Summary
इस प्रोटोकॉल केशिका जेल ट्रो द्वारा एक प्रोटीन नमूने के लक्षण वर्णन को जोड़ती है और एक तेजी से बाध्यकारी लाइगैंडों द्वारा आरोपित के लिए स्क्रीनिंग संबध केशिका ट्रो । यह एक लचीला संरचना के साथ प्रोटीन के लिए सिफारिश की है, जैसे आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन, अलग अनुरूपता के लिए बाध्यकारी में कोई अंतर निर्धारित करने के लिए ।
Abstract
पौधे अपने पर्यावरण पर दृढ़ता से निर्भर रहते हैं । तनावपूर्ण परिवर्तन (जैसे, सूखा और उच्च लवणता) को समायोजित करने के लिए, उच्च संयंत्रों ऑक्सीडेटिव और आसमाटिक तनाव को कम करने के लिए आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन (IDPs) की कक्षाएं विकसित । यह आलेख केशिका जेल ट्रो (CGE) और गतिशीलता बदलाव संबध ट्रो (ऐस) का एक संयोजन का उपयोग करता है क्रम में AtHIRD11Arabidopsis से IDP थालियाना के विभिन्न क्षेऽ के बंधन व्यवहार का वर्णन करने के लिए । CGE AtHIRD11 की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए और टुकड़े, posttranslational संशोधनों, और जटिल चोटी पैटर्न के लिए कारणों के रूप में अंय अशुद्धियों को बाहर करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रयोग के इस भाग में, विभिन्न नमूना घटकों उनके विभिन्न द्रव्यमान द्वारा एक केशिका के अंदर एक चिपचिपा जेल द्वारा अलग कर रहे हैं और एक डायोड सरणी डिटेक्टर के साथ पता चला. इसके बाद, विभिंन धातु आयनों की ओर नमूना के बंधन व्यवहार इक्का द्वारा जांच की है । इस स्थिति में, ligand बफ़र समाधान करने के लिए जोड़ा गया है, और माइग्रेशन समय में shift एक बाइंडिंग इवेंट उत्पन्न हुई है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए मापा जाता है । एक IDP के बंधन व्यवहार का निर्धारण करने के लिए CGE और इक्का के संयोजन का उपयोग करने के लाभों में से एक संभावना को स्वचालित जेल ट्रो और बाध्यकारी परख है । इसके अलावा, CGE शास्त्रीय जेल ट्रो से पता लगाने की एक कम सीमा से पता चलता है और इक्का एक तेजी से तरीके से एक ligand बंधन के तरीके को निर्धारित करने में सक्षम है । इसके अलावा, ऐस भी धातु आयनों से अंय आरोप लगाया प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, बाध्यकारी प्रयोगों के लिए इस विधि का उपयोग बाइंडिंग साइटों की संख्या निर्धारित करने की क्षमता में सीमित है । फिर भी, CGE और इक्का के संयोजन निस्र्पक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कई आरोप लगाया लाइगैंडों के प्रति कोई प्रोटीन नमूना के बंधन व्यवहार ।
Introduction
पौधे कई अन्य जीवन रूपों की तुलना में अपने पर्यावरण पर अधिक निर्भर होते हैं । के बाद से पौधों को अंय स्थानों पर नहीं ले जा सकते हैं, वे अपने परिवेश में परिवर्तन के लिए समायोजित किया है (जैसे, सूखा, ठंडा और उच्च नमक सांद्रता) । नतीजतन, उच्च संयंत्रों dehydrins है, जो कई गुना कार्य पूरा करने सेल तनाव को कम करने की तरह विशेष तनाव प्रोटीन विकसित उच्च लवणता से संबंधित । इन प्रोटीनों के अंदर कोशिकाओं पानी और आयनों बांध, घन2 +-आयनों बाध्यकारी द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने, और साथ ही cytoskeletons फॉस्फोलिपिड के साथ बातचीत । इसके अलावा, बाध्यकारी Zn2 +-आयनों इन प्रोटीन प्रतिलेखन कारकों के रूप में कार्य करने के लिए अनुमति देता है । फास्फारिलीकरण के बाद Ca2 +-आयनों को बाइंड करने की उनकी क्षमता भी सूचित किया गया है1.
इन प्रोटीन के बहुआयामी व्यवहार hydrophobic एमिनो एसिड अवशेषों के अभाव से संबंधित है । नतीजतन, वे पेप्टाइड श्रृंखला के अंदर किसी भी hydrophobic बातचीत और भी एक विवश संरचना की कमी है । हालांकि, क्योंकि इन प्रोटीन एक प्रतिबंधात्मक संरचना की कमी है, वे एक ही परिस्थितियों में विभिंन सुधारवादी कब्जा कर सकते हैं । इसलिए, वे संरचनाओं के एक पहनावा के रूप में सबसे अच्छा बताया जा सकता है बजाय एक एकल रचना के रूप में । इन गुणों के साथ प्रोटीन आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन (IDPs) के रूप में जाना जाता है और तनाव प्रोटीन और eukaryotic कोशिकाओं2में विभिंन रास्ते के बीच crosstalk के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की अवधारणा कर रहे हैं ।
इनमें से एक तनाव से संबंधित IDPs AtHIRD11 है । यह Arabidopsis थालियानाके सबसे अत्यधिक सूखा-व्यक्त IDPs में से एक है । इसलिए, विभिंन संरचनाओं के अनुपात को चार्ज करने के लिए अपने प्रभावी त्रिज्या से अलग किया जा सकता है, और केशिका ट्रो (CE) आगे की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । पिछले इक्का प्रयोगों घन2+-, Zn2+-, सह2+, और Ni2 +-आयनों के रूप में AtHIRD11 और संक्रमण धातु आयनों के बीच बातचीत का प्रदर्शन किया । विस्तृत परिणामों में पाया जा सकता है हारा एट अल । 3 और Nachbar एट अल. 4.
