Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Published: August 22, 2018 doi: 10.3791/57749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Summary

Bu iletişim kuralı bir protein örnek karakterizasyonu benzeşme kapiler Elektroforez tarafından kapiller Jel Elektroforez ve hızlı bağlama tarama için şarj edilmiş ligandlar birleştirir. Bu proteinler gibi özünde düzensiz proteinler, esnek bir yapı için bağlama farklı conformers için tüm farklılıkları belirlemek için önerilir.

Abstract

Bitkiler kuvvetle çalışma ortamlarına bağlıdır. Stresli değişiklikleri (Örneğin, kuraklık ve yüksek tuzluluk) düzenlemek için sınıflar proteinlerin oksidatif ve ozmotik stresi azaltmak için özünde düzensiz (YDK) daha yüksek bitkiler gelişmeye. Bu makalede kapiller jel elektroforez (CGE) ve hareketlilik shift benzeşme Elektroforez (ACE) bir arada IDP AtHIRD11 farklı conformers Arabidopsis thalianaüzerinden bağlama davranışını tanımlamak için kullanılmaktadır. CGE AtHIRD11 saflığı onaylamak ve parçaları, ardından değişiklikleri ve diğer kirleri nedenlerden dolayı karmaşık tepe desen olarak dışlamak için kullanılır. Deneme bu bölümünde, farklı örnek bileşenleri viskoz bir jel bir kılcal damar içinde onların farklı kitleler tarafından ayrılmış ve bir diyot dizi bulmak ile tespit. Daha sonra örnek çeşitli metal iyonları doğru bağlama davranışını ACE tarafından araştırıldı. Bu durumda, ligand arabellek çözüme eklenir ve geçiş süresi vardiyada bağlama olay ya da değil oluşup oluşmadığını belirlemek için ölçülür. Jel Elektroforez ve bağlama tahlil otomatikleştirme imkanı CGE ve ACE kombinasyonu bir IDP bağlama davranışını belirlemek için kullanmanın yararları biridir. Ayrıca, bir alt sınırından algılama klasik jel elektroforez CGE gösterir ve ACE hızlı bir şekilde bir ligand bağlayıcı şekilde belirlemek yapabiliyor. Buna ek olarak, ACE metal iyonları daha şarj edilmiş diğer türler için de uygulanabilir. Ancak, deneyler bağlama için bu yöntemin kullanılması bağlama sitesi sayısını belirledikten yeteneği sınırlıdır. Yine de, CGE ve ACE kombinasyonu herhangi bir protein örnek çok sayıda şarj edilmiş ligandlar doğru bağlama davranışını karakterize için adapte edilebilir.

Introduction

Bitkiler daha birçok diğer yaşam formları daha çalışma ortamlarına bağlıdır. Bitkiler başka yerlere hareket edemez beri onlar çevreleri (Örneğin, kuraklık, soğuk ve yüksek tuz konsantrasyonu) değişiklikleri ayarlamak zorunda. Sonuç olarak, yüksek bitkiler özel stres proteinler için yüksek tuzluluk ilgili hücre stres azaltmak için manifold görevleri yerine getirmek dehydrins gibi geliştirilmiştir. Bu proteinler su ve iyonları hücrelerin içinde bind, Cu2 +bağlayarak oksidatif stresi azaltmak-iyonları ve fosfolipitler yanı sıra cytoskeletons ile etkileşim. Ayrıca, Zn2 +bağlama-iyonları transkripsiyon faktörleri hareket etmek bu proteinler sağlar. CA2 +şekilde bağlanabilemeleridir-fosforilasyon da kaldıktan sonra iyonları1bildirdi.

Bu proteinler çok fonksiyonlu davranışını hidrofobik amino asitlerin yokluğu ilgilidir. Sonuç olarak, onlar peptid zinciri ve kısıtlanmış bir yapı içinde hidrofobik etkileşimler eksikliği. Bu proteinler kısıtlayıcı bir yapı eksikliği nedeniyle, ancak, aynı koşullarda farklı conformers kaplayabilir. Bu nedenle, onlar en iyi bir yapılar topluluğu yerine tek bir biçimi olarak tanımlanabilir. Özünde proteinler (YDK) düzensiz ve stres proteinler ve ökaryotik hücreler2farklı yolları arasında çapraz karışma için yaygın olarak kullanılan bir kavram olarak proteinler bu özellikleri ile bilinir.

