Summary
Простой, универсальный и недорогой в vitro гидропоники системы успешно была оптимизирована, позволяя широкомасштабных экспериментов в стерильных условиях. Эта система облегчает применение химических веществ в растворе и их эффективного поглощения корнями для молекулярной, биохимических и физиологических исследований.
Abstract
Широкий спектр исследований в биологии растений выполняются с использованием гидропоники культур. В этой работе представлен в vitro гидропоники роста система, предназначенная для оценки реакция растений на химических и других веществ, представляющих интерес. Эта система очень эффективна в получении однородной и здоровые саженцы C3 и C4 модели видов Arabidopsis thaliana и Setaria зелёный, соответственно. Стерильные культивирования избегает водорослей и микроорганизмов загрязнения, которые известны ограничивающих факторов для нормального роста и развития растений в гидропонике. Кроме того эта система является масштабируемой, позволяя урожая растительного материала в крупных масштабах с незначительных механических повреждений, а также урожай отдельных частей растения, при желании. Подробный протокол, демонстрируя, что эта система имеет сборку простой и недорогой, как он использует пипеткой стойки в качестве основной платформы для выращивания растений, предоставляется. Возможности этой системы была проверена с помощью Arabidopsis саженцы оценить эффект препарата АЗД-8055, химического ингибитор целевого объекта киназы rapamycin (TOR). Ингибирование TOR эффективно обнаружена 30 мин в кратчайшие сроки после лечения АЗД-8055 в корни и побеги. Кроме того АЗД-8055-лечение растений отображается ожидаемых крахмала избыток фенотип. Мы предложили эту гидропоники системы как идеальный метод для исследователей завод стремится контролировать действия индукторов растений или ингибиторы, а также оценить метаболизм потоков с использованием изотопов маркировки соединений, которые, в целом, требует использования дорогих реагентов.
Introduction
Преимущества выращивания растений с использованием гидропоники широко признается в производстве больших и форма растений, позволяя воспроизводимость экспериментов1,2,3. В этой системе состав питательный раствор можно должным образом контролируется и переработанных вдоль всех стадиях роста и развития растений. Кроме того корни не подвергаются к абиотическим стрессам, как может случиться в почвы выращенных растений, таких как питательных голода и воды дефицит4. Как растения, выращенные гидропоники настоящий Морфологические и физиологические черты, довольно похож на те, которые выращиваются в почве эта система широко использовалась в исследованиях потому, что она позволяет осуществлять мониторинг роста корня/стрелять и их заготовки без травмы2,5.
Благодаря возможности изменения состава и концентрации раствора питательная большинство исследований с использованием гидропоники условий выполнено охарактеризовать функции микро - и макроэлементы1,3 ,6,,78. Однако эта система оказалась очень полезной для широкого круга приложений в биологии растений, таким образом, чтобы уточнить функции гормонов и химических веществ в растениях. Например открытие strigolactones как новый класс гормонов9 и фенотип ускоренного роста, вызванного Брассиностероиды приложения10 были исполнены в гидропонных условиях. Кроме того, эта система позволяет эксперименты с метками изотопов (например, 14N /15N и 13CO2)11,12 , чтобы оценить их включению в белков и метаболитов по масс-спектрометрии.
Учитывая важность этой системы в исследования растений, большое количество гидропонных культур был разработан в последние несколько лет, включая системы, использующие (i) передача саженцев из плит для гидропоники контейнеры3, 13; (ii) минеральная вата, которая ограничивает доступ к на ранних стадиях корень развития2,,1415; (iii) полиэтилена гранулят как плавающий органа, который делает однородной применение малых молекул/лечение трудным16; или (iv) уменьшенное количество растений9,17. Обычно большой объем гидропонных танков, описаны во многих из этих протоколов (небольшие объемы, начиная от 1-5 L, до 32 Л)18, что делает применение химических веществ чрезвычайно дорогим. Хотя некоторые исследования описывают гидропоники выращивания в асептических условиях8,19, Ассамблея системы обычно довольно трудоемким, состоящий из идеальный регулировки нейлоновые сетки в пластика или стекла контейнеры5,8,17,20.