इक्का विधि है कि यहां इस्तेमाल किया जाएगा हमारे पहले प्रकाशित काम करता है6पर आधारित है । हालांकि, प्रोटीन के नमूने के लिए EOF मार्कर acetanilide के अलावा उपयुक्त नहीं है । AtHIRD11 व्यापक पीक पैटर्न से पता चलता है, और नमूने के लिए EOF मार्कर जोड़ने दो चोटियों छिपाने होगा. इसलिए, मार्कर एक अलग रन में प्रयोग किया जाता है । इससे पहले कि बाध्यकारी व्यवहार की जांच की जाती है, इस बात की पुष्टि की जाती है कि पिछले प्रयोगों के दौरान पाई गई चोटियों की रचनाएं विभिन्न रूप से होती हैं । इस प्रकार, CGE प्रोटीन अनुरूपता के बीच अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, के बाद अनुवाद संशोधित प्रोटीन, और अशुद्धियों, AtHIRD11 के टुकड़े के रूप में, उनके विभिन्न जनता द्वारा. बाद में, विभिंन विभिंन धातु आयनों की ओर विशेषता AtHIRD11 नमूना है बाध्यकारी व्यवहार की जांच की है ।
इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप का वर्णन करने के लिए एक IDP और एक नमूना के अंय घटकों के बीच अंतर करने के क्रम में विभिंन क्षेऽ के बंधन व्यवहार में अंतर का मूल्यांकन है ।
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Protocol
1. केशिका ट्रो उपकरणों की तैयारी
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केशिकाएं तैयार
- एक polyimide बाहरी कोटिंग के साथ एक नंगे-जुड़े सिलिका केशिका काटने के लिए एक ग्लास कटर का प्रयोग करें और ५० µm के एक भीतरी व्यास में ३३ सेमी (CGE प्रयोग के लिए) और 30 सेमी (इक्का प्रयोग के लिए) लंबी केशिकाओं । एक गिलास प्लेट पर काटने प्रदर्शन करते हैं ।
नोट: 2 अलग प्रयोगात्मक setups 2 अलग उपकरणों के लिए विकसित किए गए थे. आदेश में अन्य उपकरणों पर उन्हें उपयोग करने के लिए, एक उचित विधि हस्तांतरण किया जा करने के लिए है और केशिका लंबाई साधन की अनुमति दी लंबाई करने के लिए समायोजित किया जा करने के लिए है । - CGE प्रयोग के लिए केशिकाओं के एक छोर से २४.५ सेमी की दूरी पर और ऐस प्रयोग (प्रभावी लंबाई) के लिए केशिका के एक छोर से २१.५ सेमी पर एक 1-सेमी चौड़ी जांच विंडो के मध्य चिह्नित करने के लिए एक पेन का उपयोग करें ।
- यह एक टांका लगाने, ०.५ सेमी से पहले और बाद के निशान के साथ जल से polyimide बाहरी कोटिंग केशिकाओं से निकालें । इसी तरह, टांका लगाने की केशिकाओं के दोनों सिरों पर कोटिंग के 1 सेमी को दूर करने के लिए उपयोग करें ।
नोट: प्रभावी लंबाई थोड़ा भिंन हो सकती है क्योंकि यह केशिका ट्रो साधन इस्तेमाल पर निर्भर करता है । - केशिकाओं और इथेनॉल और एक नरम ऊतक के साथ पता लगाने खिड़कियों के सिरों को साफ करें ।
नोट: अनकोट केशिकाओं कम लचीला और तोड़ने की संभावना है ।
- एक polyimide बाहरी कोटिंग के साथ एक नंगे-जुड़े सिलिका केशिका काटने के लिए एक ग्लास कटर का प्रयोग करें और ५० µm के एक भीतरी व्यास में ३३ सेमी (CGE प्रयोग के लिए) और 30 सेमी (इक्का प्रयोग के लिए) लंबी केशिकाओं । एक गिलास प्लेट पर काटने प्रदर्शन करते हैं ।
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केशिकाओं स्थापित
- आउटलेट के पास पता लगाने खिड़की के साथ CE प्रणाली में एक केशिका स्थापित करें ।
नोट: विभिन्न CE साधन मॉडल केशिकाओं के लिए अलग होल्डिंग सिस्टम है । सटीक निर्देशों के लिए प्रयुक्त यंत्र के मैनुअल को देखें ।
- आउटलेट के पास पता लगाने खिड़की के साथ CE प्रणाली में एक केशिका स्थापित करें ।
