Summary
Een eenvoudige, veelzijdige en goedkope in vitro hydrocultuur systeem werd met succes geoptimaliseerd, inschakelen van grootschalige experimenten onder steriele omstandigheden. Dit systeem vergemakkelijkt de toepassing van chemische stoffen in een oplossing en hun efficiënte absorptie door wortels voor moleculaire, biochemische en fysiologische studies.
Abstract
Een breed scala van studies in plantenbiologie zijn uitgevoerd met behulp van hydrocultuur culturen. In dit werk, wordt een in vitro hydrocultuur groei systeem ontworpen voor de beoordeling van de plant reacties op chemische stoffen en andere stoffen van belang gepresenteerd. Dit systeem is zeer efficiënte bij het verkrijgen van homogene en gezond pootgoed voor de C3 en C4 model soorten Arabidopsis thaliana en Setaria viridis, respectievelijk. De steriele teelt vermijdt algen en micro-organismen verontreiniging, waarvan bekend is dat beperkende factoren voor de normale groei van planten en de ontwikkeling in hydrocultuur. Bovendien is dit systeem schaalbaar, waardoor de oogst van plantaardig materiaal op grote schaal met kleine mechanische schade, evenals de oogst van afzonderlijke delen van een plant indien gewenst. Een gedetailleerd protocol aan te tonen dat dit systeem een eenvoudige en goedkope assemblage heeft, aangezien het pipet rekken als het belangrijkste platform gebruikt voor de teelt van planten, wordt verstrekt. De haalbaarheid van dit systeem werd gevalideerd met behulp van Arabidopsis zaailingen te beoordelen van het effect van de drug AZD-8055, een chemische inhibitor van het streefcijfer van rapamycin (TOR) kinase. TOR remming ontdekt efficiënt zo spoedig 30 min na de behandeling van een AZD-8055 in roots en shoots. Bovendien weergegeven AZD-8055-behandelde planten het verwachte zetmeel-overmaat fenotype. We voorgesteld dit hydrocultuur systeem als een ideale methode voor onderzoekers van de plant gericht op het controleren van de actie van de fabriek inductoren of remmers, evenals evalueren van metabole fluxen met behulp van isotopen-labeling verbindingen waarvoor, in het algemeen, het gebruik van dure reagentia.
Introduction
De voordelen van groeiende planten met behulp van hydrocultuur hebben algemeen erkend in de productie van grote uniforme planten en reproduceerbare experimenten1,2,3inschakelen. In dit systeem kan de compositie van de voedselkwaliiteit oplossing naar behoren wordt gecontroleerd en gerecycleerd langs alle stadia van plantengroei en ontwikkeling. Wortels zijn bovendien niet onderworpen aan de abiotische stress, zoals kan gebeuren in de bodem geteelde planten, zoals nutriënten honger en water deficiëntie4. Als planten gekweekt hydrocultuur aanwezig morfologische en fysiologische eigenschappen redelijk vergelijkbaar met degene die worden gekweekt in de bodem, dit systeem is in grote lijnen nog werkzaam zijn in onderzoek omdat het mogelijk de monitoring van wortel/schieten groei en hun oogsten maakt zonder verwondingen2,5.
Te wijten aan de mogelijkheid van het wijzigen van de samenstelling en de concentratie van de voedselkwaliiteit oplossing, is het meeste onderzoek met behulp van hydrocultuur voorwaarden verricht karakteriseren van de functies voor micro- en macronutriënten1,3 ,6,7,8. Nochtans, heeft dit systeem bleek zeer nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen in plantenbiologie, zodanig ophelderen van de functies van hormonen en chemische stoffen in planten. Bijvoorbeeld, de ontdekking van strigolactones als een nieuwe klasse van hormonen9 en het fenotype van de versnelde groei veroorzaakt door brassinosteroïde toepassing10 werden uitgevoerd onder hydrocultuur voorwaarden. Bovendien maakt dit systeem experimenten met gelabelde isotopen (b.v., 14N /15N en 13CO2)11,12 te evalueren hun opneming in de eiwitten en metabolieten door de Spectrometrie van de massa.
