6.3 e 2.2.6.4 per le altre soluzioni stock.
    7. Riempire le soluzioni in fiale.
      Nota: Ogni esecuzione ripetuta ha bisogno di un set di fiale di entrata e di uscita. L'utilizzo di soluzioni di ligando freschi all'ingresso e all'uscita riduce gli spostamenti nel tempo di espansione dopo ogni esecuzione.
      1. Riempire la soluzione2 di CaCl 250 µM in una siringa da 10 mL.
      2. Mettere un 0,22 µm PVDF filtro siringa e spingere 2 mL della soluzione attraverso il filtro utilizzando la siringa al fine di scartare questa soluzione filtrata.
      3. Riempire 10 flaconcini fino a volume massimo consentito con i rimanenti 250 µM CaCl2 soluzione della siringa. Contrassegnare ciascuna come 250 µM CaCl 2 soluzione ingresso flaconcino.
      4. Riempire 10 flaconcini fino a quando sono riempito a metà con la soluzione di 250 µM CaCl2 . Contrassegnare ciascuna come 250 µM CaCl 2 soluzione presa flacone.
      5. Ripetere i passaggi 2.2.7.1 - 2.2.7.4 per le altre soluzioni metalliche contenenti sale.
      6. Ripetere i passaggi per ogni coppia di entrata e uscita fiale utilizzando invece il 30 mM Tris soluzione tampone (pH 7.4).
        Nota: Il 30 mmol/L tampone Tris pH 7.4 è utilizzato tra le esecuzioni al fine di ottenere dati in fase di migrazione per la proteina in assenza di ioni metallici. È necessario al fine di trascurare le modifiche in EOF.
      7. Ripetere i passaggi precedenti per fiala utilizzando invece l'acetanilide soluzione di indicatore di EOF (60 µM). Inoltre, ripetere la procedura utilizzando invece la soluzione del campione (1 mg/mL).

3. capillare Gel separazione elettroforetica

Nota: Preparare la separazione secondo il metodo descritto nel precedente lavoro da Nachbar et al. 4.

  1. Preparare l'analisi
    1. Condizione del capillare
      1. Impostare il termostato a 23 ° C.
      2. Sciacquare il capillare per 10 min a 2,5 bar con 0,1 M NaOH.
      3. Sciacquare il capillare per 5 min a 2.0 bar con 0.1 M HCl.
      4. Sciacquare il capillare per 2 min a 2.0 bar con acqua deionizzata.
    2. Riempire il buffer del gel di SDS
      1. Riempire un capillare per 10 min a 2.0 bar con il buffer del gel di SDS commercialmente disponibili pH 8.0.
    3. Sciacquare il capillare prima di ogni esecuzione di separazione
      1. Sciacquare il capillare per 3 min a 4.0 bar con 0,1 M NaOH.
      2. Sciacquare il capillare per 1 min a 4.0 bar con 0.1 M HCl.
      3. Sciacquare il capillare per 1 min a 4.0 bar con acqua deionizzata.
      4. Sciacquare il capillare per 10 min a 4.0 bar con il buffer del gel di SDS.
  2. Eseguire la separazione
    1. Iniettare la soluzione di esempio per gli esperimenti CGE (passo 2.1.4) idrodinamicamente applicando 0,1 bar per 4 min all'ingresso.
    2. Applicare -16,5 kV e una pressione di 2,0 bar ad entrambe le estremità del capillare per 25 min.

4. affinità analisi elettroforetica capillare

Nota: Preparare la separazione secondo il metodo descritto in precedenti lavori da Nachbar et al. 4 e Cipriano et al. 5.