Ввиду важности Arabidopsis thaliana как модель завод большинство гидропоники системы были разработаны для этого вида1,2,8,14,18, 19 , 20. Тем не менее, есть несколько исследований, отчетности гидропоники роста функции других видов растений с помощью предварительной обработки семян для улучшения их всхожесть и синхронизации ставки в vitro8,16 . Для работы в больших масштабах, мы разработали протокол для создания простых и недорогостоящих обслуживания гидропоники системы, которая обеспечивает стерильные условия для выращивания растений, в том числе A. thaliana и другие виды, такие как трава Щетинник Зелёный. Метод, описанный здесь подходит для различных экспериментов, как рост рассады можно развернуть, синхронизации и легко контролируется. Кроме того, эта система имеет много преимуществ, как: (i) его Ассамблее прост и может быть повторно использован его компонентов; (ii) оно позволяет легко применение различных химических веществ в жидкой среде; (iii саженцев прорастают и расти непосредственно в среде культуры без необходимости перехода к системе гидропоники; (iv) стрелять и корень развития/рост может тесно контролироваться и саженцы собирают без ущерба; и (v), это делает его возможным для работы на больших масштабах, поддержания физиологических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка жидких и твердых культуры и средств массовой информации
- Подготовить жидкой среды, используя половину сила фотосинтетическую и Скуг (МС) средний с витаминами [0,0125 мг/Л cobalt(II) хлорид пентагидрат, 0,0125 мг/Л Небходимая сульфата пентагидрат, 18,35 мг/Л тетранатрия железа натрия, 3.10 мг/Л борная кислота, 0,415 мг/Л калия йодида, 8.45 mg/L марганца сульфата моногидрата, 0,125 мг/Л Молибдат натрия дигидрат, 4,30 мг/Л цинка сульфата гептогидрата, 166.01 мг/Л хлористого кальция, 85 мг/Л калия дигидрогенфосфат, 950 мг/Л Нитрат калия, 90.27 мг/Л сульфата магния, 825 мг/Л нитрата аммония, 1 мг/Л глицина, 50 мг/Л myo инозитол, 0,25 мг/Л никотиновой кислоты, 0,25 мг/Л пиридоксина гидрохлорида и тиамина гидрохлорида 0,05 мг/Л] ДОПОЛНЕНО с 0,25 г/Л МЧС и скорректировать рН до 5,8 с 10 М Кох.
- Добавьте 10 г/Л агар сделать среднего MS-твердый половину сила. Автоклав среды при температуре 121 ° C за 20 мин до использования.
2. гидропоники системы сборки
Примечание: Эти шаги следует тщательно построить гидропонное системы.
-
Материал стерилизации
- Упаковывайте в мешке автоклав наконечник пипетки стойки (без крышки), которые будут использоваться в качестве minitanks. Автоклав стойки на 121 ° C в течение 20 мин, 15 psi.
Примечание: Стойки кончик полипропиленовые пипетки, мы использовали имел следующие размеры: 120 мм (длина) x 89 мм (ширина) x 55 мм (высота). Наконечник пипетки плоской поверхности должны иметь область для добавления питательной среды. Могут использоваться другие подсказки стойки (см. Таблицу материалы).
Примечание: На протяжении всей процедуры Ассамблеи гидропоники системы, необходимо использовать Ламинарный шкаф, которые должны быть очищены и продезинфицированы с 70% этанол до использования. Экспериментатор должен носить пальто лаборатории, моют руки и любой открытой кожи и лечить их с 70% этиловом спирте. Перчатки являются необязательными, за исключением применения наркотиков. - Очистите все аксессуары, описанные выше (одноразовые пластиковые коробки, скотч, пипетки, ножницы и щипчики) с 70% этанол перед входом Ламинарный шкаф. Если вытяжка позволяет, включите свет УФ за 10 мин до монтажа гидропоники системы для того чтобы держать рабочую зону обеззараживания.