Gezien het belang van dit systeem in plantenonderzoek, een groot aantal hydrocultuur culturen is ontwikkeld in de afgelopen jaren, met inbegrip van systemen die gebruikmaken van (i) de overdracht van zaailingen uit platen met hydrocultuur containers3, 13; (ii) rockwool dat beperkt de toegang tot de vroege stadia van wortel ontwikkeling2,14,15; (iii) polyethyleen granulaat als het zwevende lichaam, waardoor de homogene toepassing van kleine moleculen/behandelingen moeilijk16; of (iv) een verminderd aantal planten9,17. Het volume van hydrocultuur tanks beschreven in veel van deze protocollen zijn meestal grote (kleine hoeveelheden variërend van 1-5 L, maximaal 32 L)18, waardoor de toepassing van chemische stoffen extreem duur. Hoewel weinig studies een hydrocultuur teelt onder aseptische condities8,beschrijven is19, de vergadering van het systeem meestal heel moeizaam, bestaande uit de perfecte aanpassing van nylon mazen in plastic of glas containers5,8,17,20.
Vanwege het belang van Arabidopsis thaliana als een model-plant, werden de meerderheid van hydrocultuur systemen ontworpen voor dit soort1,2,8,14,18, 19 , 20. niettemin, er zijn een paar studies rapportagefuncties de hydrocultuur groei van andere plantensoorten met een voorbehandeling van zaden ter verbetering van hun kiemkracht en synchronisatie tarieven in vitro8,16 . Om te kunnen werken op grote schaal, ontwikkelden we een protocol voor het opzetten van een eenvoudige en goedkope hydrocultuur onderhoudssysteem waarmee steriele omstandigheden voor de teelt van planten, met inbegrip van A. thaliana en andere soorten, zoals het gras Setaria viridis. De hier beschreven methode is geschikt voor verschillende experimenten, zoals de zaailing groei kan worden gemaximaliseerd, gesynchroniseerd en gemakkelijk gecontroleerd. Bovendien, dit systeem heeft vele voordelen als: (i) de montage is eenvoudig en de componenten ervan kunnen worden hergebruikt; (ii) hierdoor de gemakkelijke toepassing van verschillende chemische stoffen in de vloeistof; (iii) de zaailingen ontkiemen en groeien rechtstreeks in het kweekmedium zonder de behoefte aan overdracht aan de hydrocultuur systeem; (iv) de shoot en wortel ontwikkeling/groei nauw kunnen worden gecontroleerd en de zaailingen worden geoogst zonder schade; en (v) het maakt het mogelijk om te werken op grote schaal, behoud van fysiologische toestanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de voedingsbodems voor vloeibare en vaste
- Bereiden van een opgietvloeistof halve sterkte Murashige en Skoog (MS) medium met vitaminen [0,0125 mg/L cobalt(II) chloride pentahydraat 0,0125 mg/L copper(II) sulfaat, pentahydraat, 18.35 mg/L ethyleendiaminetetraacetaat ijzer(III) natrium, 3,10 mg/L Boorzuur, kaliumjodide, 8.45 mg/L van mangaan 0.415 mg/L sulfaat monohydraat, 0,125 mg/L natrium natriummolybdaat (dihydraat) p.a., 4.30 mg/L Zinksulfaat-heptahydraat, 166.01 mg/L calcium chloride, 85 mg/L fosfaat kalium kaliumdiwaterstoffosfaat p.a. in water, 950 mg/L kaliumnitraat 90.27 mg/L magnesium-sulfaat, 825 mg/L van ammoniumnitraat, 1 mg/L van glycine, 50 mg/L myo-inositol, nicotinezuur 0,25 mg/L, 0,25 mg/L Pyridoxinehydrochloride en 0,05 mg/L van thiamine hydrochloride] aangevuld met 0,25 g/L MES, en breng de pH op 5.8 met 10 M KOH.