  1. Condizione del capillare
    1. Impostare il termostato a 23 ° C.
      Nota: La temperatura viene utilizzata secondo i protocolli pubblicati e può essere modificata in altre temperature4,5. Tuttavia, le interazioni sono funzione della temperatura e cambieranno di conseguenza.
    2. Svuotare un capillare per 40 min a 2,5 bar con 0,1 M NaOH.
    3. Sciacquare il capillare per 10 min a 1.0 bar con acqua deionizzata.
    4. Sciacquare il capillare per 30 min a 1,0 bar con un tampone di Tris di 30 mM (pH 7,4).
  2. Preparazione per i metodi ACE
    1. Preparare il metodo per le misurazioni senza leganti.
      Nota: Acetanilide non è stato aggiunto alla soluzione del campione, mentre traveste 2 picchi proteici.
      1. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con una soluzione di EDTA 0,1 M.
      2. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con acqua deionizzata.
      3. Sciacquare il capillare per min 1,5 a 2,5 bar con un tampone Tris di equilibramento.
      4. Iniettare la soluzione di acetanilide per 6 s a 0,05 bar e cambiare l'ingresso e uscita fiale per le fiale di tampone Tris.
      5. Applicare 0,05 bar per 2.4 s al fine di spingere la soluzione di acetanilide dalla punta dell'interno ulteriore capillare.
      6. Applicare 10.0 kV per 6 min e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nm.
      7. Ripetere i passaggi 4.2.1.1. -4.2.1.6. utilizzando la proteina campione invece la soluzione di acetanilide e rilevare tutte le cime della proteina.
    2. Preparare il metodo per le misurazioni con ligandi.
      1. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con una soluzione di EDTA 0,1 M.
      2. Sciacquare il capillare per 1 min a 2,5 bar con acqua deionizzata.
      3. Sciacquare il capillare per min 1,5 a 2,5 bar con la soluzione di ligando di equilibramento.
      4. Iniettare la soluzione di acetanilide per 6 s a 0,05 bar e cambiare l'ingresso e uscita fiale per le fiale di tampone contenente ligando.
      5. Applicare 0,05 bar per 2.4 s al fine di spingere la soluzione di acetanilide dalla punta dell'interno ulteriore capillare.
      6. Applicare 10.0 kV per 6 min e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nm.
      7. Ripetere i passaggi 4.2.2.1 - 4.2.2.6 utilizzando il campione della proteina invece la soluzione di acetanilide e rilevare tutte le cime della proteina.
    3. Ripetere i passaggi da 4.2.1 e 4.2.2 alternativamente al fine di calcolare il cambiamento nei rapporti costo-dimensioni per le varie interazioni proteina-metallo ioni (descritte nella sezione Risultati rappresentante).
      1. Modificare la soluzione della proteina dopo ogni 60 h in una fresca.
        Nota: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa. Questa procedura è ripetuta almeno 10 x per ciascuna concentrazione dei ligandi poiché il modello di picco varia leggermente da una esecuzione al. Se la soluzione viene utilizzata più di 60 h, le variazioni diventano troppo grandi.
    4. Eseguire i metodi
      1. Eseguire il metodo descritto al punto 4.2.2, usando le soluzioni di ligando alcalino-terrosi (CaCl2, MgCl2, BaCl2e SrCl2 soluzioni).
      2. Continuare a utilizzare il metodo descritto al punto 4.2.2, usando il MnCl2, SeCl4, CoCl2, Cuclo2, ZnCl2e Burundi2 soluzioni anziché le soluzioni di ligando alcalino-terrosi.
        Nota: I cloruri di metalli di transizione quest'ultimo ha mostrato più forti interazioni con il capillare e non possono essere rimosso completamente. Questi risultato di interazioni in turni nel tempo di migrazione da una esecuzione al. Di conseguenza, essi sono stati studiati dopo altri ioni del metallo.

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Representative Results

La figura 1 Mostra l'elettroferogramma per il campione di AtHIRD11 ottenuto durante gli esperimenti CGE. La dimensione del peptide aumenta da sinistra a destra. Numero massimo 4 ha la più grande massa e indica la proteina intatta. I picchi più piccoli 2 e 3 rappresentano le più piccole impurità (ad es., prodotti di degradazione). Il primo picco e l'inconsistenza della linea di base prima potrebbe essere riprodotto anche senza il campione della proteina. Pertanto, è legato alla SDS gel stesso e non rappresenta qualsiasi impurità associata a campione.

Figura 2 rappresenta l'elettroferogramma per acetanilide durante gli esperimenti ACE. La soluzione di acetanilide Mostra solo 1 alto picco poiché non dovrebbe avere nessuna impurità. Il tempo di rilevamento per il massimo del picco indica il tempo di migrazione del flusso elettroosmotico (t.EOF) e viene utilizzato per il calcolo dell'interazione.