- Упаковывайте в мешке автоклав наконечник пипетки стойки (без крышки), которые будут использоваться в качестве minitanks. Автоклав стойки на 121 ° C в течение 20 мин, 15 psi.
-
Minitank монтаж
- Печать верхней поверхности кончика пипетки плоский с клейкой ленты (рис. 1B). Если возможно оставьте его под УФ света за 10 мин.
- 180 мкл растопленным твердых MS питательной среды (слегка теплой), чтобы каждый хорошо с помощью многоканальных дозаторов (рис. 1 c).
Примечание: При подготовке много танков, используйте плитой для предотвращения застывающих среды MS. - Позвольте средство для закрепления полностью (для около 30 мин).
Примечание: В период затвердения, УФ-свет может быть включен. - Заполните вверх стойку наконечник пипетки полностью с жидкой питательной среды MS (рис. 1 d) и обеспечить тесный контакт между твердых и жидких сред.
- Удалите клейкие поверхности верхней плоской кончика пипетки и установите его на стойке тщательно. Гидропонное системы теперь готова получать стерилизованные семена.
3. Семена стерилизации
- Место 500 Arabidopsis семена в 1,5 мл микропробирок. Используйте как много пробирок при необходимости согласно количество растений, необходимых для проведения эксперимента.
- Вымойте семена с 70% этанол на 2 мин с нежным агитации. Пусть семена успокоиться, а затем осторожно выньте этанола.
- Добавьте 1 мл 10% раствора гипохлорита натрия, содержащий 2 мкл Полисорбат 20 моющего средства. Агитируйте решение для 5 минут удалить решение тщательно.
- Сполосните семена с стерильной дистиллированной водой до тех пор, пока все остатки отбеливателя полностью удалены (приблизительно 5 x).
Примечание: После поверхности стерилизации, семена были погружены в стерильной дистиллированной воде и расслаиваются при 4 ° C в темноте для 5 d для синхронизации всхожесть.
Примечание: Семена Setaria viridis (присоединение A10.1) были преинкубации в концентрированной серной кислоты на 15 мин (сломать физического покоя), тщательно промывают в стерильной дистиллированной воде и затем disinfested с 5% раствора гипохлорита натрия содержащие 0,1% Полисорбат 20 для 5 мин с нежным агитации21. Оставшиеся шаги стерилизации были идентичны описанным для выращивания арабидопсиса семян.
4. начальное приложение
- Вырежьте немного оконечности 200 мкл отзыв с помощью стерильным скальпель.
- Пипетка Arabidopsis семена в твердой питательной среды на верхней поверхности плоской кончика пипетки. Будьте осторожны, что носитель не ослабить от квартиры; в противном случае, семена будут затенены и саженцы не будет расти должным образом (Рисунок 1E).
Примечание: Используйте стерильный пинцет для Setaria семена (с эмбриона, позиционируется вверх). - Храните столько minitanks как можно внутри одноразовые пластиковые коробки для поддержания высокой влажности и держать среды, свободной от микроорганизмов (Рисунок 1F).
- Уплотнение одноразовые пластиковые коробки, тщательно с использованием клейкой лентой, чтобы избежать загрязнения.
- Поместите гидропонных систем в камере роста с условиями соответствующего роста для растений интерес.
Примечание: В этой работе были использованы следующие условия: 75% влажности и 150 мкмоль м-2 s-1 освещенность и экваториальный условий 12 ч света (21 ° C) / 12 h темный (19 ° C) для выращивания арабидопсиса, или 300 мкмоль м-2 s-1 о свет (28 ° C) излучения и 12 h / 12 h темный (25 ° C) для Setaria (Рисунок 1 g и 1 H).