Bu stres kaynaklı YDK biridir AtHIRD11. Arabidopsis thaliana' ın en son derece kuraklık ifade etmektedir biridir. Bu nedenle, farklı conformers oranı şarj etmek için etkili onların RADIUS tarafından ayrılmış olabilir ve kapiller Elektroforez (CE) daha ileri araştırmalar için kullanılan. Önceki ACE deneyler göstermiştir AtHIRD11 ve Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +ve Ni2 +gibi geçiş metal iyonları arasındaki etkileşimler-iyonları. Mufassal-den sonuçlanmak-ebilmek bulunmak içinde Hara vd. 3 ve Nachbar vd. 4.

Burada kullanılacak ACE yöntemi üzerinde bizim daha önce yayımlanmış eserler6temel alır. Ancak, protein örnek için EOF işaret acetanilide eklenmesi uygun değildir. AtHIRD11 geniş tepe desen gösterir ve örnek için EOF marker ekleme iki doruklarına gizlemek. Bu nedenle, işaretçiyi ayrı bir vadede kullanılır. Bağlama davranışı inceledi önce önceki deneyler sırasında bulunan tepeler farklı conformers olduğunu doğruladı. Bu nedenle CGE protein conformers arasında ayırt etmek için kullanılır, translasyon protein ve onların farklı kitleler tarafından AtHIRD11, parçaları gibi yabancı maddelerin değiştirilme tarihi. Daha sonra çeşitli farklı metal iyonları karşı karakterize AtHIRD11 örneği'nın bağlama davranış araştırıldı.

Bu makalenin amacı, farklı conformers bağlama davranış farklılıkları değerlendirmek için bir IDP ve diğer bileşenleri örneği arasında ayırt etmek için deneysel bir kurulum tarif etmektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması kapiler Elektroforez cihazları

  1. Kılcal hazırlamak
    1. Bir cam kesici çıplak erimiş silis (için CGE deney) 33 cm ve 30 cm (ACE deneme için) uzun kılcal kapiller polimid dış kaplama ve bir iç çapı 50 µm ile kesmek için kullanın. Kesme cam tabak içinde gerçekleştirin.
      Not: 2 farklı deneysel kurulumları için 2 farklı aygıtlar geliştirilmiştir. Onları diğer aletleri üzerinde kullanmak için uygun yöntemi transfer yapılması gerekiyor ve kılcal damar uzunluğu aracı izin verilen uzunluğu için ayarlanması gerekir.
    2. Kılcal CGE deneme için bir ucunu 24.5 cm uzaklıkta ve ACE deneme (etkin uzunluğu) için kılcal bir ucundan 21,5 cm 1 cm geniş algılama pencerenin ortasında işaretlemek için bir kalem kullanın.
    3. Polimid dış yüzey kılcal bir alev lambasına 0.5 cm önce ve sonra işareti ile uzakta yanan çıkarın. Benzer şekilde, kaynak makinesini 1 cm mantolama kılcal her iki ucundaki kaldırmak için kullanın.
      Not: Bu kullanılan kapiler Elektroforez araç erişimine beri etkin uzunluğu biraz farklı olabilir.
    4. Biter kılcal ve etanol ve yumuşak bir doku ile algılama pencereler temiz.
      Not: Daha az esnek ve kırmak büyük olasılıkla kaplamasız kılcal damarlar.
  2. Kılcal yüklemek
    1. Bir kılcal çıkış yanında hafiye pencere ile CE sistemine yükleyin.
      Not: Farklı tutma sistemleri, kılcal damarlar için çeşitli CE araç modelleri var. Kesin talimatlar için kullanılan alet el kitabına bakın.