2. समाधान तैयार करें
- CGE विश्लेषण के लिए समाधान तैयार करें
- tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris)-एसडीएस बफर (१०० mM/1% डब्ल्यू/वी) पीएच ८.० पर तैयार करें ।
- १००-एमएल यूरिन में सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) का वजन १.०० ग्राम के लिए एक श्वसन मास्क और एक बूथ का प्रयोग करें ।
- १०० मिलीलीटर चोंच में Tris के १.२१ ग्राम जोड़ें और यह भंग पानी की ५० मिलीलीटर और एक चुंबकीय सरगर्मी पर एक चुंबकीय हलचल बार का उपयोग कर ।
- समाधान में एक पीएच इलेक्ट्रोड रखो और १.० एम एचसीएल का उपयोग कर ८.० को पीएच समायोजित करें ।
- एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में समाधान भरें और पानी के निशान को ऊपर जोड़ें । यह धीरे शेक किसी भी फोम बनाने से बचने के लिए ।
- ०.१ मीटर NaOH सॉल्यूशन तैयार करें ।
- एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में NaOH का वजन ४.० ग्राम है । इसे भरें पानी के साथ निशान के लिए एक 1 मीटर स्टॉक बनाने के लिए ।
- एक 10 मिलीलीटर बल्ब पिपेट का प्रयोग करें एक और १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में इस समाधान के 10 मिलीलीटर हस्तांतरण और यह पानी के साथ निशान को भरें ।
- ०.१ एम एचसीएल सॉल्यूशन तैयार करें ।
- 10 एम एचसीएल के 10 मिलीलीटर एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में एक 10 मिलीलीटर volumetric पिपेट का उपयोग कर रखो और यह पानी के साथ निशान तक भरें । ०.१ M HCl प्राप्त करने के लिए इस चरण को दोहराएँ ।
- नमूना समाधान तैयार करें ।
- वजन ०.५ मिलीग्राम प्रोटीन की एक 1 मिलीलीटर ट्यूब में । एक micropipette के साथ कदम 2.1.1 से Tris-एसडीएस जेल बफर के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
- धीरे मिलाते हुए किसी भी फोम बनाने और प्रोटीन की गिरावट से बचने के लिए प्रोटीन भंग ।
ध्यान दें: अल्ट्रासोनिक का उपयोग करें यदि प्रोटीन वर्णित के रूप में भंग नहीं किया जा सकता; समाधान के किसी भी ताप से बचें ।
- शीशियों में समाधान भरें ।
- एक ०.२२ µm polyvinylidene फ्लोराइड के माध्यम से प्रत्येक समाधान फ़िल्टर (PVDF) सीधे शीशी में एक पर्याप्त सिरिंज का उपयोग कर फिल्टर.
नोट: जेल-युक्त समाधान के लिए, पीठ के दबाव उच्च चिपचिपाहट के कारण अधिक हो सकता है । - कुल में 15 शीशियों तैयार है और किसी भी मिश्रण अप से बचने के लिए प्रत्येक निशान ।
- पीएच 8 में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) जेल बफर के साथ 3 शीशियों भरें ।
नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसडीएस जेल बफ़र का उपयोग अधिक सटीक परिणाम प्रदान करता है । - फ्लशिंग के लिए ०.१ मीटर एचसीएल के साथ ०.१ मीटर NaOH और 1 शीशी के साथ 1 शीशी भरें ।
- नमूना समाधान के साथ 1 शीशी भरें ।
- 5 शीशियों को पानी के साथ और 4 शीशियों को ०.१ मिलीलीटर पानी (सूई की शीशियों) के साथ भरें ।
नोट: सूई शीशियों प्रत्येक चलाने से पहले केशिका के निस्तब्धता के दौरान अपशिष्ट शीशियों के रूप में उपयोग किया जाता है । केशिका समाप्त होता है पानी में डूबा हुआ है ताकि किसी भी जेल अवशेषों से कुल्ला करने के लिए ।
- पीएच 8 में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) जेल बफर के साथ 3 शीशियों भरें ।
- एक ०.२२ µm polyvinylidene फ्लोराइड के माध्यम से प्रत्येक समाधान फ़िल्टर (PVDF) सीधे शीशी में एक पर्याप्त सिरिंज का उपयोग कर फिल्टर.
- tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris)-एसडीएस बफर (१०० mM/1% डब्ल्यू/वी) पीएच ८.० पर तैयार करें ।
- ऐस विश्लेषण के लिए समाधान तैयार करें
- 1 M NaOH हल तैयार करें ।
- एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में NaOH का वजन ४.० ग्राम है ।
- इसे भरें पानी के साथ निशान के लिए एक 1 मीटर स्टॉक बनाने के लिए ।
- ०.१ मीटर ethylendiaminetetraacetic एसिड (EDTA) को ०.१ मीटर NaOH सॉल्यूशन में तैयार करें ।
- एक 10 मिलीलीटर बल्ब पिपेट का उपयोग कर एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में ०.१ मीटर NaOH के 10 मिलीलीटर स्थानांतरण । इसे भरें पानी के साथ निशान तक ।
- एक वजनी नाव पर EDTA का २.४२ ग्राम वजन और ०.१ मीटर NaOH के १०० मिलीलीटर में ठोस यौगिक भंग ।
- Tris बफ़र (30 mM) समाधान तैयार करें ।
- Tris के ३.६३ ग्राम, पानी के २०० मिलीलीटर, और एक ५०० मिलीलीटर चोंच में एक हलचल बार जोड़ें । एक हलचल प्लेट पर चोंच प्लेस और यह स्विच पर ।
- एक पीएच मीटर इलेक्ट्रोड चोंच में रखो और ०.१ मीटर एचसीएल का उपयोग कर ७.४ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
- एक 1 L volumetric कुप्पी में समाधान भरें और पानी के साथ निशान तक भरें ।
नोट: इस प्रक्रिया को दोहराया जा करने के लिए या एक बड़ा volumetric कुप्पी के बाद से अधिक 1 एल पूरे विश्लेषण के लिए आवश्यक है की जरूरत है ।
- acetanilide electroosmotic फ्लो (EOF)-मार्कर (६० µ m) समाधान तैयार करें ।
- acetanilide के 6 मिलीग्राम और एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में Tris बफर के १०० मिलीलीटर जोड़ें ।
- एक अल्ट्रासोनिक स्नान में volumetric कुप्पी रखो और यह स्विच पर 30 मिनट के लिए ।
- नमूना तैयार करें (1 मिलीग्राम/एमएल) समाधान ।
- एक सटीक संतुलन पर एक ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब रखो और ट्यूब में फ्रीज-सूखे AtHIRD11 पाउडर के ०.३ मिलीग्राम जोड़ें ।
- एक 30 मिमी Tris बफर (पीएच ७.४) के ट्यूब में ०.३ मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक micropipette का उपयोग करें । ट्यूब को ध्यान से शेक प्रोटीन को भंग करने के लिए ।
- ligand समाधान तैयार करें ।
- CaCl2 (5 मिमी) स्टॉक समाधान तैयार करें ।
- एक वजनी नाव ले लो, यह एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर डाल दिया और वजन ३६.७६ मिलीग्राम CaCl2* एच2ओ ।
- एक micropipette का प्रयोग, CaCl2* H2हे वजनी नाव से पहले से तैयार Tris बफर के साथ एक ५० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में फ्लश ।
- Tris बफर के साथ volumetric कुप्पी को निशान तक भरें ।
- शेष स्टॉक समाधान (5 मिमी) तैयार करें ।
- दोहराएँ चरण 2.2.6.1 के बजाय अन्य धातु लवण का उपयोग कर CaCl2* H2O [MgCl2: २३.८० मिलीग्राम, BaCl2: २६.०२ mg, Sr (कोई3)2: ५२.९१ मिलीग्राम, MnCl2: ३१.४६ मिलीग्राम, SeCl4: ५२.९१ मिलीग्राम, CoCl 2* 2H2ओ: ४१.४७ मिलीग्राम, CuCl2* 2H2ओ: ४२.६२ मिलीग्राम, ZnCl2: ३.४१ मिलीग्राम, और NiCl2* 6H2हे: ५९.४३ मिलीग्राम] ।
नोट: ZnCl2 समाधान ०.५ mM की एकाग्रता है । आयनों और भीतरी केशिका दीवार के बीच मजबूत बातचीत के बाद से मनाया गया, एकाग्रता 104के एक कारक द्वारा कम किया गया था ।
- दोहराएँ चरण 2.2.6.1 के बजाय अन्य धातु लवण का उपयोग कर CaCl2* H2O [MgCl2: २३.८० मिलीग्राम, BaCl2: २६.०२ mg, Sr (कोई3)2: ५२.९१ मिलीग्राम, MnCl2: ३१.४६ मिलीग्राम, SeCl4: ५२.९१ मिलीग्राम, CoCl 2* 2H2ओ: ४१.४७ मिलीग्राम, CuCl2* 2H2ओ: ४२.६२ मिलीग्राम, ZnCl2: ३.४१ मिलीग्राम, और NiCl2* 6H2हे: ५९.४३ मिलीग्राम] ।
- ५०० µ m CaCl2 हल तैयार करें ।
- CaCl2 शेयर समाधान के 10 मिलीलीटर भरें और यह एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में डाल दिया ।
- निशान के लिए एक Tris बफर के साथ volumetric कुप्पी भरें और कुप्पी हिला ।
- २५० µ m CaCl2 हल तैयार करें ।
- CaCl2 शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर भरें और यह एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में डाल दिया ।
- निशान के लिए एक Tris बफर के साथ volumetric कुप्पी भरें और कुप्पी हिला ।
- अंय स्टॉक समाधानों के लिए चरण 2.2.6.3 और 2.2.6.4 दोहराएं ।
- CaCl2 (5 मिमी) स्टॉक समाधान तैयार करें ।
- शीशियों में समाधान भरें ।
नोट: हर दोहराया चलाने प्रवेश और आउटलेट शीशियों का एक सेट की जरूरत है । प्रवेश और आउटलेट पर ताजा ligand समाधान का उपयोग प्रत्येक रन के बाद प्रवास के समय में बदलाव को कम कर देता है ।- एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में २५० µ m CaCl2 समाधान भरें ।
- सिरिंज पर एक ०.२२ µm PVDF फिल्टर रखो और इस फ़िल्टर समाधान को छोड़ने के लिए सिरिंज का उपयोग कर फिल्टर के माध्यम से समाधान के 2 मिलीलीटर धक्का.