5. Проверка использования этой гидропоники системы препятствовать целевого Rapamycin киназа
Примечание: Это гидропоники системы была первоначально разработана для облегчения администрирования химических веществ для растений, которые, в целом, являются очень дорогими, чтобы применяться в широкомасштабных экспериментов. Как доказательство концепции АТФ конкурентный ингибитор АЗД-8055, который известен конкретно сайт связывания СПС TOR протеин киназы22, был нанят следовать репрессии в отношении деятельности TOR в проростках A. thaliana (Columbia-0 Ноттингем Arabidopsis фондового центра, НКБА ID: N22681). Здесь кратко описан используемый протокол.
- Растут семена гидропоники до стадии 1.04 согласно BBCH масштаб23 (для около 11 d) в климатических условиях, описанных выше. Заменить питательного раствора, либо с свежих средних содержащие 0,05% ДМСО (контроль), 2 мкм АЗД-8055 (TOR ингибитор) разводят в ДМСО, или без лечения (макет), в конце ночи (EN).
- Урожай некоторых саженцев в разное время точках после лечения и разделить их на корни и побеги. Замораживание образцов в жидком азоте, измельчить их до состояния порошка в роботизированной точильщика (см. Таблицу материалы) и хранить порошок-80 ° c до использования.
- Иммуноблот против фосфорилированных и не phosphorylated форм 40S рибосомных белка S6 (RPS6) согласно Dobrenel и др. 24.
- Отбеливатель нетронутыми саженцев для образца депигментация, мыть их в дистиллированной воде, погрузить их в раствор йода для 5 мин25и сфотографировать саженцев в стереомикроскопом (0,63 X цель, 20 x приближения и 7,5 x величины) для качественная оценка содержание крахмала.
- Количественно крахмала после энзимной деградации и измерения глюкозы выпущенное спектрофотометрически, связывая его с сокращения NADP+ до NADPH26,27.
- Выполняет общее извлечение RNA, синтез cDNA и Количественная ПЦР-анализы как описано в Caldana et al. 28 оценить уровень экспрессии генов, связанных с различных видов напряжений.
- При необходимости проращивания на подложке садоводства в пластиковые горшки с емкостью 0,1 Л при аналогичных климатических условиях [60% влажности, 150 мкмоль м-2 s-1 излучения и экваториальный условиях 12 ч света (21 ° C) / 12 h темный (19 ° C )] для того, чтобы сравнить их с сеянцев, выращенных гидропоники.
Примечание: Целевых генов используется для анализов выражение гена были ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), и ТПС5 (At4g17770) и их уровни выражения были нормализованы, используя метод Дельта Ct29 , с помощью ACT2 (At3g18780) или PDF2 (At4g04890) как внутреннюю ссылку генов, предполагая 100% эффективности амплификации PCR во всех образцах. Олигонуклеотида пар используется для количественного PCR были: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), ТПС5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) и PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Киназы TOR является основной регулятор, который интегрирует питательных веществ и энергии, сигнализации способствовать пролиферации клеток и рост всех эукариот. Усилия по разъяснению функций TOR в растениях включают поколения Arabidopsis трансгенных линий, содержащих условное репрессии TOR через РНК-интерференции или искусственные микроРНК28,30,31, Учитывая эмбриона смертоносных фенотип TOR нокаут растений32,33,34,35. Большинство из условного трансгенных линий находятся под контролем эстрадиол-, дексаметазон- или этанола индуцибельной промоутеров, которые могли бы также сделать использовать гидропоники системы.
Одним из хорошо известных целей деятельности TOR в проростках Arabidopsis является прямым фосфорилирование рибосомных белка S6 киназы (S6K)34,36,,3738. После фосфорилирования, S6K далее фосфорилирует 40S рибосомных белка S6 (RPS6), затрагивающих рибосомных белка перевод24,,3940. Недавно было продемонстрировано, что фосфорилирование RPS6 Ser240 сайт является хорошим маркером Тор активности24. Immunoblotting анализов подтвердили, что вскоре после 30 мин лекарствами, значительным снижением фосфорилирования Ser240 наблюдалось в корни и побеги (рис. 2). В экспериментальных условиях используется чтобы быть мощным ингибитором TOR, который быстро подавляет киназу деятельность также показал АЗД-8055.
