यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल अनुभागिंग और counterstaining के लिए विधि. यह एक आसान और त्वरित प्रक्रिया है कि विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति पर नजर रखने के लिए भी ऊतक वर्गों, अंगों या प्रसंस्कृत कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है.
ई कोलाई LacZ जीन, β-galactosidase, मोटे तौर पर जीन अभिव्यक्ति के लिए एक रिपोर्टर के रूप में प्रयोग किया जाता है और कोशिका वंश अध्ययन में एक अनुरेखक के रूप में. शास्त्रीय histochemical प्रतिक्रिया सब्सट्रेट एक्स के hydrolysis पर आधारित है, घाट और लौह आयनों के साथ संयोजन में लड़की है, जो एक अघुलनशील नीले वेग है कि कल्पना करने के लिए आसान है पैदा करता है । इसलिए, β-galactosidase गतिविधि विकास आय के रूप में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल खोदी और counterstaining के लिए बाद में विधि. इसके अतिरिक्त, पूरे भ्रूण स्पष्ट करने के लिए एक प्रक्रिया को बेहतर एक्स-भ्रूण के गहरे क्षेत्रों में लड़की धुंधला कल्पना प्रदान की जाती है । इस कार्यविधि को निष्पादित करने से सुसंगत परिणाम प्राप्त होते हैं, हालांकि पृष्ठभूमि गतिविधि को कम करने के लिए प्रतिक्रिया शर्तों का अनुकूलन आवश्यक है । परख में सीमाएं भी विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पूरे माउंट धुंधला में भ्रूण के आकार के बारे में । हमारा प्रोटोकॉल माउस के विकास के दौरान β-galactosidase डिटेक्शन के लिए एक संवेदनशील और एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है जिसे आगे cryostat वर्गों के साथ-साथ पूरे अंगों पर लागू किया जा सकता है । इस प्रकार, गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विकास में आसानी से पूरे भ्रूण में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन यह भी सेलुलर स्तर पर विस्तृत अभिव्यक्ति तेल खोदी के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है ।
आदेश में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए, मार्करों के रूप में रिपोर्टर जीन का उपयोग Drosophila से स्तनधारियों के लिए सर्वोपरि है । ट्रांसजेनिक और नॉकआउट जानवरों को शामिल प्रयोगों में, बैक्टीरियल β-galactosidase जीन (LacZ) ई कोलाई (ई. कोलाई) में से एक है सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalyzes के hydrolysis में β-galactosides (जैसे लैक्टोज) को अपनी monosaccharides (ग्लूकोज और गैलेक्टोज)5. इसके सबसे अधिक इस्तेमाल किया सब्सट्रेट एक्स-लड़की है (5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), एक ग्लाइकोसाइड है कि β-hydrolyzed दे वृद्धि करने के लिए 5-galactosidase-4-ब्रोमो-3-क्लोरोफ्लूरोकार्बन और hydroxyindole के द्वारा गैलेक्टोज है । पहले एक डिमर में ऑक्सीकरण हो जाता है कि, जब पोटेशियम फेरी के साथ संयुक्त इस्तेमाल किया-और लोह-साइनाइड, एक विशेषता अघुलनशील पैदा करता है, नीला रंग हाला (चित्रा 1)6.
LacZ जीन तीस साल पहले7,8पर एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया जाना शुरू कर दिया । आमतौर पर, LacZ खुले पढ़ने के फ्रेम के स्थान पर एक अंतर्जात प्रमोटर के बहाव डाला है, तो यह बैक्टीरियल और कोशिका संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है एक विशेष डालने वाले कोशिकाओं कल्पना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंतर्जात के एक अनुरेखक के रूप में ट्रांसजेनिक जानवरों में विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न9. इस संबंध में, β-galactosidase गतिविधि के दृश्य बड़े पैमाने पर पूरे ऊतकों के लिए एकल कोशिकाओं से विकास और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए Drosophila में इस्तेमाल किया गया है. Drosophila आनुवंशिकी स्थिर लाइनों में एक संशोधित पी-तत्व रिपोर्टर जीन LacZ युक्त का निर्माण करने के जीनोम में यादृच्छिक स्थानों पर डाला जाता है की पीढ़ी एहसान । इस प्रकार, जब बढ़ाने के तत्वों के प्रभाव के तहत रखा यह एक ऊतक विशिष्ट तरीके से अपनी अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं, जो पिछले दो दशकों के दौरान10कई जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के व्यवस्थित विश्लेषण की अनुमति दी है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के लिए LacZ जीन अभिव्यक्ति की निगरानी भी Cre-loxP मध्यस्थता पुनर्संयोजन द्वारा जीन पुनर्संयोजन की घटनाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, और उत्परिवर्ती भ्रूण स्टेम सेल डेरिवेटिव के स्थानीयकरण chimeric विश्लेषण में 11, जो विशिष्ट ऊतकों में LacZ अभिव्यक्ति के नियंत्रण के साथ ही लौकिक की सुविधा । इसके अलावा, पूरे भ्रूण में, β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने विभिंन तीव्रता है कि आसानी से विभिंन विकास चरणों में मनाया जा सकता है जीन अभिव्यक्ति में लौकिक परिवर्तन का विश्लेषण में धुंधला पैटर्न का उत्पादन कर सकते है 8,12.
इस अनुच्छेद में, हम एक के लिए एक्स के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति कल्पना प्रोटोकॉल वर्तमान माउस भ्रूण के प्रारंभिक विकास चरणों में पूरे पर्वत ऊतक में धुंधला लड़की । हम एक अति संवेदनशील और सस्ती तकनीक है कि या तो पूरे माउंट नमूनों में या तेल एंबेडेड ऊतकों या भ्रूण के बाद सेलुलर स्तर पर लेबल कोशिकाओं का सही पता लगाने के पक्ष के रूप में इस histochemical विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि ंयूनतम पृष्ठभूमि के साथ माउस के ऊतकों में धुंधला के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है जब अंय13तरीकों के साथ तुलना में ।
ई. कोलाई LacZ जीन व्यापक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता और पता लगाने में आसानी की वजह से जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन में एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक एंजाइमी प्र…
The authors have nothing to disclose.
हम Centro Nacional de Investigaciones हृदयों (CNIC) में उनकी तकनीकी सहायता के लिए Histopathological सेवा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी कृपया Mt4-एमएमपीLacZ चूहों प्रदान करने के लिए dr. Motoharu Seiki धन्यवाद, और हमारी परियोजना के समर्थन के लिए और पांडुलिपि के उसे महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एलिसिया जी अर्रोयो. हम इस लेख को ठीक करने के लिए पीटर Bonney शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । यह काम एक अनुदान के माध्यम से Universidad Europea de मैड्रिड द्वारा समर्थित किया गया था (# 2017UEM01) C.S.C. को संमानित किया
REAGENTS | |||
2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
EQUIPMENT | |||
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
pHmeter | Crison | Basic 20 | |
Optic fiber | Optech | PL2000 |