Analys av AtHIRD11 inneboende sjukdom och bindande mot metalljoner genom kapillär gelelektrofores och affinitet kapillärelektrofores

Summary

Detta protokoll kombinerar karakterisering av ett protein prov genom kapillär gelelektrofores och en snabb-bindande screening för laddade ligander av affinitet kapillärelektrofores. Det rekommenderas för proteiner med en flexibel struktur, såsom oupplösligt oordnade proteiner, att fastställa eventuella skillnader i bindande för olika konformationer.

Abstract

Växter är starkt beroende av sin omgivning. För att anpassa sig till påfrestande förändringar (t.ex., torka och hög salthalt), utvecklas högre växter klasser av egensäkra oordnade proteiner (internflyktingar) att minska oxidativ och osmotisk stress. Denna artikel använder en kombination av kapillär gelelektrofores (CGE) och rörlighet Skift affinitet elektrofores (ACE) för att beskriva beteendet bindande med olika konformationer av de IDP AtHIRD11 från Arabidopsis thaliana. CGE används för att bekräfta AtHIRD11 renhet och att utesluta fragment, posttranslationell ändringar och andra orenheter som skäl för komplexa peak mönster. I denna del av experimentet, olika prov komponenterna separeras av en trögflytande gel inuti en kapillär genom deras olika massa och identifieras med en diod array detektor. Efteråt, utreds bindande beteendet av provet mot olika metalljoner av ACE. I det här fallet liganden läggs till buffertlösningen och förskjutningen i flyttningstid mäts för att fastställa huruvida en bindande händelse har inträffat eller inte. En av fördelarna med att använda kombinationen av CGE och ACE för att fastställa bindande beteendet för en IDP är möjligheten att automatisera gelelektrofores och bindande analysen. Dessutom CGE visar en lägre detektionsgräns än den klassiska gelelektrofores och ACE är kunna avgöra sättet bindande en ligand på ett snabbt sätt. Dessutom kan ACE också tillämpas på andra laddade arter än metalljoner. Användningen av denna metod för bindande experiment begränsas emellertid i dess förmåga att bestämma antalet bindningsställen. Kombinationen av CGE och ACE kan dock anpassas för kännetecknar bindande beteendet hos varje protein prov mot många laddade ligander.

Introduction

Växter är mer beroende av omgivningen än många andra livsformer. Eftersom växterna inte kan flytta till andra platser, har de att anpassa sig till förändringar i omgivningen (t.ex., torka, kyla och hög salt koncentrationer). Följaktligen utvecklat högre växter specialiserade stress proteiner som dehydrins, som fullgör mångfaldiga uppgifter för att minska cell stress relaterade till hög salthalt. Dessa proteiner binder vatten och joner inuti cellerna, minska oxidativ stress genom bindande Cu^{2 +}-joner, och interagera med fosfolipider samt cytoskeletons. Dessutom bindande Zn^{2 +}-joner tillåter dessa proteiner att agera som transkriptionsfaktorer. Deras förmåga att binda Ca^{2 +}-joner efter fosforylering har också rapporterat¹.

Multifunktionell uppförandet av dessa proteiner är relaterad till avsaknad av hydrofoba aminosyror rester. Följaktligen saknar de hydrofoba interaktioner inuti peptid kedjan och även en begränsad struktur. Men eftersom dessa proteiner saknar en restriktiv struktur, kan de upptar olika konformationer på samma villkor. Därför, de kan beskrivas bäst som en ensemble av strukturer snarare än en enda konformation. Proteiner med dessa egenskaper är kända som egensäkra andningsstörningar proteiner (internflyktingar) och är en allmänt använd koncept för stress proteiner och överhörning mellan olika vägar i eukaryota celler².

En av dessa stressrelaterade internflyktingar är AtHIRD11. Det är en av Arabidopsis thaliana'smest mycket torka-uttryckta internflyktingar. Därför de olika konformationer kan separeras genom deras effektiva radien att debitera baserat, och kapillärelektrofores (CE) har använts för vidare utredning. Tidigare ACE experiment visat samspelet mellan AtHIRD11 och övergång metall joner såsom Cu^{2 +}-, Zn^{2 +}-, Co^{2 +}och Ni^{2 +}-joner. Resultaten kan hittas i Hara o.a. ³ och Nachbar o.a. ⁴.