Трансгенных линий Arabidopsis с снижение экспрессии гена TOR или компонентами TOR комплекс представить четкие крахмала избыток фенотип28,31. Качественный анализ крахмала, используя раствор Люголя показали шаблоне ожидаемые накопления крахмала и деградации в течение цикла diel (рис. 3). Саженцы, которые не получили применение ДМСО или АЗД-8055 показал не большее накопление крахмала в их листья в конце ночи (EN), и накопление крахмала в контрольных растений (получившие 0,05% ДМСО) согласуется с литературой 41 , 42. Кроме того, растения, относились с АЗД-8055 представил большее количество оставшихся крахмала в EN по сравнению с управления саженцев. Эти результаты свидетельствуют о полезности предлагаемой системы гидропоники выращивания рассады, подражая физиологических условиях. Эта система также включено подтверждение крахмала избыток фенотип типичный репрессий TOR компонентов комплекса24,28,31.
Содержание крахмала было также точно измерено с использованием чувствительных методологии, демонстрируя, что АЗД-8055 лечения привело к саженцев, содержащие значительно более высокий уровень крахмала в конце дня (Эд) и EN по сравнению с ДМСО лечить контроля растения (рис. 4). Крахмала накапливается в листьях в течение дня и это мобилизовала всю ночь для поддержания метаболической активности, преимущественно дыхания и непрерывный экспорт сахарозы в другие органы растений41,42. При нормальных условиях только небольшая часть крахмала (между 5% и 10% от суммы на ED) остается в43,EN,44,,45. Эти результаты подтверждают, что крахмал, наблюдается избыток фенотип под репрессии TOR происходит всему diel цикла.
Гидропоники выращенных растений были по сравнению с сеянцев, выращенных в подложке садоводства в схожих климатических условиях, относительно выражения уровня Абсцизовая кислота отзывчивым фактора привязки элементов 3 (ABF3) ген (Рисунок 5A ), который напрямую коррелирует с внутренней ABA уровнях, класса гормонов, широко известный как маркер из-за его роль в нескольких абиотического стресса ответы46,47,48. Хотя сеянцев, выращенных в системе гидропоники значительное увеличение уровня ABF3, выражение аспарагин синтетазы 1 (ASN1) не пострадал от ДМСО или АЗД лечения (Рисунок 5B). Однако Трегалоза фосфат синтазы 5 (ТПС5) была значительно увеличена после 8 h TOR ингибирование (Рисунок 5B). ASN1 и ТПС5 реагировать сахара в низкий и высокий уровень49,50,51,52,53,54, соответственно, предлагая что эти растения не испытывают энергичный стресс.