- 10 शीशियों को भरने के शेष २५० µ एम CaCl2 सिरिंज के समाधान के साथ अधिकतम अनुमति दी मात्रा के लिए । मार्क प्रत्येक के रूप में २५० µ m CaCl 2 समाधान प्रवेश शीशी।
- 10 शीशियों को भरें जब तक वे २५० µ एम CaCl2 समाधान के साथ आधा भर रहे हैं । प्रत्येक के रूप में मार्क २५० µ एम CaCl 2 समाधान आउटलेट शीशी।
- दोहराएं चरण 2.2.7.1-2.2.7.4 अंय धातु नमक युक्त समाधान के लिए ।
- प्रवेश और आउटलेट शीशियों 30 mM Tris बफर (पीएच ७.४) समाधान के बजाय का उपयोग कर के हर जोड़ी के लिए कदम दोहराएं ।
नोट: 30 mmol/L Tris बफर पीएच ७.४ में रन के बीच में प्रयोग किया जाता है क्रम में धातु आयनों के अभाव में प्रोटीन के लिए माइग्रेशन समय डेटा प्राप्त करने के लिए । यह EOF में परिवर्तन की उपेक्षा के क्रम में आवश्यक है । - इसके बजाय acetanilide EOF-मार्कर (६० µ m) का उपयोग कर एक शीशी के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएँ । इसके अलावा, नमूना (1 मिलीग्राम/एमएल) के बजाय समाधान का उपयोग कर इन चरणों को दोहराएँ ।
- 1 M NaOH हल तैयार करें ।
3. केशिका जेल Electrophoretic जुदाई
नोट: Nachbar एट अल द्वारा पिछले काम में वर्णित विधि के अनुसार जुदाई तैयार करते हैं । 4.
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विश्लेषण तैयार
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केशिका हालत
- 23 डिग्री सेल्सियस के लिए थर्मोस्टेट सेट ।
- ०.१ मीटर NaOH के साथ २.५ बार में 10 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
- ०.१ मीटर एचसीएल के साथ २.० बार में 5 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
- पानी के साथ २.० पट्टी पर 2 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
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एसडीएस जेल बफर में भरें
- २.० बार में 10 मिनट के लिए एक केशिका भरें पीएच ८.० पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसडीएस जेल बफर के साथ ।
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प्रत्येक जुदाई चलाने से पहले केशिका फ्लश
- ०.१ मीटर NaOH के साथ ४.० बार में 3 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
- ०.१ मीटर एचसीएल के साथ ४.० बार में 1 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
- पानी के साथ ४.० बार में 1 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
- एसडीएस जेल बफर के साथ ४.० पट्टी पर 10 मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
-
केशिका हालत
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जुदाई भागो
- CGE प्रयोगों के लिए नमूना समाधान इंजेक्षन (step 2.1.4) hydrodynamically प्रवेश पर 4 मिनट के लिए ०.१ बार लागू करने से.
- लागू करें-१६.५ केवी और 25 मिनट के लिए केशिका के दोनों सिरों पर २.० बार का दबाव ।
4. अपनत्व केशिका Electrophoretic विश्लेषण
नोट: Nachbar एट अल द्वारा पिछले कार्यों में वर्णित विधि के अनुसार जुदाई तैयार करते हैं । 4 और Alhazmi एट अल. 5.
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केशिका हालत
- 23 डिग्री सेल्सियस के लिए थर्मोस्टेट सेट ।
नोट: तापमान प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रयोग किया जाता है और अन्य तापमान4,5करने के लिए बदला जा सकता है । हालांकि, बातचीत के तापमान पर निर्भर कर रहे है और तदनुसार बदल जाएगा । - ०.१ मीटर NaOH के साथ २.५ पट्टी पर ४० मिनट के लिए एक केशिका फ्लश ।
- 10 मिनट के लिए केशिका पानी के साथ १.० पट्टी में फ्लश ।
- 30 मिमी Tris बफर (पीएच ७.४) के साथ १.० बार में ३० मिनट के लिए केशिका फ्लश ।
- 23 डिग्री सेल्सियस के लिए थर्मोस्टेट सेट ।
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ऐस तरीकों के लिए तैयारी
- लाइगैंडों बिना माप के लिए विधि तैयार करें ।
नोट: Acetanilide नमूना समाधान करने के लिए नहीं जोड़ा गया था, के रूप में यह 2 प्रोटीन चोटियों धर.- एक ०.१ मीटर EDTA समाधान के साथ २.५ बार में 1 मिनट के लिए केशिका कुल्ला ।
- पानी के साथ २.५ बार में 1 मिनट के लिए केशिका कुल्ला ।
- equilibration के लिए एक Tris बफर के साथ २.५ बार में १.५ मिनट के लिए केशिका कुल्ला ।
- ०.०५ पट्टी पर 6 एस के लिए acetanilide समाधान इंजेक्षन और Tris बफर शीशियों के लिए प्रवेश और आउटलेट शीशियों बदल जाते हैं ।
- २.४ एस के लिए ०.०५ बार लागू करें ताकि आगे केशिका की नोक से acetanilide समाधान पुश करने के लिए अंदर ।
- 6 मिनट के लिए १०.० केवी लागू करें और २०० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर acetanilide चोटी का पता लगाने ।