2. çözümleri hazırlayın

  1. Çözümler CGE analiz için hazırlamak
    1. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) hazırlamak-SDS arabellek (100 mM/1% w/v) pH 8.0.
      1. Solunum maskesi ve bir kabin Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) 100 mL ölçek 1.00 g ağırlığında için kullanın.
      2. Tris 1,21 g 100 mL kabı içine ekleyin ve 50 mL deiyonize su ve bir manyetik heyecan bar üzerinde bir manyetik karıştırıcı kullanarak geçiyoruz.
      3. PH elektrodu çözümde koymak ve 1.0 M HCl kullanarak 8,0 pH ayarlayın.
      4. Çözüm 100 mL volumetric flask doldurun ve işareti kadar deiyonize su ekleyin. Yavaşça herhangi bir köpük şekillendirme önlemek için salla.
    2. 0.1 M NaOH çözüm hazırlamak.
      1. 100 mL volumetric flask NaOH 4.0 g ağırlığında. Deiyonize su ile 1 M stok yapmak işareti kadar doldurun.
      2. Bu çözüm 10 mL başka bir 100 mL volumetric flask aktarıp işareti kadar deiyonize su ile doldurun bir 10 mL ampul pipet kullanın.
    3. 0.1 M HCl çözüm hazırlamak.
      1. 10 M HCL 10 mL 10 mL hacimsel pipet kullanarak 100 mL volumetric flask koymak ve mark kadar deiyonize su ile doldurun. 0,1 M HCl elde etmek için bu adımı yineleyin.
    4. Örnek çözüm hazırlamak.
      1. 0.5 mg protein 1 mL tüp içine tartın. Bir micropipette ile 2.1.1. adımdaki Tris-SDS jel arabelleği 0.5 mL ekleyin.
      2. Protein herhangi bir köpük şekillendirme ve protein yıkımı önlemek için hafifçe sallayarak geçiyoruz.
        Not: protein açıklandığı gibi çözünmüş olamaz ultrasonication kullanın; çözümün herhangi bir Isıtma kaçının.
    5. Çözümler şişeleri doldurun.
      1. Her çözüm konusunda bir 0,22 µm polivinilidin florid (PVDF) filtre doğrudan şişeyi yeterli bir Ģırınga kullanarak filtre.
        Not: jel içeren çözümler için geri dönüş basıncı yüksek viskozite nedeniyle yüksek olabilir.
      2. Toplam 15 tüpleri hazırlayın ve her herhangi bir karışmalarının önlemek için işaretleyin.
        1. Piyasada bulunan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) jel arabelleği pH 8 ile 3 şişeleri doldurun.
          Not: Ticari olarak mevcut SDS jel arabellek kullanımını daha kesin sonuçlar sağlar.
        2. 1 şişe yıkama için 0.1 M NaOH ve 0.1 M HCl ile 1 flakon ile doldurun.
        3. 1 şişe örnek çözümü ile doldurun.
        4. Deiyonize su ve 0.1 mL deiyonize su (şişeleri daldırma) ile 4 şişeleri ile 5 şişeleri doldurun.
          Not: Daldırma şişeleri atık şişeleri her çalışma önce kılcal kızarma sırasında kullanılır. Kılcal uçlarına su herhangi bir jel artıkları durulama için daldırma.
  2. ACE analiz için çözümler hazırlamak
    1. 1 M NaOH çözüm hazırlamak.
      1. 100 mL volumetric flask NaOH 4.0 g ağırlığında.
      2. Deiyonize su ile 1 M stok yapmak işareti kadar doldurun.
    2. Bir 0.1 M NaOH çözümde 0.1 M ethylendiaminetetraacetic asit (EDTA) hazırlayın.
      1. 10 mL 10 mL ampul pipet kullanarak 100 mL volumetric flask 0.1 M NaOH aktarın. Mark kadar deiyonize su ile doldurun.
      2. EDTA tartı bir teknede 2.42 g tartmak ve 100 ml 0.1 M NaOH katı bileşik geçiyoruz.
    3. Tris arabellek (30 mM) çözüm hazırlamak.
      1. 3.63 g Tris, 200 mL deiyonize su ve bir heyecan bar bir 500 mL kabı ekleyin. Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin ve açın.
      2. Bir pH metre elektrot kabı içinde koymak ve pH 7.4 0.1 M HCl kullanarak için ayarlayın.
      3. Çözüm 1 L volumetric flask ve dolgu işareti kadar deiyonize su ile doldurun.
        Not: Bu yordam düzenli olarak yapılmasını planlamıştı vardır veya daha--dan 1 L bütün analizi için gereklidir bu yana büyük volumetric flask gereklidir.
    4. Acetanilide electroosmotic akışı (EOF) hazırlamak-marker (60 µM) çözüm.
      1. 6 mg acetanilide ve Tris arabelleği 100 mL 100 mL volumetric flask ekleyin.
      2. Volumetric flask ultrasonik banyoda koymak ve 30 dk için açın.
    5. Örnek (1 mg/mL) çözüm hazırlamak.
      1. 0.5 mL microcentrifuge tüp bir hassas denge üzerinde koymak ve dondurularak AtHIRD11 tozu 0.3 mg tüpün içine ekleyin.
      2. Bir micropipette bir 30 mM Tris arabellek (pH 7,4) 0.3 mL tüp eklemek için kullanın. Dikkatle protein çözülmeye tüp sallamak.
    6. Ligand çözümleri hazırlayın.
      1. CaCl2 (5 mM) hisse senedi çözüm hazırlamak.
        1. Tartı bir tekne almak, bir analitik dengesi üzerinde koymak ve CaCl236.76 mg tartmak * H2O.
        2. Bir micropipette kullanarak floş CaCl2* üzerinden ağırlığında H2O tekne içine önceden hazırlanmış Tris arabelleği ile 50 mL volumetric flask.
        3. Volumetric flask Tris arabelleği kadar işareti ile doldurun.
      2. Kalan stok çözümleri (5 mM) hazırlayın.
        1. Adımı yineleyin 2.2.6.1 kullanarak diğer metal tuzları CaCl2yerine * H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (NO3)2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, SeCl4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2O: 41.47 mg, CuCl2* 2 H2O: 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg ve NiCl2* 6 H2O: 59.43 mg].
          Not: Bir konsantrasyonu 0.5 mm ZnCl2 çözüm vardır. İyonları ve iç kapiller duvarı arasındaki güçlü etkileşimler gözlenmiştir beri konsantrasyonu 10 katına düşürüldü4.
      3. 500 µM CaCl2 çözüm hazırlamak.
        1. 10 mL CaCl2 stok çözeltisi doldurun ve 100 mL volumetric flask koydu.
        2. Tris arabelleği işareti ile hacimsel şişeye doldurun ve şişeye sallamak.
      4. 250 µM CaCl2 çözüm hazırlamak.
        1. 5 mL CaCl2 stok çözeltisi doldurun ve 100 mL volumetric flask koydu.
        2. Tris arabelleği işareti ile hacimsel şişeye doldurun ve şişeye sallamak.
      5. Adım 2.2.6.3 ve 2.2.6.4 diğer hisse senedi çözümleri için yineleyin.
    7. Şişeleri çözümlerinde doldurun.
      Not: Giriş ve çıkış şişeleri bir dizi yinelenen her çalışma ihtiyacı var. Giriş ve çıkış taze ligand Solutions'da kullanımını geçiş zaman her çalıştırdıktan sonra nöbetleşe azaltır.
      1. Bir 10 mL şırınga 250 µM CaCl2 çözümde doldurun.
      2. 0,22 µm PVDF filtre filtre uygulanmış bu çözüm atmak için şırınga kullanarak filtre şırınga ve itme çözüm 2 mL koymak.
      3. Maksimum izin verilen ses kadar 10 şişeleri kalan 250 µM CaCl2 çözüm şırınga ile doldurun. Her 250 µM CaCl 2 çözüm giriş flakonolarak işaretleyin.
      4. 250 µM CaCl2 çözüm ile yarı dolu olana 10 şişeleri doldurun. Her 250 µM CaCl 2 çözüm çıkış flakonolarak işaretleyin.
      5. 2.2.7.1 - 2.2.7.4 diğer metal tuz içeren çözümü için yineleyin.
      6. Giriş ve çıkış şişeleri 30 mM Tris arabellek (pH 7,4) çözüm yerine kullanarak her çifti arasındaki adımları tekrarlayın.
        Not: 30 mmol/L Tris tampon pH 7.4 ishal arasında geçiş zaman verilerini protein için metal iyonları, yokluğunda elde etmek için kullanılır. EOF değişimler ihmal için gereklidir.
      7. Bunun yerine acetanilide EOF-marker (60 µM) çözüm kullanarak bir şişe için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Ayrıca, örnek (1 mg/mL) çözüm yerine kullanarak bu adımları yineleyin.