- Voeg 10 g/L agar te maken een halve sterkte MS-solide medium. Autoclaaf het medium bij 121 ° C gedurende 20 min vóór gebruik.
2. hydrocultuur systeem montage
Opmerking: Deze stappen moeten worden gevolgd zorgvuldig om te bouwen van de hydrocultuur systeem.
-
Materiële sterilisatie
- Pak in de zak van de autoclaaf de pipet tip rekken (zonder covers) die wordt gebruikt als minitanks. Autoclaaf de rekken bij 121 ° C gedurende 20 min, 15 psi.
Opmerking: Het polypropyleen pipette uiteinde rek we gebruikten had de volgende afmetingen: 120 mm (lengte) x 89 mm (breedte) x 55 mm (hoogte). De pipet tip vlakke ondergrond moet beschikken over een gebied voor de toevoeging van kweekmedium. Andere tip rekken kunnen worden gebruikt (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Tijdens de procedure van de vergadering van de hydrocultuur systeem is het gebruik van een laminaire flow-kap, die moet worden gereinigd en ontsmet met 70% ethanol vóór gebruik noodzakelijk. De experimentator moet dragen een laboratoriumjas, hun handen wassen en een blootgestelde huid en ontsmetten met 70% ethanol. Handschoenen zijn optioneel, behalve voor de toepassing van de drug. - Reinig alle bovenstaande (wegwerp plastic dozen, plakband, pipetten, schaar en pincet) met 70% ethanol alvorens de laminaire flow hood accessoires. Als de kap toestaat, schakelt het UV-licht gedurende 10 minuten voorafgaand aan de montage van de hydrocultuur systeem om te houden van het werkgebied ontsmet.
- Pak in de zak van de autoclaaf de pipet tip rekken (zonder covers) die wordt gebruikt als minitanks. Autoclaaf de rekken bij 121 ° C gedurende 20 min, 15 psi.
-
Minitank montage
- Het zegel van de bovenkant van het uiteinde van de pipet plat met plakband (figuur 1B). Indien mogelijk, laat het onder UV-licht voor 10 min.
- Voeg 180 µL van gesmolten solide MS kweekmedium (veel te warm) aan elke goed met een meerkanaalspipet (Figuur 1 c).
Opmerking: Bij de voorbereiding veel tanks, gebruik een kookplaat om te voorkomen dat het MS medium stollen. - Het toestaan van het medium te stollen volledig (voor ongeveer 30 min).
Opmerking: Tijdens de periode van de stolling, het UV-licht kan worden ingeschakeld. - Vul het pipet tip rack compleet met vloeibare MS kweekmedium (Figuur 1 d) en zorgen er nauw contact tussen de vaste en de vloeibare media.
- Verwijderen van de lijm-tapes van de hogere oppervlakte van de pipet tip plat en past op de pijnbank zorgvuldig. De hydrocultuur systeem is nu klaar om te ontvangen van de gesteriliseerde zaden.
3. zaad sterilisatie
- 500 Arabidopsis zaden in een 1,5 mL microtube plaatsen. Gebruik zo veel slangen als nodig volgens het aantal planten die nodig zijn voor het experiment.
- Wassen van de zaden met 70% ethanol gedurende 2 minuten met een zachte agitatie. Laat de zaden settelen en deze vervolgens verwijdert de ethanol zorgvuldig.
- Voeg 1 mL van een 10% natriumhypochloriet-oplossing met 2 µL van een Polysorbaat 20 detergens. Agitate de oplossing voor 5 min. verwijderen de oplossing zorgvuldig.
- Spoel de zaden met steriel gedistilleerd water totdat al het bleekmiddel residu volledig is verwijderd (ongeveer 5 x).
Opmerking: Na de oppervlakte sterilisatie, de zaden werden ondergedompeld in steriel gedistilleerd water en gelaagde bij 4 ° C in het donker voor 5 d voor het synchroniseren van de kiemkracht.