Рисунок 1 : Рабочий процесс для монтажа системе гидропоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Эффект торможения TOR на RPS6 фосфорилирования в различных тканях Резуховидка Таля . Immunoblotting показывает обилие общее и фосфорилированных RPS6 в корне (A) и (B) стрелять экстракты саженцев относились с 2 мкм, АЗД-8055 или 0,05% ДМСО (управления). Значения представляют коэффициенты, нормализованы не phosphorylated протеин RPS6. Антитела против актина был использован как элемент управления загрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Резуховидка Таля сеянцы витражи с реактив Люголя в. Лечение с 2 мкм АЗД-8055 или 0,05% ДМСО (управления) были применены на EN (красная стрелка) и по сравнению с МОК саженцев (без лечение). Саженцы были собирают до лечения приложения (0ч) и в 12 ч (Эд) и 24 h (EN) после лечения, обозначенных черными стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Эффект торможения TOR на содержание крахмала Резуховидка Таля саженцев. Крахмал измерялась ферментативно до (0 h) и в 12 ч (Эд) или 24 ч (EN) после лечения с 2 мкм АЗД-8055 (черный) или 0,05% ДМСО (контроль, белый). Показанные значения являются среднее ± стандартная ошибка (SE) (n = 4). Существенные различия между саженцы относились с АЗД-8055 и ДМСО, используя студента t-тест, обозначаются звездочками: * (P < 0,05) и *** (P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Уровень экспрессии генов, связанных со стрессом. Сравнение (A) ABF3 стенограммы в гидропоники и субстрат выращенных саженцев Arabidopsis Col-0. (B) сравнение ASN1 и ТПС5 стенограммы в проростках Arabidopsis относиться с 2 мкм, АЗД-8055 и 0,05% ДМСО. Уровни нормализованных выражения отображаются как 2^(-dCt). Показанные значения являются среднее ± SE (n = 3). Значительные различия, используя студента t-тест, обозначаются звездочками: *** (P < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные Рисунок 1:это в пробирке гидропонное системы позволяет синхронизировать всхожесть и получения однородной саженцев. Непосредственно в этой системе были проросшие семена A. thaliana (C3) и S. viridis (C4). (A и C) саженцы были неоднородны по отношению к стадии развития и лечения был применен после 11 d (арабидопсиса) или 7 d (Setaria). (B и D) корни растут прямо к питательные решения, облегчения добавления различных веществ и их усвоение. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что эта система предлагает оптимальные условия для роста растений и может использоваться эффективно выполнять широкий спектр анализов. Кроме того это гидропоники системы является очень полезным для широкомасштабных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта оптимизированная гидропонных структура позволяет культуры успешным в vitro растений. Семена прорастают на твердой питательной на плоской поверхности наконечник пипетки, значительный прирост по сравнению с системами, где семена замачивают с питательным раствором. Большим преимуществом этой системы является, что во время разработки Рассада, корни получить непосредственно в контакт с жидкой среды без необходимости передачи. Кроме того может применяться химическая обработка легко в жидкой среде уменьшение объема. Влажность держится высоко, избегая испарения питательного раствора и его пополнения. Кроме того можно легко получить однородную роста и развития при создании Рассада, и аэрации не требуется при работе с небольших резервуаров и саженцев на этой стадии развития1,10,18 . Для того, чтобы гарантировать, что система будет полностью свободен от загрязнений, важнейшим шагом является стерилизация любого используемого материала и интенсивной терапии во время его Ассамблеи. Из-за невозможности для стерилизации в автоклаве (например, одноразовые пластиковые коробки) некоторые компоненты настоятельно рекомендуется сначала очистить их с 70% этанола и затем применить короткий период УФ света перед использованием. По нашему опыту использование УФ-излучения, после запечатывания плоской поверхности с клейкой лентой и во время затвердевания средств массовой информации, также избегает бактериального и грибкового заражения. Кроме того будьте осторожны, чтобы не задеть СМИ, всегда Перемещение пипетки стойки на его боковой стороне.
Для обеспечения оптимального роста сеянцев, важно контролировать тесный контакт между твердых и жидких сред, обеспечивая полное погружение корни после прорастания семян. Твердый носитель должен быть адекватно плотной (10 г/Л агар) и полностью затвердевшим, так как не для разрыхления с плоской поверхности и плавают в питательный раствор. Помимо Arabidopsisэта система может использоваться для выращивания других видов растений, до тех пор, как семена достаточно мал, чтобы поместиться скважин квартиры. В этом смысле метод гидропоники, представленные здесь также было эффективным для выращивания Setaria зелёный, малого трава, которая недавно возникла как Роман модель системы для изучения C4 фотосинтеза, стресс биологии и другие черты культур биоэнергетики 55. подобно Arabidopsis, эта система позволяет производить равномерно растет саженцы Setaria с хорошей корневой системой и в больших масштабах (Дополнительные рис. 1), потому что каждый стойку поддерживает 96 семена, обеспечение Многие саженцы на биологических репликации и, следовательно, достаточно материала для множества приложений, ниже по течению. Большее количество реплицирует увеличивает эффективность статистических испытаний, ведет к более точных и надежных результатов в экспериментальных исследованиях56. Например используя рост палата с площадью только 1,5 м2, мы смогли 6000 проращивания одновременно, что позволяет выполнять временные кинетики реакции на нужное лечение. Кроме того, собранные образцы могут быть использованы для нескольких и взаимодополняющих «омику» анализирует, может потребовать большого количества ткани (например, immunoblotting). Эта гидропонных структура представляет особый интерес для группы, в целях анализа органов различных растений (например, корни и побеги), потому что он позволяет их легко и быстро разделения.
Небольшое количество исследований описано использование коробки наконечник пипетки в ходе разработки первоначального завода до передачи больше гидропонных танки11,20, и совсем недавно, очень похожая система использовалась для оценки аминокислот кислотный поглощения и транслокации в растения арабидопсис 5-недельных57. Протокол, описанные здесь обеспечивает дополнительные преимущества с точки зрения выращивания растений в стерильных условиях.
Хотя эта система была первоначально разработана для проращивания, он также могут быть пригодны для больше растений. В этом случае стоит отметить, что должны позаботиться о том, чтобы поместить семена более отдаленными друг от друга, чтобы избежать столько затенение как можно во время роста. Кроме того аэрации может быть введено в стойки для предотвращения гипоксии через один хорошо кончика пипетки плоская, широко распространенной проблемой в погруженной Arabidopsis корни растущих на более длительный срок. Ввиду их сидячими растения подвергаются несколько сортов абиотических и биотических стрессов, в зависимости от их окружающей среды. Таким образом учитывая цель исследования и стадии развития, было бы важно контролировать если растений, растущих в этой системы страдают от своего рода стресс.
Представленные здесь результаты показали, что эта гидропоники системы является весьма полезной для применения химических веществ в питательный раствор, особенно при работе с дорогими веществ, из-за небольшого количества стойки наконечник пипетки. Мы преуспели в использовании этой системы эффективно подавлять активность протеинкиназы TOR, АЗД-8055 и подтвердил, что фосфорилирование статус ее течению целевого RPS6 уже пострадавших после 30 минут применения лечения. Кроме того TOR ингибирование приводит к саженцев, содержащих более высокие уровни крахмал в течение дня и ночи по сравнению с управления саженцев. Такие анализы могут быть легко использованы распространить замечания, уже полученные с трансгенных линий, позволяя индуцибельной репрессии гена кодирования компонентов TOR комплекс, или любой другой путь интереса. Таким образом, предлагаемая гидропоники системы обладает многими преимуществами, потому что это очень легко и просто собрать, имеет низкую стоимость (основных компонентов дешевы и могут быть повторно использованы обширно), универсальный (включает изучение нетронутыми саженцы или отдельных тканей в конкретных или вдоль стадии развития растений) и масштабируемых (это позволяет выращивать огромное количество саженцев в очень небольшой площади).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана в Сан-Паулу исследовательский фонд (FAPESP; Предоставить 12/19561-0) и Общество Макса Планка. Элиас F. Араужо (FAPEMIG 14/30594), Каролина C. Монте Белло (FAPESP; Грант 10407/14-3), Валерия Mafra (FAPESP; Грант 14/07918-6), и благодарны за стипендии Вивиан C. H. да Силва (накидки/CNPEM 24/2013). Авторы благодарят Кристиан Мейер из Института Жан Пьер Bourgin (ИПРА, Версаль, Франция) за щедро предоставленные антител против RPS6. Авторы благодарят RTV UNICAMP и Эд Паулу Апареси́до де Соуза Маноэль за их техническую поддержку в ходе аудио записи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