3. kılcal jel elektroforetik ayrımı

Not: önceki çalışmalarında Nachbar vd tarafından açıklanan yöntemine göre ayırma hazırlamak 4.

  1. Analize hazırlamak
    1. Koşul kılcal
      1. Termostat 23 ° C'ye ayarla
      2. Kılcal 0.1 M NaOH ile 2.5 barda 10 dakika yıkayın.
      3. 0,1 M HCl ile 2.0 barda 5 min için kılcal floş.
      4. Deiyonize su ile 2.0 barda 2 min için kılcal floş.
    2. SDS jel arabellekte doldurun
      1. Bir kılcal 2.0 barında 10 min için piyasada bulunan SDS jel tampon pH 8.0 ile doldurun.
    3. Her ayrılık çalışması önce kılcal sifonu
      1. Kılcal 0.1 M NaOH ile 4.0 barda 3 dakika yıkayın.
      2. 0,1 M HCl ile 4.0 barda 1 dk. için kılcal floş.
      3. Deiyonize su ile 4.0 barda 1 dk. için kılcal floş.
      4. Kılcal SDS jel arabellek ile 4.0 barda 10 dakika yıkayın.
  2. Ayırma çalıştırmak
    1. Örnek çözüm CGE deneyler (adım 2.1.4) için hydrodynamically giriş, 4 dk için 0.1 bar uygulayarak enjekte et.
    2. -16.5 uygulamak kV ve kılcal 25 min için her iki ucundaki 2,0 bar basınç.

4. benzeşme kapiler elektroforetik Analizi

Not: önceki eserlerinde Nachbar vd tarafından açıklanan yöntemine göre ayırma hazırlamak 4 ve Alhazmi vd. 5.