Opmerking: Zaden van Setaria viridis (toetreding A10.1) werden gepreïncubeerd in geconcentreerd zwavelzuur gedurende 15 minuten (te breken de fysieke ruststadia), grondig gewassen in steriel gedistilleerd water en vervolgens disinfested met een 5% natriumhypochloriet-oplossing die 0,1% Polysorbaat 20 voor 5 min met een zachte agitatie21bevatten. De resterende stappen van de sterilisatie waren identiek aan die welke beschreven voor Arabidopsis zaden.
4. zaad toepassing
- Gesneden enigszins het uiteinde van een 200 µL tip met behulp van een steriel scalpel.
- Pipetteer de zaden van Arabidopsis in de solide kweekmedium op de hogere oppervlakte van de Pipet van platte tip. Zorg dat het medium doet niet los van de flat; anders, de zaden zullen grijs en de zaailingen zal niet goed groeien (figuur 1E).
Opmerking: Gebruik een steriel pincet voor Setaria zaden (met het embryo opwaartse gepositioneerd). - Opslaan minitanks zoveel mogelijk binnen een wegwerp plastic doos houden de omgeving vrij van micro-organismen (figuur 1F) te handhaven van een hoge luchtvochtigheid.
- Verzegel de wegwerp plastic doos grondig met behulp van plakband om verontreiniging te voorkomen.
- Plaats de hydrocultuur systemen in een kamer van de groei met de voorwaarden van de juiste groei voor de plant van belang.
Opmerking: In dit werk, werden de volgende omstandigheden gebruikt: 75% van vochtigheid en 150 µmol m-2 s-1 van de bestralingssterkte en Equinoctiael voorwaarden van 12 h licht (21 ° C) / 12u donker (19 ° C) Arabidopsisof 300 µmol m-2 s-1 voor bestralingssterkte en 12 h licht (28 ° C) / 12u donker (25 ° C) voor Setaria (figuur 1G en 1 H).
5. valideren het gebruik van deze hydrocultuur systeem voor de remming van het doel van Rapamycin Kinase
Opmerking: Deze hydrocultuur systeem werd oorspronkelijk ontwikkeld om het beheer van chemische stoffen voor de planten, die in het algemeen, zijn erg duur worden toegepast in grootschalige experimenten. Als een bewijs van concept werkte de ATP-concurrerende remmer AZD-8055, waarvan bekend is dat de ATP-binding site van de TOR proteïne kinase22specifiek te richten, te volgen van de onderdrukking van TOR activiteit in zaailingen van A. thaliana Columbia-0) De Nottingham Arabidopsis voorraad centrum, de NASC-ID: N22681). Het gebruikte protocol is hier, kort beschreven.
- Groeien zaden hydrocultuur totdat fase 1.04 volgens de BBCH schaal23 (voor ongeveer 11 d) onder de klimatologische omstandigheden zoals hierboven beschreven. Vervangen van de voedingsoplossing, hetzij met het verse medium met 0,05% DMSO (control), 2 µM AZD-8055 (TOR-remmer) verdund in DMSO, of zonder behandeling (mock), aan het einde van de nacht (nl).
- Oogst van sommige zaailingen op verschillende tijdstippen na de behandeling en ze scheiden in roots en shoots. Bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof, ze vermalen tot een fijn poeder in een robotachtige slijper (Zie Tabel of Materials), en het poeder bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
- Immunoblot tegen gefosforyleerd en niet-phosphorylated vormen van 40S ribosomal eiwit S6 (RPS6) volgens Dobrenel et al. 24.
- Bleekmiddel intact zaailingen voor monster depigmentatie, was ze in gedistilleerd water dompelen hen in een jodiumoplossing voor 5 min25en fotograferen van de zaailingen in een stereomicroscoop (0.63 X 7,5 x omvang, doelstelling en 20 x onderlinge aanpassing) voor een kwalitatieve beoordeling van het zetmeelgehalte.
- Het zetmeel na de enzymatische afbraak en de waardering van de vrijgegeven glucose spectrophotometrically door het te koppelen aan de vermindering van NADP+ aan NADPH26,27te kwantificeren.