Nella figura 3 è l'elettroferogramma del campione AtHIRD11 durante l'esperimento ACE in assenza di SDS e ioni metallici. Si vede, oltre le 2 impurità dall'elettroferogramma CGE, almeno 5 picchi che sono legati alla proteina stessa. Picco 1 e 2 possa essere assegnato alle impurità poiché i tempi di migrazione indicano che essi sono piccoli o molto positivamente. Questa ipotesi è supportata dall'aumento dell'altezza del picco e la zona nel corso del tempo. Dato che picchi di AtHIRD11 3 e 4 sono vicini il EOF, essi difficilmente pagano e non possono essere separati in ogni corsa. Quasi non mostrano alcuna interazione e rappresentano conformazioni senza accessibile residui essenziali per le interazioni con ioni metallici. AtHIRD11 Mostra diversi diversi-a-dimensioni-rapporto carica a causa di diversi raggi efficace di diversi conformeri. Questi conformeri possono unire continuamente. Successivamente, picchi di 5-7 sono più vasti dei picchi proteici usuale. Le cime ampie dare un suggerimento sulla cinetica delle interazioni. Poiché i picchi non sono stretti, un veloce e una conversione molto lenta tra i diversi conformeri può essere esclusa. In entrambi i casi, le cime sarebbe separato da linea di base4. In questo caso, una fase di pre-equilibrazione può cambiare il modello di picco e darebbe una migliore comprensione delle interazioni con la cinetica più lenta.

La figura 4 Mostra che la valutazione grafica del tempo misurato migrazione sposta in presenza di vari ioni metallici per picco 6. Esso è rappresentato dal valore calcolato ΔR/Rf. Questo valore indica quanto forte è uno spostamento (dal suo valore) e la variazione complessiva della carica complessi proteina-metallo ioni (dal suo segno). Al fine di distinguere tra un'interazione significativa e un turno coincidente, gli intervalli di confidenza per α = 0.05 sono calcolati come bene. In casi dove l'intervallo di confidenza non è intersezione con la linea dello zero, l'interazione è considerata significativa. Risultati sono presi in considerazione se il picco era presente in almeno 6 su 10 elettroferogrammi. Picco 6 non era presente in qualsiasi tiratura con 500 µM Co2 +. La lista completa delle interazioni per ogni picco di AtHIRD11 è pubblicata in un precedente lavoro di Nachbar et al. 4.

ΔR/Rf viene calcolata utilizzando i rapporti di tempo di migrazione Rho (in presenza di ligando) e i rapporti di tempo di migrazione Rf (in assenza del ligando):

Equation 1

Ri e Rf sono calcolati usando il picco tempi top tdella proteina per i picchi di campione di proteina e il corrispondente tempo di picco superiore per l'indicatore di EOF tEOF:

Equation 2

Per Rio, i tempi in presenza del ligando sono usati e per Rf, i tempi in assenza.

Figure 1
Figura 1 : Elettroferogramma per la separazione di CGE del campione nel gel buffer AtHIRD11. Picco 1 e i picchi sulla sua sinistra possono essere osservati anche senza un'iniezione di campione, quindi sono manufatti. Poiché le masse e nel complesso le aree dei picchi del picco 2 e 3 sono più piccole di quella del picco 4, sono probabili impurità, come prodotti di degradazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Elettroferogramma dell'acetanilide indicatore di EOF eseguire. La figura mostra solo 1 picco per il composto senza ioni metallici e buffer del gel di SDS. Il tempo di picco top segna il flusso elettroosmotico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Esempio di elettroferogramma della separazione del campione durante gli esperimenti ACE che mostra un modello complesso picco in assenza di qualsiasi metallo ioni. Almeno 7 vette potrebbero essere identificati e legate alla proteina e sue 2 impurità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Valutazione grafica del comportamento associazione verso gli ioni metallici studiati usando una concentrazione di 500 µM per picco 6. I valori di ΔR/Rf dare un suggerimento sull'intensità dello spostamento di tempo di migrazione e quindi sulla forza i cambiamenti conformazionali sull'associazione di ioni metallici. Il segno di ΔR/Rf indica se il complesso è più positivamente o negativamente carica rispetto alla proteina non associata. Le barre di errore indicano gli intervalli di confidenza per α = 0.05. Successivamente, essi mostrano l'area dove il vero ΔR/Rf-valore può essere trovato con una certezza del 95%. Le barre rosse indicano i risultati calcolati ottenuti da dati insufficienti (il picco era presente in meno di 6 elettroferogrammi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per tutti gli esperimenti di CE, la preparazione del capillare è un passo fondamentale. Trattandosi di un tubo di vetro con un diametro piccolo, si può rompere facilmente presso i punti dove il rivestimento viene rimosso quando esso viene gestita. L'installazione del vaso capillare nello strumento dovrebbe essere fatto con molta attenzione.