  1. Koşul kılcal
    1. Termostat 23 ° C'ye ayarla
      Not: Sıcaklık göre yayımlanmış protokolleri kullanılır ve diğer sıcaklıklar4,5olarak değiştirilebilir. Ancak, etkileşimleri üzerinde sıcaklık bağımlıdır ve uygun şekilde değiştirir.
    2. Bir kılcal 0.1 M NaOH ile 2.5 barda 40 dakika yıkayın.
    3. Kılcal deiyonize su ile 1.0 barda 10 dakika yıkayın.
    4. 30 dk 30 mM Tris arabelleği (pH 7,4) ile 1.0 barda kılcal floş.
  2. ACE yöntemleri için hazırlık
    1. Yöntemi ligandlar olmadan ölçümler için hazırlayın.
      Not: 2 protein doruklarına kılık değiştirerek gibi Acetanilide örnek çözüm eklenmedi.
      1. 1 dk. için kılcal bir 0.1 M EDTA çözüm ile 2.5 barda durulayın.
      2. 1 dk. için kılcal 2.5 Bar deiyonize su ile durulayın.
      3. Tris arabelleği için denge ile 2.5 Bar kılcal 1,5 dakika yıkayın.
      4. 6 s 0,05 bar ve değişim giriş ve çıkış şişeleri Tris tampon tüpleri için acetanilide üçün enjekte.
      5. 2.4 için 0,05 bar uygulamak acetanilide çözüm kapiller daha fazla iç ucundan itmek için s.
      6. 10.0 uygulamak için 6 dk kV ve bir dalga boyu 200 acetanilide zirvesinde tespit nm.
      7. 4.2.1.1 adımları yineleyin. -4.2.1.6. protein kullanarak acetanilide çözüm yerine örnek ve tüm protein doruklarına algılamak.
    2. Yöntemi ölçümleri ile ligandlar için hazırlayın.
      1. 1 dk. için kılcal bir 0.1 M EDTA çözüm ile 2.5 barda durulayın.
      2. 1 dk. için kılcal 2.5 Bar deiyonize su ile durulayın.
      3. Denge için ligand çözüm ile 2.5 Bar kılcal 1,5 dakika yıkayın.
      4. 6 s 0,05 bar ve değişim giriş ve çıkış şişeleri ligand içeren tampon tüpleri için acetanilide üçün enjekte.
      5. 2.4 için 0,05 bar uygulamak acetanilide çözüm kapiller daha fazla iç ucundan itmek için s.
      6. 10.0 uygulamak için 6 dk kV ve bir dalga boyu 200 acetanilide zirvesinde tespit nm.
      7. Adımları 4.2.2.1 - protein örnek acetanilide çözüm yerine kullanarak 4.2.2.6 yineleyin ve protein doruklarına algılamak.
    3. Alternatif olarak şarj-boyut oranları ( Temsilcisi sonuçlarıaltında açıklanan) çeşitli protein-metal iyon etkileşimleri için değişikliği hesaplamak için 4.2.1 ve 4.2.2 adımları yineleyin.
      1. Protein çözüm her 60 h sonra yeni bir değiştirin.
        Not: Bu noktada, deneme duraklatılmış. Bu yordam en az tekrarlanan 10 olduğunu x ligandlar tepeli deseni biraz koş koş değişir bu yana her konsantrasyon için. Çözüm 60 h daha uzun süre kullanılırsa, varyasyonlar çok büyük hale.
    4. Yöntemleri çalışacak
      1. Alkali toprak ligand çözümleri (CaCl2, MgCl2, BaCl2ve SrCl2 çözümleri) kullanarak adım 4.2.2, altında açıklanan yöntemini çalıştırın.
      2. MnCl2, SeCl4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2ve NiCl2 çözümleri alkali toprak ligand çözümleri yerine kullanarak adım 4.2.2, altında açıklanan yöntemi kullanarak devam.
        Not: İkinci geçiş metal klorürleri kılcal ile daha güçlü etkileşim gösterdi ve tamamen kaldırılamaz. Bu etkileşimler sonucunda geçiş zamanında koş koş kaydırır. Sonuç olarak, onlar sonra diğer metal iyonları araştırıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 CGE deneyler sırasında elde edilen AtHIRD11 örnek için electropherogram gösterir. Peptid boyutu soldan sağa doğru artar. En yüksek sayı 4 en büyük kitle var ve bozulmamış protein gösterir. Daha küçük tepeler 2 ve 3 küçük yabancı maddelerin (Örneğin, bozulma ürünleri) temsil eder. Ayrıca ilk zirve ve tutarsızlık daha önce temellerin protein örnek çoğaltılamaz. Bu nedenle, SDS için ilgilidir kendisini jel ve herhangi bir örnek ile ilişkili kirleri temsil etmiyor.