- Uitvoeren van een totale extractie van RNA, cDNA synthese en kwantitatieve RT-PCR-testen zoals beschreven door Caldana et al. 28 tot en met het niveau van de expressie van genen aan verschillende soorten benadrukt gerelateerde te evalueren.
- Optioneel, groeien zaailingen op een tuinbouw substraat in kunststof potten met een capaciteit van 0,1 L onder vergelijkbare klimatologische omstandigheden [60% luchtvochtigheid, 150 µmol m-2 s-1 van bestralingssterkte, Equinoctiael van 12 h licht (21 ° C) / 12u donker (19 ° C )] om te vergelijken met de zaailingen hydrocultuur gegroeid.
Opmerking: De doelgenen gebruikt voor het testen van gen expressie werden ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), en TPS5 (At4g17770), en hun niveaus van de expressie waren genormaliseerd dienst van de delta-Ct methode29 met behulp van ACT2 (At3g18780) of PDF2 (At4g04890) als de interne verwijzing genen, ervan uitgaande dat 100% van de PCR-amplificatie efficiëntie over alle monsters. De oligonucleotide-paren die worden gebruikt voor de kwantitatieve PCR waren: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), en PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De TOR-kinase is een belangrijke regulator dat integreert voedingsstoffen en energie signalering ter bevordering van celproliferatie en groei in alle eukaryoten. Inspanningen om te verhelderen TOR functies in planten omvatten de generatie van Arabidopsis transgene lijnen met TOR voorwaardelijke repressie door middel van RNA-interferentie of kunstmatige microRNA28,30,31, gegeven het embryo dodelijke fenotype van TOR knockout planten32,33,34,35. De meeste van de voorwaardelijke transgene lijnen zijn onder de controle van estradiol-, dexamethason- of ethanol-afleidbare initiatiefnemers, die ook kon maken gebruik van deze hydrocultuur systeem.
Een van de bekende doelen voor TOR activity in Arabidopsis is de directe fosforylering van de ribosomal eiwit S6 kinase (S6K)34,36,,37,38. Bij fosforylering, S6K verder kinaseenzym de 40S ribosomal proteïne S6 (RPS6), beïnvloeden de ribosomal eiwit vertaling24,39,40. Onlangs is gebleken dat de fosforylering van de site van een RPS6 Ser240 een goede marker van TOR activiteit24 is. Immunoblotting assays bevestigd dat kort na 30 min van drug administration, een significante daling in de Ser240-fosforylatie werd waargenomen in zowel roots en shoots (Figuur 2). Onder de experimentele omstandigheden gebruikt, heeft AZD-8055 ook aangetoond een krachtige TOR-inhibitor, die snel haar kinaseactiviteit onderdrukt.
Transgene Arabidopsis lijnen met een verminderde expressie van het TOR-gen of componenten van de TOR complexe presenteren een duidelijke zetmeel overtollige fenotype28,31. Kwalitatieve analyse van zetmeel met behulp van oplossing Lugoljodium bleek het verwachte patroon van zetmeel accumulatie en afbraak tijdens de diel cyclus (Figuur 3). Zaailingen die ontving niet een toepassing van DMSO of AZD-8055 toonde geen grotere accumulatie van zetmeel in hun bladeren aan het einde van de nacht (nl), en de accumulatie van zetmeel in de controle-planten (waaraan 0,05% DMSO) strookte met de literatuur 41 , 42. anderzijds planten behandeld met AZD-8055 gepresenteerd een grotere hoeveelheid resterende zetmeel op de nl in vergelijking met de zaailingen van de controle. Deze resultaten aangegeven het nut van de voorgestelde hydrocultuur systeem in de teelt van zaailingen fysiologische omstandigheden nabootsen. Dit systeem wordt ook de bevestiging van het zetmeel overtollige fenotype typisch voor een onderdrukking van de TOR complexe componenten24,28,31ingeschakeld.