I passaggi critici necessari utilizzando il metodo ACE principalmente riguardano la messa a punto sperimentale. Un altro passo fondamentale è trovare i parametri di iniezione del campione di destra. La quantità iniettata del campione deve essere sufficiente per alte vette. Tuttavia, l'overload comporterebbe un modello mal risolto picco con picchi di sovrapposizione. Quando si riduce il volume iniettato, è consigliabile diminuire la pressione di iniezione invece il tempo di iniezione, poiché ci vuole del tempo per lo strumento raggiungere la pressione di iniezione programmata.

Cime insolitamente ampi possono essere trovati per campioni differenti della proteina. Questo modello può essere influenzato aumentando la tensione. Di conseguenza, le cime ottenere più ristretta e si riduce il tempo di separazione. Tuttavia, il più breve tempo di separazione può provocare picchi non risolti e la tensione più alta aumenta il riscaldamento di Joule e limita l'effetto di picchi di dispersione elettroforetica7,8. Pertanto, le giuste condizioni devono essere determinata per ogni nuova proteina esaminato.

Combinando CGE e ACE per raccogliere informazioni circa il carattere intrinsecamente disordinato di una proteina e il relativo comportamento di associazione è un nuovo approccio. La caratterizzazione del campione di elettroforesi del gel è un passo necessario per dimostrare che eventuali picchi multipli osservati non sono correlate alle impurità. Il vantaggio di CGE è la possibilità di automatizzare, il tempo di preparazione più breve e una risoluzione più alta rispetto al classico gel elettroforesi9. Utilizzando ACE per IDP associazione esperimenti spettacoli sua superiorità verso altri dosaggi (ad es., immobilizzato cromatografia di affinità del metallo nei risultati) dal ACE non solo Mostra gli eventi di associazione. Inoltre, esso separa diversi conformeri di una proteina e può rivelare differenze di ligandi di associazione di diversi conformeri. Questo comportamento non può essere rilevato dai metodi senza una separazione durante l'esperimento di associazione. Inoltre, il tempo di analisi è di solo 6 min; di conseguenza, i risultati possono essere calcolati in un breve lasso di tempo10. D'altra parte, l'analisi veloce viene fornito con limitazioni nello stimare il numero di binding siti11.

Il futuro di questo approccio consiste nella possibilità di potenziali partner di legame dello schermo per le proteine, soprattutto gli sfollati interni, in modo veloce. Dà una rapida panoramica del comportamento associazione diversa dei diversi conformeri presenti in un campione. L'uso di un dipendente dalla dimensione di separazione (ad es., CGE) per la caratterizzazione del campione è obbligatorio poiché ACE stesso non può distinguere tra le impurità e la proteina stessa. Tuttavia, CGE dà un'idea circa il numero di specie di dimensioni diverse. L'applicazione di ACE come un'analisi obbligatoria è stata estesa già da ligandi di ioni metallici a qualsiasi carica ligando12. Di conseguenza, è possibile aggiungere ulteriori informazioni circa le interazioni a qualsiasi caratterizzato vincolanti, dal momento che la combinazione della separazione e l'analisi obbligatoria in un unico metodo può dare prova di qualsiasi comportamento di associazione alterata dei diversi conformeri e modifiche di posttranslational, rispettivamente.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo grato Masakuza Hara (Research Institute of Green Science e Technology, Università di Shizuoka, Giappone) per la fornitura di campioni proteici AtHIRD11.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

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References

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  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
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  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
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Tags

Biochimica problema 138 proteine intrinsecamente disordinati elettroforesi capillare di affinità elettroforesi capillare associazione dosaggio ligandi del metallo dehydrins AtHIRD11
Analisi di AtHIRD11 intrinseco disordine e l'associazione verso gli ioni del metallo di elettroforesi capillare ed elettroforesi capillare di affinità
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Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

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