Şekil 2 electropherogram acetanilide için ACE deneyler sırasında temsil eder. Hiçbir yabancı maddelerin olmalıdır beri acetanilide çözüm sadece 1 yüksek tepe gösterir. Maksimum peak algılama süre electroosmotic akışı (tEOF) geçiş süresini gösterir ve etkileşim hesaplanması için kullanılır.

Şekil 3 AtHIRD11 örnek electropherogram yokluğunda SDS ve metal iyonları, ACE deney bulunuyor. Yanı sıra CGE electropherogram 2 kirleri gösterir protein için ilgili en az 5 tepeler. Küçük ya da son derece pozitif yüklü oldukları kendi geçiş kez belirtmek bu yana en yüksek 1 ve 2 için kirleri atanabilir. Bu varsayım pik yüksekliği ve alan artış zaman içinde tarafından desteklenmektedir. AtHIRD11 doruklarına 3 ve 4 EOF yakın olduğundan, onlar çok az ücret uygulanır ve her vadede ayrı tutulamaz. Onlar neredeyse hiçbir etkileşimleri göster ve biçimler olmadan erişilebilir artıkları metal iyonları ile etkileşimleri için gerekli temsil eder. AtHIRD11 birkaç farklı ücret-için-boyutu-oranları nedeniyle farklı conformers farklı etkili yarıçaplarını gösterir. Bu conformers sürekli olarak birleştirebilirsiniz. Daha sonra zirveleri 5-7 her zamanki protein zirveleri geniş. Geniş doruklarına etkileşimleri kinetik üzerinde bir ipucu ver. Tepeler dar olmadığı için hızlı ve çok yavaş bir dönüşüm arasında farklı conformers bırakılabilir. Her iki durumda da, zirveleri4temel ayrılmış olur. Bu durumda, bir ön denge adım tepeli deseni değiştirebilirsiniz ve daha yavaş kinetik ile etkileşimleri içine daha iyi bir fikir verecek.

Şekil 4 en yüksek 6 için çeşitli metal iyonlarının varlığında grafik değerlendirme ölçülen geçiş zaman vardiya gösterir. Hesaplanan değeri ΔR/Rftarafından temsil edilir. Bu değer ne kadar güçlü bir shift (değeri tarafından) ve protein-metal iyon kompleksleri ücret (tarafından işareti) genel değişiklik gösterir. Önemli bir etkileşim ve tesadüfi bir kaydırma, α güven aralıkları arasında ayırt etmek için = 0.05 de hesaplanır. Nerede güven aralığı sıfır hattı ile kesişen değil durumda, etkileşim olarak anlamlı olarak kabul edilir. En az 6 10 electropherograms dışında en üst nokta varsa sonuçları dikkate alınır. En yüksek 6 ile 500 µM Co2 +herhangi bir vadede mevcut değildi. Her AtHIRD11 zirve için etkileşimler tam listesi, önceki bir eser Nachbar vd tarafından yayınlandı 4.

ΔR/Rf geçiş zaman oranları Rben (huzurunda ligand) ve geçiş zaman oranlarının Rf (ligand yokluğu) kullanılarak hesaplanır:

Equation 1

Ben R ve Rf en yüksek en iyi kez tprotein protein örnek tepeler ve karşılık gelen en yüksek en iyi zaman için için EOF işaretleyici kullanarak hesaplanır tEOF:

Equation 2

Rbeniçin ligand varlığında yokluğunda kez kullanılan ve Rfiçin zamanlardır.

Figure 1
Resim 1 : Electropherogram AtHIRD11 örnek jel arabelleği CGE ayrılması için. Böylece onlar eserler en yüksek 1 ve onun sol doruklarına bile örnek enjeksiyon görülebilmektedir. Kitleler ve genel beri tepe 2 ve 3 alanlarında en yüksek tepe 4 küçük, bozulma ürünleri gibi büyük olasılıkla yabancı maddeleri vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Çalıştırmak EOF-marker acetanilide Electropherogram. Şekil bileşiği herhangi bir metal iyonları ve SDS jel arabellek olmadan sadece 1 pik gösterir. Tepe üstündeki zaman electroosmotic akışı işaretler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Örnek bir electropherogram için örnek ayrılık karmaşık tepeli deseni herhangi bir metal iyonları yokluğunda gösterilen ACE deneyler sırasında. En az 7 doruklarına tespit ve protein ve onun 2 yabancı maddeleri ile ilgili. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Grafiksel incelenen metal iyonları konsantrasyonu 500 µM zirve için 6 kullanarak karşı bağlama davranış değerlendirilmesi. ΔRdeğerler /Rf vermek bir ipucu geçiş zaman kaydırma yoğunluğuna ve bu nedenle metal iyon bağlama konformasyon değişiklikleri gücüne. ΔRiz /Rf gösterir karmaşık daha olumlu veya olumsuz yönde ilişkisiz protein ile karşılaştırıldığında ücret uygulanır eğer. Hata Çubuklarõn güven aralıkları için α = 0,05. Daha sonra alanı göster nerede gerçek ΔR/Rf-değeri % 95'i bir kesinlik ile bulunabilir. Kırmızı çubuklar (en az 6 electropherograms mevcut) yeterli veri elde edilen hesaplanan sonuçları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tüm CE deneyler için kılcal hazırlanması kritik bir adımdır. O küçük çaplı bir cam tüp olduğundan, onu kolayca ele alınması nerede kaplama kaldırılır spotları kırabilir. Kılcal yüklemesine araç çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