Zetmeelgehalte ook nauwkeurig werd gemeten met behulp van een gevoelige methode, waaruit blijkt dat de behandeling AZD-8055 geleid tot aanzienlijk hogere concentraties van zetmeel aan zowel het einde van de dag (ED) zaailingen en nl in vergelijking met de controle van DMSO-behandeld planten (Figuur 4). Zetmeel hoopt zich op in de bladeren gedurende de dag en 's nachts is remobilized om te houden van de metabole activiteit, vooral de ademhaling en de continue export van sacharose tot en met andere plant organen41,42. Onder normale omstandigheden, slechts een klein deel van zetmeel (tussen 5% en 10% van het bedrag op de ED) blijft op de nl43,44,45. Deze resultaten blijkt dat het zetmeel overtollige fenotype onder de onderdrukking van de TOR waargenomen over de diel-cyclus plaatsvindt.
Hydrocultuur geteelde planten werden vergeleken met de zaailingen geteeld in een tuinbouw substraat onder zeer vergelijkbare klimatologische omstandigheden betreffende de expressie niveau van de abscisic-zuur-responsief element-bindende factor 3 (ABF3) gen (figuur 5A ), welke direct correlaten met interne ABA niveaus, een klasse van hormonen alom bekend was als een marker vanwege haar rol in meerdere abiotische stress reacties46,47,48. Hoewel zaailingen geteeld in de hydrocultuur systeem een aanzienlijke verhoging van het niveau van de ABF3, werd de uitdrukking van asparagine synthase 1 (ASN1) niet beïnvloed door de DMSO of AZD behandelingen (figuur 5B). Echter, trehalose fosfaat synthase 5 (TPS5) werd aanzienlijk verhoogd na 8u van TOR inhibitie (figuur 5B). Asn1 en TPS5 reageren op lage en hoge suiker niveaus49,50,51,52,53,,54, respectievelijk, suggereren dat deze planten niet energetische stress ervaren werden.
Figuur 1 : Workflow voor het samenstellen van de hydrocultuur systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Effect van remming van de TOR op de fosforylering van de RPS6 in verschillende weefsels van Arabidopsis thaliana . Immunoblotting toont de overvloed van de totale en gefosforyleerd RPS6 in de hoofdmap (A) en (B) schieten extracten van zaailingen behandeld met 2 µM AZD-8055 of 0.05% DMSO (control). Waarden vertegenwoordigen de verhoudingen genormaliseerd door de niet-phosphorylated proteïne RPS6. Anti-actine antilichaam werd gebruikt als een besturingselement laden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Arabidopsis thaliana zaailingen gekleurd met lugoljodium reagens. Behandelingen met 2 µM AZD-8055 of 0.05% DMSO (control) werden toegepast op de nl (rode pijl) en vergeleken om te bespotten zaailingen (neen-behandeling). Zaailingen werden geoogst vóór de toepassing van de behandeling (0 h) en 12 uur (ED) en 24 h (nl) na de behandeling, aangegeven door zwarte pijlen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Effect van remming van de TOR op het zetmeelgehalte van Arabidopsis thaliana zaailingen. Zetmeel enzymatisch vóór (0 h) werd gemeten en bij 12 h (ED) of 24 h (nl) na de behandeling met 2 µM AZD-8055 (zwart) of 0.05% DMSO (control, wit). De waarden die worden weergegeven zijn de gemiddelde ± de standaardfout (SE) (n = 4). Aanzienlijke verschillen tussen de zaailingen behandeld met AZD-8055 en DMSO, met behulp van de Student t-test, sterretjes worden aangeduid: * (P < 0,05) en *** (P < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Niveau van de expressie van genen stressgerelateerde. (A) vergelijking van ABF3 afschriften in hydrocultuur en substraat-gegroeid Arabidopsis Col-0 zaailingen. (B) vergelijking van ASN1 en TPS5 afschriften in Arabidopsis zaailingen behandeld met 2 µM AZD-8055 en 0,05% DMSO. De genormaliseerde expressie niveaus worden weergegeven als 2^(-dCt). De waarden die worden weergegeven zijn de gemiddelde ± SE (n = 3). Aanzienlijke verschillen, met behulp van de Student t-test, sterretjes worden aangeduid: *** (P < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 1:deze in vitro hydrocultuur systeem maakt het mogelijk om te synchroniseren van kieming en verkrijgen van homogene zaailingen. Zaden van A. thaliana (C3) en S. viridis (C4) waren ontkiemd rechtstreeks in dit systeem. (A en C) de zaailingen werden homogene ten opzichte van het