Metoden ess som kommer att användas här bygger på vår tidigare publicerade verk⁶. Tillägg av den EOF markör acetanilid till protein provet är dock inte lämplig. AtHIRD11 visar bred topp mönster, och att lägga till EOF markören till provet skulle dölja två toppar. Därför används markören i en separat körning. Innan bindande beteende undersöks, bekräftas det att topparna hittade under tidigare experiment är från olika konformationer. Således CGE används för att skilja mellan de protein konformationer, den posttranslationella modifierat protein och orenheter, som fragment av AtHIRD11, av deras olika massa. Därefter utreds kännetecknas AtHIRD11 provets bindande beteende mot olika olika metalljoner.

Syftet med denna artikel är att beskriva ett experiment att skilja mellan en IDP och andra komponenter i ett prov för att utvärdera skillnader i bindande beteendet hos olika konformationer.

Protocol

1. beredning av kapillärelektrofores instrument

1. Förbereda kapillärerna
   1. Använd en glas fräs för att skära en bare-smält kiseldioxid kapillär med en polyimid yttre beläggning och en inre diameter av 50 µm i 33 cm (för CGE experimentet) och 30 cm (för ACE experimentet) lång kapillärer. Utför styckning på en glasskiva.
      Obs: De 2 olika försöksuppställningar utvecklades för 2 olika instrument. För att använda dem på andra instrument, har en lämplig metod överföring ska utföras och kapillär längden måste anpassas till den tillåtna längden på instrumentet.
   2. Använda en penna för att markera mitten av ett 1 cm brett upptäckt fönster på ett avstånd av 24,5 cm från ena änden av kapillären för CGE experimentet och 21,5 cm från ena änden av kapillären för ACE experimentet (effektiv längd).
   3. Ta bort polyimid yttre beläggning från kapillärerna genom att bränna det bort med en blåslampa, 0,5 cm före och efter märket. Likaså Använd blåslampa ta bort 1 cm av beläggningen i båda ändar av kapillärerna.
      Obs: Den faktiska längden kan variera något eftersom det bygger på kapillärelektrofores instrumentet används.
   4. Ren i ändarna av kapillärerna och upptäckt Fönstren med etanol och en mjuk vävnad.
      Obs: Obestruket kapillärerna är mindre flexibla och benägna att bryta.
2. Installera kapillärerna
   1. Installera en kapillär in i CE-systemet med fönstret upptäckt nära uttaget.
      Obs: De olika CE instrument modellerna har olika innehav system för kapillärerna. Se handboken används instrumentet för exakta instruktioner.

2. Förbered lösningarna

1. Förbereda lösningarna för CGE analys
   1. Förbereda den tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris)-SDS buffert (100 mM/1% w/v) vid pH 8,0.
      1. Använd en andningsmask och en monter för vägning 1.00 g av sodium dodecyl sulfate (SDS) i en 100 mL-bägare.
      2. Tillsätt 1,21 g av Tris i 100 mL bägaren och Lös det med 50 mL avjoniserat vatten och magnetiska rör bar på en magnetomrörare.
      3. Sätta en pH-elektrod i lösningen och justera pH till 8.0 använder 1,0 M HCl.
      4. Fyll lösningen till en 100 mL mätkolv och Tillsätt avjoniserat vatten upp till märket. Skaka den försiktigt för att undvika någon skum bildas.
   2. Förbereda den 0,1 M NaOH-lösningen.
      1. Väg 4,0 g NaOH i en 100 mL mätkolv. Fylla den upp till märket med avjoniserat vatten för att göra en 1 M lager.
      2. Använd en pipett 10 mL glödlampa att överföra 10 mL av denna lösning i en 100 mL mätkolv och fyll upp till märket med avjoniserat vatten.
   3. Förbereda den 0,1 M HCl-lösningen.
      1. Sätt 10 mL 10 M HCl i en mätkolv på 100 mL med pipett 10 mL mätkolv och fyll upp till märket med avjoniserat vatten. Upprepa detta steg för att få den 0,1 M HCl.
   4. Förbereda provlösningen.
      1. Väg upp 0,5 mg av protein i en 1 mL tub. Tillsätt 0,5 mL av Tris-SDS gel bufferten från steg 2.1.1 med en mikropipett.
      2. Lös proteinet genom att skaka försiktigt för att undvika någon skum bildas och nedbrytning av protein.
         Obs: Använd ultraljud om proteinet inte kan upplösas enligt beskrivningen; undvika någon uppvärmning av lösningen.
   5. Fyll lösningarna i skålarna.
      1. Filtrera varje lösningen genom ett 0,22 µm vinylidenfluoridplast (PVDF) filtrera med en lämplig spruta direkt in i injektionsflaskan.
         Obs: För gel-innehållande lösningar, mottryck kan vara hög på grund av dess höga viskositet.
      2. Förbereda 15 injektionsflaskor totalt och markera alla för att undvika eventuella misstag.
         1. Fyll 3 injektionsflaskor med en kommersiellt tillgänglig sodium dodecyl sulfate (SDS) gel buffert vid pH 8.
            Observera: Användning av en kommersiellt tillgänglig SDS gel buffert ger mer exakta resultat.
         2. Fyll 1 injektionsflaska med 0,1 M NaOH och 1 injektionsflaska med 0.1 M HCl för spolning.
         3. Fyll 1 injektionsflaska med provlösningen.
         4. Fyll 5 injektionsflaskor med avjoniserat vatten och 4 injektionsflaskor med 0,1 mL avjoniserat vatten (doppning injektionsflaskor).
            Obs: Doppa skålarna används som avfall injektionsflaskor under genomspolning av kapillären före varje körning. Kapillär ändarna doppas i vatten för att skölja bort rester gel.
2. Förbereda lösningarna för ess analys
   1. Förbereda den 1 M NaOH-lösningen.
      1. Väg 4,0 g NaOH i en 100 mL mätkolv.
      2. Fylla den upp till märket med avjoniserat vatten för att göra en 1 M lager.
   2. Förbereda 0,1 M ethylendiaminetetraacetic syra (EDTA) i en 0,1 M NaOH-lösning.
      1. Över 10 mL 0,1 M NaOH i en mätkolv på 100 mL med pipett 10 mL glödlampa. Fylla den upp till märket med avjoniserat vatten.
      2. Väga 2.42 g EDTA på en vägning båt och upplösa den solid föreningen i 100 mL 0,1 M NaOH.
   3. Bered den Tris buffert (30 mM).
      1. Tillsätt 3,63 g Tris, 200 mL avjoniserat vatten och rör om bar i en 500 mL-glasbägare. Placera bägaren på en uppståndelse tallrik och slå på den.
      2. Sätta en pH mätare elektrod i bägaren och justera pH till 7,4 använder 0.1 M HCl.
      3. Fyll lösningen i en 1 L mätkolv och fyll upp till märket med avjoniserat vatten.
         Obs: Denna procedur måste upprepas eller en större mätkolv behövs eftersom mer än 1 L behövs för hela analysen.
   4. Förbereda acetanilid elektroosmotiska flödet (EOF)-markör (60 µM) lösning.
      1. Lägga till 6 mg acetanilid och Tris buffert 100 mL i en 100 mL mätkolv.
      2. Placera mätkolven i ultraljudsbad och slå på den i 30 min.
   5. Förbereda provlösningen (1 mg/mL).
      1. Lägg ett 0,5 mL mikrocentrifug rör på en precision balans och tillsätt 0,3 mg frystorkade AtHIRD11 pulver i röret.
      2. Använd en mikropipett för att lägga till 0,3 mL av en 30 mM Tris buffert (pH 7,4) i röret. Skaka tuben noggrant för att lösa upp proteinet.
   6. Förbereda de ligand lösningarna.
      1. Förbereda stamlösning CaCl₂ (5 mM).
         1. Ta en vägning båt, satte den på en Analysvåg och väga 36.76 mg CaCl₂* H₂O.
         2. Med hjälp av en mikropipett, spola den CaCl₂* H₂O från vägningen båt i en 50 mL mätkolv med det tidigare beredda Tris buffert.
         3. Fyll mätkolven med Tris buffert upp till märket.
      2. Förbereda de återstående lagerföra lösningarna (5 mM).
         1. Upprepa steg 2.2.6.1 använder andra metall salter istället för CaCl₂* H₂O [MgCl₂: 23,80 mg, BaCl₂: 26.02 mg, Sr (nr₃)₂: 52.91 mg, MnCl₂: 31.46 mg, SeCl₄: 52.91 mg, CoCl ₂* 2 H₂O: 41.47 mg, CuCl₂* 2 H₂O: 42.62 mg, ZnCl₂: 3.41 mg och NiCl₂* 6 H₂O: 59.43 mg].
            Obs: ZnCl₂ lösningen har en koncentration av 0,5 mM. Eftersom interaktioner mellan jonerna och kapillär innervägg observerades, koncentrationen minskades med en faktor på 10⁴.
      3. Bered den 500 µM CaCl₂ .
         1. Fyll 10 mL stamlösning CaCl₂ och lägga den i en 100 mL mätkolv.
         2. Fyll mätkolven med Tris buffert till märket och skaka kolven.
      4. Bereda 250 µM CaCl₂ lösning.
         1. Fyll 5 mL stamlösning CaCl₂ och lägga den i en 100 mL mätkolv.
         2. Fyll mätkolven med Tris buffert till märket och skaka kolven.
      5. Upprepa steg 2.2.6.3 och 2.2.6.4 för andra lager lösningar.
   7. Fyll lösningarna i skålarna.
      Obs: Varje upprepad kör behöver en uppsättning inlopp och utlopp injektionsflaskor. Användning av färska ligand lösningar på in- och utlopp minskar förskjutningarna i flyttningstid efter varje körning.
      1. Fyll 250 µM CaCl₂ lösningen i en 10 mL spruta.
      2. Sätta ett 0,22 µm PVDF filter på sprutan och push 2 mL av lösningen genom filtret med sprutan för att kassera denna filtrerade lösningen.
      3. Fyll 10 flaskor upp till den högsta tillåtna volymen med återstående 250 µM CaCl₂ lösningen i sprutan. Markera varje som 250 µM CaCl ₂ lösning inlopp injektionsflaska.
      4. Fyll 10 flaskor tills de är halv-fyllda med 250 µM CaCl₂ lösningen. Markera varje som 250 µM CaCl ₂ lösning outlet injektionsflaska.
      5. Upprepa steg 2.2.7.1 - 2.2.7.4 för andra metall som innehåller salt lösningar.
      6. Upprepa stegen för varje par av inlopp och utlopp injektionsflaskor med 30 mM Tris buffert (pH 7,4) lösning i stället.
         Obs: 30 mmol/L Tris buffert pH 7,4 används mellan körningarna för att få tid migreringsdata för protein i avsaknad av metalljoner. Det är nödvändigt för att försumma förändringar i EOF.
      7. Upprepa stegen ovan för en injektionsflaska med acetanilid EOF-markör (60 µM) lösning i stället. Också, upprepa stegen med provlösningen (1 mg/mL) i stället.

3. kapillär Gel elektroforetisk Separation

Obs: Förbereda separationen enligt den metod som beskrivs i tidigare arbete av Nachbar o.a. ⁴.

1. Förbereda analys
   1. Villkor kapillären
      1. Ställ in termostaten till 23 ° C.
      2. Spola kapillären för 10 min vid 2,5 bar med 0,1 M NaOH.
      3. Spola kapillären för 5 min vid 2,0 bar med 0.1 M HCl.
      4. Spola kapillären i 2 min på 2,0 bar med avjoniserat vatten.
   2. Fyll i SDS gel bufferten
      1. Fyll en kapillär för 10 min vid 2,0 bar med kommersiellt tillgängliga SDS gel bufferten vid pH 8,0.
   3. Spola kapillären innan varje separation körning
      1. Spola kapillären för 3 min vid 4,0 bar med 0,1 M NaOH.
      2. Spola kapillären för 1 min på 4,0 bar med 0.1 M HCl.
      3. Spola kapillären för 1 min på 4,0 bar med avjoniserat vatten.
      4. Spola kapillären för 10 min vid 4,0 bar med SDS gel bufferten.
2. Kör separation
   1. Injicera provlösningen för CGE experiment (steg 2.1.4) hydrodynamiskt genom att tillämpa 0,1 bar för 4 min vid inloppet.
   2. Applicera -16,5 kV och ett tryck på 2,0 bar i båda ändar av kapillären i 25 min.

4. affinitet kapillär elektrofores analys

Obs: Förbereda separationen enligt den metod som beskrivs i tidigare verk av Nachbar o.a. ⁴ och Alhazmi o.a. ⁵.

1. Villkor kapillären
   1. Ställ in termostaten till 23 ° C.
      Obs: Temperaturen används enligt publicerade protokoll och kan ändras till andra temperaturer^4,5. Men interaktionen är beroende av temperaturen och ändras.
   2. Spola en kapillär för 40 min vid 2,5 bar med 0,1 M NaOH.
   3. Spola kapillären för 10 min vid 1,0 bar med avjoniserat vatten.
   4. Spola kapillären för 30 min vid 1,0 bar med en 30 mM Tris buffert (pH 7,4).
2. Förberedelse för metoderna som ACE
   1. Förbereda metoden för mätningarna utan ligander.
      Obs: Acetanilid lades inte till provlösningen, som det förställer 2 protein toppar.
      1. Skölj kapillären för 1 min på 2,5 bar med en 0,1 M EDTA-lösning.
      2. Skölj kapillären för 1 min på 2,5 bar med avjoniserat vatten.
      3. Skölj kapillären för 1,5 min 2,5 bar med Tris buffert för Jämviktstiden.
      4. Injicera acetanilid lösningen för 6 s på 0,05 bar och ändra inlopp och utlopp injektionsflaskor till Tris buffert rören.
      5. Tillämpa 0,05 bar för 2,4 s för att driva acetanilid lösningen från spetsen av kapillär ytterligare insidan.
      6. Tillämpa 10,0 kV för 6 minuters och upptäcka acetanilid toppen vid en våglängd på 200 nm.
      7. Upprepa steg 4.2.1.1. -4.2.1.6. med hjälp av proteinet prova istället för acetanilid lösningen och upptäcka alla protein topparna.
   2. Förbereda metoden för mätningar med ligander.
      1. Skölj kapillären för 1 min på 2,5 bar med en 0,1 M EDTA-lösning.
      2. Skölj kapillären för 1 min på 2,5 bar med avjoniserat vatten.
      3. Skölj kapillären för 1,5 min 2,5 bar med ligand lösningen för Jämviktstiden.
      4. Injicera acetanilid lösningen för 6 s på 0,05 bar och ändra inlopp och utlopp injektionsflaskor till ligand-innehållande buffert rören.
      5. Tillämpa 0,05 bar för 2,4 s för att driva acetanilid lösningen från spetsen av kapillär ytterligare insidan.
      6. Tillämpa 10,0 kV för 6 minuters och upptäcka acetanilid toppen vid en våglängd på 200 nm.
      7. Upprepa steg 4.2.2.1 - 4.2.2.6 med protein provet istället för acetanilid lösningen och upptäcka alla protein topparna.
   3. Växelvis Upprepa steg 4.2.1 och 4.2.2 för att beräkna förändringen i kostnad-storlek kvoterna för de olika protein-metall Jon interaktioner (beskrivs under Representativa resultat).
      1. Ändra den protein-lösningen efter varje 60 h till en ny en.
         Obs: vid denna punkt, experimentet kan pausas. Detta förfarande är minst upprepad 10 x för varje koncentration av liganderna eftersom peak mönstret varierar något från kör och kör. Om lösningen används längre än 60 h, blir variationerna alltför stora.
   4. Kör metoderna
      1. Kör metoden beskrivs under steg 4.2.2, använda alkaliska jord ligand solutions (CaCl₂, MgCl₂, BaCl₂och SrCl₂ lösningar).
      2. Fortsätta att använda den metod som beskrivs under steg 4.2.2, med de MnCl₂, SeCl₄, CoCl₂, CuCl₂, ZnCl₂och NiCl₂ lösningar i stället för de alkaliska jord ligand lösningarna.
         Obs: De sistnämnda övergång metall Kloriderna visade starkare interaktioner med kapillären och kan inte tas bort helt. Dessa interaktioner resultatet i skiftar i flyttningstid från kör och kör. Följaktligen undersöktes de efter andra metalljoner.

Representative Results

Figur 1 visar elektroferogram för AtHIRD11 provet erhålls under CGE experimenten. Peptid storlek ökar från vänster till höger. Höjdpunkt nummer 4 har den största massan och indikerar intakt protein. De mindre topparna 2 och 3 utgör mindre orenheter (t.ex., nedbrytningsprodukter). Den första toppen och inkonsekvensen i originalplanen innan kunde också reproduceras utan protein provet. Därför, det är relaterat till SDS gel sig och representerar inte någon prov-associerade orenheter.

Figur 2 föreställer elektroferogram för acetanilid under ACE experimenten. Acetanilid lösningen visar endast 1 hög topp eftersom det bör ha inga föroreningar. Tiden upptäckt för maximalt toppvärde anger migration av elektroosmotiska flödet (t_EOF) och används för beräkning av interaktionen.

Figur 3 är elektroferogram av AtHIRD11 provet under ACE experimentet i avsaknad av SDS och metalljoner. Det visar, förutom den CGE elektroferogram, 2 orenheter minst 5 toppar som är relaterade till proteinet självt. TOPP 1 och 2 kan tilldelas till föroreningar eftersom deras migreringstiden indikerar att de är små eller mycket positivt laddade. Detta antagande stöds av ökningen av topphöjden och området över tid. Eftersom AtHIRD11 toppar 3 och 4 är nära EOF, de debiteras knappast och inte kan separeras i varje körning. De nästan visar inga interaktioner och representera konformationer utan tillgänglig rester avgörande för interaktionen med metalljoner. AtHIRD11 visar flera olika kostnad-till-storlek-nyckeltal på grund av olika effektiva radier av olika konformationer. Dessa konformationer kan sammanfoga kontinuerligt. Därefter är toppar 5-7 bredare än de vanliga protein topparna. De breda topparna ge en ledtråd på kinetiken för interaktioner. Eftersom topparna inte är smala, kan en snabb och en mycket långsam konvertering mellan de olika konformationer uteslutas. I båda fallen skulle topparna vara separerade med baslinjen⁴. I det här fallet ett jämviktade steg kan ändra mönstret peak och skulle ge en bättre inblick i samspelet med långsammare kinetik.

Figur 4 visar grafiskt utvärderingen av uppmätta flyttningstid skiftar i närvaro av olika metalljoner för topp 6. Det representeras av beräknade värdet ΔR/R_f. Det här värdet anger hur stark en Skift är (av dess värde) och en övergripande förändring av protein-metall Jon komplex avgiften (av dess undertecknar). För att skilja mellan en signifikant interaktion och en tillfällighet Skift, konfidensintervallen för α = 0,05 beräknas också. I fall där konfidensintervallet inte skär med nollinjen anses samspelet som betydande. Resultat beaktas om toppen var närvarande i minst 6 av 10 elektroferogrammen. Topp 6 var inte närvarande i någon kör med 500 µM Co^{2 +}. Den kompletta listan av interaktioner för varje AtHIRD11 topp publiceras i ett tidigare arbete av Nachbar o.a. ⁴.

ΔR/R_f beräknas med hjälp av migration tid nyckeltal R_jag (i närvaro av liganden) och migration tid nyckeltalen R_f (i frånvaro av liganden):

R_jag och R_f beräknas med topp topp gånger t_protein för protein prov topparna och de motsvarande topp topp tid för EOF-markören t_EOF:

För R_jagär tiden i närvaro av liganden används och för R_f, gånger i frånvaro.

Figur 1 : Elektroferogram för CGE avskiljandet av AtHIRD11 provet i gel buffert. TOPP 1 och på dess vänstra kan observeras även utan en prov injektion, så de är artefakter. Sedan massorna och totalt topp topp 2 och 3 är mindre än topp 4, de är sannolika föroreningar, såsom nedbrytningsprodukter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Elektroferogram av den EOF-markör acetanilid köra. Figuren visar endast 1 topp för föreningen utan metalljoner och SDS gel buffert. Tidpunkten för topp topp markerar det elektroosmotiska flödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Exempel för ett elektroferogram av provet separation under ACE experimenten med komplexa peak mönster i avsaknad av några metalljoner. Minst 7 toppar kunde identifieras och relaterade till proteinet och dess 2 föroreningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Grafisk utvärdering av den bindande beteenden mot undersökta metalljoner med en koncentration av 500 µM för topp 6. Värdena för ΔR/R_f ge en ledtråd på intensiteten av migration Timeshift och därför på styrkan konfirmerande förändringarna på metall Jon bindning. Tecken på ΔR/R_f indikerar om anläggningen är mer positivt eller negativt laddat jämfört med de obundna proteinet. Felstaplarna indikerar konfidensintervallen för α = 0,05. Därefter, de visar området där den sanna ΔR/R_f-värde kan hittas med en säkerhet på 95%. De röda staplarna visar de beräkna resultaten av otillräckliga data (peak var närvarande i mindre än 6 elektroferogrammen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

För alla CE experiment är utarbetandet av kapillären ett kritiskt steg. Eftersom det är ett glasrör med en liten diameter, kan det lätt bryta på platser där beläggningen avlägsnas när det sköts. Installationen av kapillären i instrumentet bör göras mycket noggrant.

De kritiska steg som ingår i Ess metoden främst avser den experimentella setup. Ett annat viktigt steg är att hitta rätt prov injektion parametrarna. Den injicerade mängden provet måste vara tillräckligt för höga toppar. Dock skulle överbelastning det resultera i ett dåligt löst peak mönster med överlappande toppar. När minskar den injicerade volymen, rekommenderas det att minska Injekteringstryck istället för injektion tidpunkten eftersom det tar tid för instrumentet för att nå den programmerade insprutningstryck.

Ovanligt breda toppar kan hittas för olika protein prover. Detta mönster kan påverkas genom att öka spänningen. Följaktligen, topparna få smalare och separation tiden minskas. Dock den kortare separation tid kan resultera i inte-löst toppar och högre spänning ökar Joule värme och begränsar effekten av smala toppar genom elektroforesisk dispersion^7,8. Därför har rätt förutsättningar skall bestämmas för varje ny protein undersökt.

Kombinera CGE och ACE för att samla information om egensäkra oordnade karaktären av ett protein och dess bindande beteende är en ny metod. Karakterisering av provet med gelelektrofores är ett nödvändigt steg att bevisa att någon flera toppar som observerades inte är relaterade till föroreningar. Fördelen med CGE är möjligheten att automatisera den, den kortare förberedelsetiden och högre upplösning jämfört med klassiska gelelektrofores⁹. Med ACE för IDP bindande experiment visar sin överlägsenhet gentemot andra analyser (t.ex., orörlig metall affinitetskromatografi i resultaten) sedan ACE inte bara visar bindande händelser. Dessutom det separerar olika konformationer av ett protein och kan avslöja skillnader i bindande ligander av olika konformationer. Detta beteende kan inte identifieras av metoder utan en separation under bindande experimentet. Tidpunkten för analys är dessutom endast 6 min. resultaten kan därför beräknas under en kort tid¹⁰. Däremot, kommer den snabba analysen med begränsningar i uppskatta antalet bindande platser¹¹.

Framtiden för denna strategi ligger i möjligheten att skärmen potentiella bindande partner för proteiner, särskilt internflyktingar, på ett snabbt sätt. Det ger en snabb översikt av de olika konformationer i en provet olika bindande beteende. Användning av en storlek-beroende-separation (t.ex., CGE) för provet karakterisering är obligatoriskt eftersom ACE själv inte kan skilja mellan föroreningar och protein själv. CGE ger dock en uppfattning om antalet olika stora arter. Tillämpningen av ACE som en bindande analysen har förlängts redan från metall Jon ligander till någon laddade ligand¹². Därför det kan lägga till ytterligare information om interaktioner i någon kännetecknas bindande, eftersom kombination av separation och bindande analysen i en metod kan ge bevis på någon förändrad bindande beteende av olika konformationer och posttranslationell modifieringar, respektive.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AtHIRD11 sample	Shizuoka University (Group Prof. M. Hara)	-	Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary	Polymicro Technologies (Phoenix, USA)	106815-0017	TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	comercially not available anymore	Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G7100A	Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL	B. Braun (Melsungen, Germany)	4606051V	Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)	KY62.1	PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.023	Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL	Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)	3121 000.120	Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 08	Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 338 14	Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1457	Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL	Duran Group GmbH(Mainz, Germany)	24 671 1054	Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer	Beckman Coulter (Brea, USA)	comercially not available anymore	Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032
Acetanilide	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	397229-5G	Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	13217	Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	431788-100G	Rinsing ingredient
Bariumchloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	202738-5G	Ligand
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	71729-100G	Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	654507-5G	Ligand
Selenium(IV) chloride	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	323527-10G	Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris)	Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)	252859-100G	Buffer ingredient
Zinc(II) chloride	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1088160250	Ligand
Strontium nitrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1078720250	Ligand
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1371015000	Ligand
37% hydrochloric acid	Merck Millipore ( Darmstadt, Germany)	1003171000	Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate	Riedel-de Haën (Seelze, Germany)	31286	Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L	Allpax (Papenburg, Germany)	10000084;0	Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1	Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)	G2070-91126	Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it