ACE yöntemi esas olarak kullanmakla ilgili önemli adımlar için deneysel Kur ilgilidir. Başka bir önemli adım doğru örnek ekleme parametreleri bulgudur. Örnek enjekte miktarı yüksek tepeler için yeterli olmalı. Ancak, bu aşırı yükleme, zirveleri çakışan bir kötü çözümlenmiş tepeli deseni neden olacaktır. Ne zaman enjekte hacmi azalan, programlanmış enjeksiyon basıncı ulaşmak araç için biraz zaman alır bu yana enjeksiyon zaman yerine enjeksiyon basıncı azaltmak için önerilir.

Alışılmışın dışında geniş doruklarına farklı protein örnekleri için bulunabilir. Bu desen gerilim artırarak etkilenebilir. Sonuç olarak, zirveleri daha dar olsun ve ayrılık süresi azalır. Yine de daha kısa ayrılık zamanı değil karar vermek Peaks'e neden olabilir ve yüksek gerilim Isıtma Joule artırır ve elektroforetik dağılım7,8tarafından dar doruklarına etkisini sınırlar. Bu nedenle, uygun koşullar için her yeni protein muayene belirlenmesi gerekir.

CGE ve ACE bir protein ve bağlama davranışının özünde düzensiz karakteri hakkında bilgi toplamak için birleştirerek yeni bir yaklaşımdır. Jel Elektroforez tarafından örnek karakterizasyonu gözlenen herhangi bir birden fazla tepeler için kirleri ilgili değildir kanıtlamak için gerekli bir adımdır. CGE olasılığı, daha kısa hazırlık süresi ve klasik jel elektroforez9' a kıyasla daha yüksek bir çözünürlük otomatikleştirmek için avantajdır. ACE için deneyler gösterir bağlama IDP yapımların (Örneğin, immobilize metal benzeşme Kromatografi sonuçlarında) diğer deneyleri doğru ACE beri sadece kullanarak bağlama olayları gösterir. Ayrıca, farklı conformers bir protein ayırır ve bağlama ligandlar farklı conformers, farklılıkları ortaya çıkarabilir. Bu davranış bir ayrılık bağlama deney sırasında yöntemlerine tarafından tespit edilemez. Buna ek olarak, sadece 6 dakika analiz zamanı; Bu nedenle, sonuçları saat10kısa bir miktarda hesaplanabilir. Öte yandan, hızlı analiz siteleri11bağlama sayısını tahmin etmek içinde sınırlamalarla birlikte gelir.