- दोहराएँ चरण 4.2.1.1. -4.2.1.6 । acetanilide समाधान के बजाय प्रोटीन के नमूने का उपयोग करना और सभी प्रोटीन चोटियों का पता लगाने ।
- लाइगैंडों के साथ माप के लिए विधि तैयार करें ।
- एक ०.१ मीटर EDTA समाधान के साथ २.५ बार में 1 मिनट के लिए केशिका कुल्ला ।
- पानी के साथ २.५ बार में 1 मिनट के लिए केशिका कुल्ला ।
- equilibration के लिए ligand समाधान के साथ २.५ पट्टी पर १.५ मिनट के लिए केशिका कुल्ला ।
- ०.०५ पट्टी पर 6 एस के लिए acetanilide समाधान इंजेक्षन और ligand-युक्त बफर शीशियों के लिए प्रवेश और आउटलेट शीशियों बदल जाते हैं ।
- २.४ एस के लिए ०.०५ बार लागू करें ताकि आगे केशिका की नोक से acetanilide समाधान पुश करने के लिए अंदर ।
- 6 मिनट के लिए १०.० केवी लागू करें और २०० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर acetanilide चोटी का पता लगाने ।
- दोहराएं कदम 4.2.2.1-4.2.2.6 प्रोटीन नमूना acetanilide समाधान के बजाय का उपयोग कर और सभी प्रोटीन चोटियों का पता लगाने ।
- वैकल्पिक रूप से कदम 4.2.1 और 4.2.2 के क्रम में विभिंन प्रोटीन धातु आयन बातचीत के लिए चार्ज आकार अनुपात में परिवर्तन की गणना करने के लिए दोहराएं ( प्रतिनिधि परिणामोंके तहत वर्णित) ।
- बदलें प्रोटीन समाधान हर ६० के बाद एक ताजा एक के लिए एच ।
नोट: इस बिंदु पर, प्रयोग को रोका जा सकता है । इस प्रक्रिया के बाद से पीक पैटर्न थोड़ा चलाने के लिए चलाने से भिंन होता है लाइगैंडों के प्रत्येक एकाग्रता के लिए कम से कम 10x दोहराया है । समाधान ६० h से अधिक उपयोग किया जाता है, तो भिन्नता बहुत बड़ी हो ।
- बदलें प्रोटीन समाधान हर ६० के बाद एक ताजा एक के लिए एच ।
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विधियां चलाएं
- चरण 4.2.2 के तहत वर्णित विधि चलाने के लिए, क्षारीय पृथ्वी ligand समाधान (CaCl2, MgCl2, BaCl2, और SrCl2 समाधान) का उपयोग कर ।
- चरण 4.2.2 के अंतर्गत वर्णित विधि का उपयोग जारी रखें, MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2, और NiCl 2 समाधान के बजाय क्षारीय पृथ्वी ligand समाधान का उपयोग कर ।
नोट: उत्तरार्द्ध संक्रमण धातु क्लोराइड केशिका के साथ मजबूत बातचीत दिखाई और पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता । इन इंटरैक्शन को चलने से माइग्रेशन समय में शिफ़्ट हो जाते हैं. नतीजतन, वे अंय धातु आयनों के बाद जांच की गई ।
- लाइगैंडों बिना माप के लिए विधि तैयार करें ।
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Representative Results
चित्रा 1 CGE प्रयोगों के दौरान प्राप्त AtHIRD11 नमूना के लिए electropherogram से पता चलता है. पेप्टाइड आकार बाएं से दाएं बढ़ाता है । पीक संख्या 4 में सबसे बड़ा द्रव्यमान है और यह बरकरार प्रोटीन को इंगित करता है । छोटे चोटियों 2 और 3 का प्रतिनिधित्व करते हैं छोटे अशुद्धियों (जैसे, गिरावट उत्पादों). पहले चोटी और आधारभूत की विसंगति से पहले भी प्रोटीन के नमूने के बिना reproduced किया जा सकता है । इसलिए, यह एसडीएस जेल खुद से संबंधित है और किसी भी नमूने से जुड़े अशुद्धियों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।
चित्रा 2 ऐस प्रयोगों के दौरान acetanilide के लिए electropherogram का प्रतिनिधित्व करता है. acetanilide समाधान केवल 1 उच्च शिखर से पता चलता है क्योंकि यह कोई अशुद्धियां होनी चाहिए । पीक अधिकतम के लिए खोज समय electroosmotic प्रवाह (tEOF) के माइग्रेशन समय को इंगित करता है और सहभागिता की गणना के लिए उपयोग किया जाता है ।
चित्रा 3 एसडीएस और धातु आयनों के अभाव में ऐस प्रयोग के दौरान AtHIRD11 नमूना के electropherogram है । यह पता चलता है, CGE electropherogram से 2 अशुद्धियों के अलावा, कम से 5 चोटियों जो खुद को प्रोटीन से संबंधित हैं । चोटी 1 और 2 अशुद्धियों को सौंपा जा सकता है के बाद से उनके प्रवास बार संकेत मिलता है कि वे छोटे या अत्यधिक सकारात्मक आरोप लगाया है । इस धारणा को शिखर की ऊँचाई और समय के साथ क्षेत्र की वृद्धि से समर्थन प्राप्त है. चूंकि AtHIRD11 चोटियों 3 और 4 EOF के करीब हैं, वे मुश्किल से चार्ज कर रहे हैं और हर रन में अलग नहीं किया जा सकता है । वे लगभग कोई बातचीत दिखाने के लिए और उपलब्ध अवशेषों के बिना संरचनाओं का प्रतिनिधित्व धातु आयनों के साथ बातचीत के लिए आवश्यक । AtHIRD11 विभिन्न क्षेऽ के विभिन्न प्रभावी radii के कारण कई विभिन्न प्रभार-से-आकार-अनुपात दिखाता है । ये क्षेऽ लगातार मर्ज कर सकते हैं । बाद में, चोटियों 5-7 सामांय प्रोटीन चोटियों से व्यापक हैं । व्यापक चोटियों पर बातचीत के कैनेटीक्स पर एक संकेत दे । चूंकि चोटियों संकीर्ण नहीं कर रहे हैं, एक तेजी से और विभिंन संरचनाओं के बीच एक बहुत धीमी गति से रूपांतरण बाहर रखा जा सकता है । दोनों ही मामलों में, चोटियों बेसलाइन-4अलग किया जाएगा । इस मामले में, एक पूर्व equilibration कदम चोटी पैटर्न बदल सकते है और धीमी कैनेटीक्स के साथ बातचीत में एक बेहतर अंतर्दृष्टि देना होगा ।
चित्रा 4 पीक 6 के लिए विभिंन धातु आयनों की उपस्थिति में मापा माइग्रेशन समय पाली के चित्रमय मूल्यांकन से पता चलता है । यह परिकलित मान ΔR/Rfद्वारा दर्शाया जाता है । यह मान इंगित करता है कि कैसे एक बदलाव मजबूत है (इसके मूल्य से) और प्रोटीन के समग्र परिवर्तन-धातु आयन परिसरों प्रभारी (अपने हस्ताक्षर द्वारा) । आदेश में एक महत्वपूर्ण बातचीत और एक संयोग बदलाव के बीच अंतर करने के लिए, α = ०.०५ के लिए विश्वास अंतराल के रूप में अच्छी तरह से गणना कर रहे हैं । मामलों में जहां विश्वास अंतराल शूंय रेखा के साथ संप्रदाय नहीं है, बातचीत के रूप में महत्वपूर्ण माना जाता है । अगर चोटी के 10 electropherograms से कम 6 में मौजूद था परिणाम ध्यान में रखा जाता है । चोटी 6 ५०० µ एम सह2 +के साथ किसी भी रन में मौजूद नहीं था । प्रत्येक AtHIRD11 चोटी के लिए बातचीत की पूरी सूची Nachbar एट अल द्वारा एक पहले काम में प्रकाशित हुआ है । 4.
ΔR/rf माइग्रेशन समय अनुपात का उपयोग कर परिकलित है ri (ligand की उपस्थिति में) और माइग्रेशन समय अनुपात rf (ligand के अभाव में):
आरi और आरएफ के प्रोटीन नमूना चोटियों और EOF-मार्कर टीEOF के लिए इसी चोटी के शीर्ष समय के लिए चोटी शीर्ष टाइंस टीप्रोटीन का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं:
के लिए आरमैं, ligand की उपस्थिति में बार उपयोग किया जाता है और आरएफके लिए, अनुपस्थिति में टाइंस ।
चित्रा 1 : जेल बफर में AtHIRD11 नमूना के CGE जुदाई के लिए Electropherogram । चोटी 1 और इसके बाईं तरफ चोटियों भी एक नमूना इंजेक्शन के बिना देखा जा सकता है, तो वे कलाकृतियों हैं । के बाद से जनता और पीक 2 और 3 के समग्र शिखर क्षेत्रों 4 चोटी की तुलना में छोटे हैं, वे इस तरह के क्षरण उत्पादों के रूप में होने की संभावना अशुद्धियों, कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : Electropherogram का EOF-मार्कर acetanilide चला । यह आंकड़ा किसी भी धातु आयनों और एसडीएस जेल बफर बिना यौगिक के लिए केवल 1 चोटी से पता चलता है । पीक टॉप का समय electroosmotic फ्लो को निशाना बनाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : किसी भी धातु आयनों के अभाव में एक जटिल चोटी पैटर्न दिखा इक्का प्रयोगों के दौरान नमूना जुदाई का एक electropherogram के लिए उदाहरण. न्यूनतम 7 चोटियों की पहचान की जा सकती है और प्रोटीन और उसके 2 अशुद्धियों से संबंधित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : जांच धातु आयनों की ओर बाध्यकारी व्यवहार के चित्रमय मूल्यांकन 6 पीक के लिए ५०० µ मीटर की एकाग्रता का उपयोग कर । ΔR/आरएफ के मूल्यों प्रवास समय पारी की तीव्रता पर एक संकेत है और इसलिए धातु आयन बाध्यकारी पर संरचना परिवर्तन की ताकत पर दे । ΔR/आरएफ के हस्ताक्षर अगर जटिल अधिक सकारात्मक या नकारात्मक असीम प्रोटीन की तुलना में आरोप लगाया है इंगित करता है । त्रुटि पट्टियां α = ०.०५ के लिए विश्वास अंतराल इंगित करता है । इसके बाद, वे क्षेत्र जहां सच ΔR/आरf-मूल्य ९५% की निश्चितता के साथ पाया जा सकता है दिखाते हैं । लाल पट्टियां अपर्याप्त डेटा द्वारा प्राप्त किए गए परिकलित परिणामों का संकेत देती है (पीक 6 से कम electropherograms में मौजूद था) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
सभी CE प्रयोगों के लिए, केशिका की तैयारी एक महत्वपूर्ण कदम है । चूंकि यह एक छोटे व्यास के साथ एक ग्लास ट्यूब है, यह आसानी से धब्बे जहां कोटिंग हटा दिया जाता है जब यह संभाला जा रहा है पर टूट सकता है । उपकरण में केशिका की स्थापना बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए ।
इक्का विधि का उपयोग करने में शामिल महत्वपूर्ण कदम मुख्य रूप से प्रयोगात्मक सेटअप से संबंधित है । एक और महत्वपूर्ण कदम सही नमूना इंजेक्शन मापदंडों लग रहा है । नमूने की इंजेक्शन राशि उच्च चोटियों के लिए पर्याप्त होना चाहिए । हालांकि, ओवरलोडिंग यह अतिव्यापी चोटियों के साथ एक खराब हल चोटी पैटर्न में परिणाम होगा । इंजेक्शन मात्रा कम करते समय, यह इंजेक्शन समय के बजाय इंजेक्शन का दबाव कम करने के लिए सिफारिश की है क्योंकि यह उपकरण क्रमादेशित इंजेक्शन दबाव तक पहुँचने के लिए कुछ समय लगता है.
असामान्य रूप से व्यापक चोटियों अलग प्रोटीन नमूनों के लिए पाया जा सकता है । इस पैटर्न वोल्टेज में वृद्धि से प्रभावित किया जा सकता है । नतीजतन चोटियों का संकरा हो जाता है और जुदाई का समय कम हो जाता है । फिर भी, कम जुदाई समय नहीं हल चोटियों में परिणाम कर सकते हैं और उच्च वोल्टेज जूल हीटिंग बढ़ जाती है और electrophoretic फैलाव7,8द्वारा संकीर्ण चोटियों के प्रभाव को सीमित करता है । इसलिए, सही शर्तों प्रत्येक नए प्रोटीन की जांच के लिए निर्धारित किया जाना है ।
संयोजन CGE और इक्का एक प्रोटीन के आंतरिक रूप से परिक्रमित चरित्र के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए और उसके बाध्यकारी व्यवहार एक उपंयास दृष्टिकोण है । जेल ट्रो द्वारा नमूने के लक्षण वर्णन एक आवश्यक कदम है कि किसी भी कई चोटियों मनाया अशुद्धियों से संबंधित नहीं हैं साबित करने के लिए है । CGE का लाभ संभावना यह स्वचालित करने के लिए है, कम तैयारी समय, और एक उच्च शास्त्रीय जेल ट्रो9की तुलना में संकल्प । IDP बाध्यकारी प्रयोगों के लिए ऐस का उपयोग अंय परख के प्रति अपनी श्रेष्ठता दिखाता है (जैसे, परिणाम में स्थिर धातु संबध क्रोमैटोग्राफी) ऐस के बाद से न केवल बाध्यकारी घटनाओं से पता चलता है । इसके अलावा, यह एक प्रोटीन के विभिंन क्षेऽ अलग और विभिंन संरचनाओं के बाध्यकारी लाइगैंडों में मतभेद प्रकट कर सकते हैं । बाइंडिंग प्रयोग के दौरान किसी पृथक्करण के बिना विधियों द्वारा इस व्यवहार का पता लगाया जा सकता । इसके अलावा, विश्लेषण समय केवल 6 मिनट है; इसलिए, परिणाम10समय की एक छोटी राशि में परिकलित किया जा सकता है । दूसरी ओर, तेजी से विश्लेषण बंधन साइटों की संख्या11का आकलन करने में सीमाओं के साथ आता है ।
इस दृष्टिकोण के भविष्य के लिए संभावना में निहित है प्रोटीन के लिए संभावित बाध्यकारी भागीदारों स्क्रीन, विशेष रूप से IDPs, एक तेजी से तरीके से । यह एक नमूना में उपस्थित विभिन्न क्षेऽ के विभिन्न बाध्यकारी व्यवहार का एक त्वरित अवलोकन देता है । नमूना लक्षण वर्णन के लिए एक आकार पर निर्भर जुदाई (जैसे, CGE) के उपयोग के बाद से इक्का ही दोष और प्रोटीन ही के बीच भेद नहीं कर सकते अनिवार्य है । हालांकि, CGE अलग प्रजातियों के आकार की संख्या के बारे में एक विचार देता है । एक बाध्यकारी परख के रूप में इक्का के आवेदन पहले से ही धातु आयन लाइगैंडों से किसी भी आरोप लगाया ligand12से बढ़ा दिया गया है । इसलिए, यह किसी भी विशेषता बंधन को बातचीत के बारे में अतिरिक्त जानकारी जोड़ सकते हैं, जुदाई के संयोजन के बाद से और एक विधि में बाध्यकारी परख अलग अनुरूपता के किसी भी बदल बाध्यकारी व्यवहार का सबूत दे सकते है और posttranslational संशोधनों, क्रमशः ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम आभारी धंयवाद Masakuza हारा (ग्रीन विज्ञान और प्रौद्योगिकी के अनुसंधान संस्थान, Shizuoka विश्वविद्यालय, जापान) AtHIRD11 प्रोटीन नमूने प्रदान करने के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | - | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
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