ontwikkelingsstadium en de behandeling werd toegepast na 11 d (Arabidopsis) of 7 d (Setaria). (B en D) groeien de wortels rechtstreeks naar de voedingswaarde oplossing, de toevoeging van verschillende stoffen en hun absorptie te vergemakkelijken. Deze resultaten geven sterk aan dat dit systeem een optimale omgeving voor de plantengroei biedt en kan worden gebruikt voor het efficiënt uitvoeren van een breed scala van tests. Bovendien, is deze hydrocultuur systeem zeer nuttig voor grootschalige experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze geoptimaliseerde hydrocultuur structuur maakt het mogelijk de succesvolle in vitro cultuur van planten. Zaden ontkiemen goed op de solide medium op de pipet tip plat oppervlak, een aanzienlijke winst in vergelijking met systemen waar zaden doorweekt met de voedingsoplossing zijn. Een groot voordeel van dit systeem is dat tijdens de ontwikkeling van zaailing, wortels rechtstreeks contact met de vloeistof zonder de behoefte aan overdracht krijgen. Bovendien, chemische behandeling kan gemakkelijk worden toegepast in de vloeistof in een verminderde volume. Vochtigheid is hoog, het vermijden van de verdamping van de voedingsoplossing en haar aanvulling gehouden. Bovendien homogeen groei en ontwikkeling tijdens de totstandbrenging van zaailing kunnen gemakkelijk worden verkregen, en beluchting is niet vereist wanneer u werkt met kleine tanks en zaailingen in dit ontwikkelingsstadium1,10,18 . Om te garanderen dat het systeem volledig vrij van verontreinigingen zijn zal, is een cruciale stap de sterilisatie van gebruikt materiaal en reanimatie tijdens haar vergadering. Als gevolg van de onmogelijkheid om te steriliseren van sommige onderdelen in de autoclaaf (b.v., wegwerp plastic dozen), is het raadzaam ze eerst duidelijk met 70% ethanol en vervolgens het toepassen van een korte periode van UV-licht vóór gebruik. In onze ervaring, het gebruik van UV-licht, nadat de vlakke ondergrond met plakband en tijdens het stollen van de media, ook verontreiniging voorkomen wordt bacteriële en schimmelinfecties. Voorts, wees voorzichtig niet te raken van de media, de pipet rekken altijd in beweging door de laterale zijde.
Om te verzekeren de optimale groei van de zaailingen, is het belangrijk om te controleren het nauwe contact tussen vaste en vloeibare media, zorgen voor de volledige onderdompeling van de wortels na de kieming van het zaad. Het solide medium moet voldoende dichte (10 g/L agar) en volledig verhard is dus niet te los van het platte oppervlak en zweven in de voedingsoplossing. Naast Arabidopsis, kan dit systeem worden gebruikt voor de teelt van andere plantensoorten, zolang de zaden klein genoeg zijn om de putten van het appartement. In dat opzicht is de hydrocultuur methode hier gepresenteerd ook efficiënt voor het kweken van de Setaria viridis, een klein gras die onlangs heeft ontpopt als een roman modelsysteem voor het bestuderen van de C4 fotosynthese, stress biologie en andere bio-energie gewas eigenschappen 55. vergelijkbaar met Arabidopsis, dit systeem laat toe om te produceren gelijkmatig groeiend Setaria zaailingen met een goed wortelgestel en op grote schaal (aanvullende Figuur 1), omdat elke rek 96 zaden ondersteunt, ervoor te zorgen veel zaailingen per biologische repliceren en bijgevolg voldoende materiaal voor een myriade van downstream toepassingen. Een hoger aantal replicatieonderzoeken verhoogt de efficiëntie van de statistische testen, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare resultaten van experimentele studies56. Bijvoorbeeld konden met behulp van een groei-kamer met een oppervlakte van slechts 1,5 m2, we groeien 6.000 zaailingen tegelijk, waardoor het mogelijk is om uit te voeren van de temporele kinetiek van de reactie op een gewenste behandeling. Bovendien, de geoogste monsters kunnen worden gebruikt voor meerdere en complementaire 'omics' analyseert die kan eisen dat een grote hoeveelheid weefsel (bv, immunoblotting). Deze hydrocultuur structuur is van bijzonder belang voor groepen willen analyseren, verschillende plant organen (bijvoorbeeld, roots en shoots), omdat hierdoor hun scheiding gemakkelijk en snel.
Een klein aantal studies beschreven hetgebruik van pipette uiteinde vakken tijdens de ontwikkeling van de eerste planten vóór een overdracht naar grotere hydrocultuur tanks11,20, en meer recentelijk een zeer vergelijkbaar systeem werkte om de amino zure opname- en translocatie in 5 weken oude Arabidopsis planten57. Het protocol hier beschreven biedt aanvullende voordelen in termen van het kweken van de planten onder steriele omstandigheden.
Hoewel dit systeem werd aanvankelijk ontwikkeld om te groeien van zaailingen, kan het ook zijn geschikt voor grotere planten. In dit scenario is het vermeldenswaard dat er moet worden gezorgd om de zaden meer ver van elkaar om zoveel arcering mogelijk tijdens de groei. Beluchting kan bovendien in de rekken ter voorkoming van hypoxie door één putje van de pipet tip plat, een veelvoorkomend probleem in verzonken Arabidopsis wortels groeien voor langere perioden worden binnengebracht. Planten zijn vanwege hun sessiele aard onderworpen aan verschillende soorten abiotische en biotische onderstreept, afhankelijk van hun omgeving. Daarom, gezien het doel van de studie en het ontwikkelingsstadium wellicht belangrijk om te controleren of de planten die groeien in dit systeem aan een soort van stress lijdt.
De resultaten die hier gepresenteerd is gebleken dat deze hydrocultuur systeem zeer nuttig voor de toepassing van chemische stoffen op de nutritieve oplossing, is met name bij het werken met dure stoffen, als gevolg van de geringe omvang van de pipet tip rekken. Wij hebben slaagde erin om met dit systeem te effectief het onderdrukken van de activiteit van TOR kinase door AZD-8055 en bevestigd dat de status van fosforylering van de stroomafwaartse doel RPS6 al na 30 min voor toepassing van de behandeling ondergaat. Bovendien, TOR remming leidt tot zaailingen met hogere niveaus van zetmeel tijdens de dag en nacht in vergelijking met de zaailingen van de controle. Deze gehaltebepalingen kunnen gemakkelijk worden toegepast te verlengen van de opmerkingen die reeds verkregen met transgene lijnen, waardoor een afleidbare repressie van de gen-encoding componenten van de TOR complex, of elke andere traject van belang. Kortom, het voorgestelde hydrocultuur systeem bezit vele voordelen, want het is zeer gemakkelijk en eenvoudig te monteren, heeft een low-cost (de belangrijkste onderdelen zijn goedkoop en uitgebreid kunnen worden hergebruikt), is veelzijdig (maakt de studie van intact zaailingen of verschillende weefsels in specifieke of langs de ontwikkelingsstadia van de plant), en is zeer schaalbaar (het staat de teelt van een groot aantal zaailingen in een zeer klein gebied).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de São Paulo Research Foundation (FAPESP; Verlenen van 12/19561-0) en de Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), en Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) zijn dankbaar voor de beurzen. De auteurs bedanken Christian Meyer van het Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankrijk) royaal voorzien van antilichamen tegen RPS6. De auteurs bedanken RTV UNICAMP en Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel voor hun technische ondersteuning tijdens het geluid opnemen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