Bu yaklaşım geleceği olasılığını ekran olası bağlama ortaklarına proteinler, özellikle YDK, için hızlı bir şekilde yatıyor. Çeşitli conformers bir örnek mevcut farklı bağlama davranışını hızlı bir bakış sağlar. ACE kendisi kirleri ve protein kendisini ayırt edemez beri örnek karakterizasyonu için bir boyut bağımlı ayrılık (Örneğin, CGE) kullanılması zorunludur. Ancak, CGE farklı boyutta türlerinin sayısı hakkında bir fikir verir. ACE uygulama olarak bir bağlama tahlil için herhangi bir ücret ligand12metal iyon ligandlar zaten genişletildi. Bu nedenle, herhangi bir ile karakterize, ayrılık kombinasyonu beri bağlama etkileşimleri hakkında daha fazla bilgi ekleyebilirsiniz ve bağlama assay bir yöntem olarak farklı conformers herhangi bir değişmiş bağlama davranışını kanıtı verebilir ve ardından değişiklikler, anılan sıraya göre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz minnettar Masakuza Hara (Araştırma Enstitüsü yeşil bilim ve teknoloji, üniversite Shizuoka, Japonya) AtHIRD11 protein örnekleri için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AtHIRD11 sample Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) - Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli
Barefused silica capillary Polymicro Technologies (Phoenix, USA) 106815-0017 TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating
Agilent 1600A Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) comercially not available anymore Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead
Agilent 7100 CE Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G7100A Capillary electrophoresis instrument
Injekt 2 mL B. Braun (Melsungen, Germany) 4606051V Syringe for filtration
Rotilabo-syringe filters Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) KY62.1 PVDF membrane filter for solution filtration
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.023 Micro pipette for sample handling
Eppendorf Research plus 10 μL Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) 3121 000.120 Micro pipette for handling the ligand solutions
Bulb pipette 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 08 Preparing theNaOH solution
Bulb pipette 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 338 14 Preparing the ligand solution
Duran glas volumetric flask 25 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1457 Preparing the ligand stock solution
Duran glas volumetric flask 10 mL Duran Group GmbH(Mainz, Germany) 24 671 1054 Preparing the ligand stock solution
Proteome Lab SDS MW Gel Buffer Beckman Coulter (Brea, USA) comercially not available anymore Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 
Acetanilide Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 397229-5G Electroosmotic flow marker
Manganese(II) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 13217 Ligand
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 431788-100G Rinsing ingredient
Bariumchloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 202738-5G Ligand
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 71729-100G Solublizing protein for capillary gel electrophoresis
Nickel(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 654507-5G Ligand
Selenium(IV) chloride Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 323527-10G Ligand
2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) 252859-100G Buffer ingredient
Zinc(II) chloride Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1088160250 Ligand
Strontium nitrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1078720250 Ligand
Calcium chloride dihydrate Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1371015000 Ligand
37% hydrochloric acid Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) 1003171000 Adjusting pH
Copper(II) chloride dihydrate Riedel-de Haën (Seelze, Germany) 31286 Ligand
Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L Allpax (Papenburg, Germany) 10000084;0 Ultrasonic bath
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) G2070-91126 Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hara, M. The multifunctionality of dehydrins: An overview. Plant Signaling & Behavior. 5 (5), 1-6 (2010).
  2. Uversky, V. N. Dancing protein clouds: the strange biology and chaotic physics of intrinsically disordered proteins. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6681-6688 (2016).
  3. Hara, M., et al. Biochemical characterization of the Arabidopsis KS-type dehydrin protein, whose gene expression is constitutively abundant rather than stress dependent. Acta Physiologia Plantarum. 33 (6), 2103-2116 (2011).
  4. Nachbar, M., et al. Metal ion - dehydrin interactions investigated by affinity capillary electrophoresis and computer models. Journal of Plant Physiology. 216, 219-228 (2017).
  5. Alhazmi, H. A., et al. A comprehensive platform to investigate protein-metal ion interactions by affinity capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 311-317 (2015).
  6. Redweik, S., Xu, Y., Wätzig, H. Precise, fast, and flexible determination of protein interactions by affinity capillary electrophoresis: Part 1: Performance. ELECTROPHORESIS. 33 (22), 3316-3322 (2012).
  7. Ghosal, S. Electrokinetic flow and dispersion in capillary electrophoresis. Annual Review of Fluid Mechanics. 38 (1), 309-338 (2006).
  8. Xuan, X., Li, D. Analytical study of Joule heating effects on electrokinetic transportation in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1064 (2), 227-237 (2005).
  9. Oledzka, I. Comparative evaluation of tissue protein separations applying one- dimensional gel electrophoresis and capillary gel electrophoresis. The Open Proteomics Journal. 5 (1), 17-21 (2012).
  10. Alhazmi, H. A., et al. Optimization of affinity capillary electrophoresis for routine investigations of protein-metal ion interactions. Journal of Separation Science. 38 (20), 3629-3637 (2015).
  11. Busch, M. H. A., Carels, L. B., Boelens, H. F. M., Kraak, J. C., Poppe, H. Comparison of five methods for the study of drug-protein binding in affinity capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 777 (2), 311-328 (1997).
  12. Mozafari, M., Balasupramaniam, S., Preu, L., El Deeb, S., Reiter, C. G., Wätzig, H. Using affinity capillary electrophoresis and computational models for binding studies of heparinoids with P-selectin and other proteins. ELECTROPHORESIS. 38 (12), 1560-1571 (2017).

Tags

Biyokimya sayı 138 özünde düzensiz proteinler benzeşim kapiler Elektroforez kapiller Jel Elektroforez bağlama tahlil metal ligandlar dehydrins AtHIRD11
AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M.,… More

Nachbar, M., Maul, J., Stein, M., Wätzig, H. Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis. J. Vis. Exp. (138), e57749, doi:10.3791/57749 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter