Summary
Un sistema idroponico semplice, versatile e a basso costo in vitro è stato ottimizzato con successo, consentendo esperimenti su vasta scala in condizioni sterili. Questo sistema facilita l'applicazione di prodotti chimici in una soluzione e loro efficiente assorbimento dalle radici per studi molecolari, biochimiche e fisiologiche.
Abstract
Una vasta gamma di studi in biologia vegetale vengono eseguite utilizzando colture idroponiche. In questo lavoro, un sistema in vitro crescita idroponica progettato per valutare le risposte della pianta ai prodotti chimici ed altre sostanze di interesse è presentato. Questo sistema è molto efficiente nell'ottenere piantine omogenee sani della C3 e C4 modello specie Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, rispettivamente. La coltura sterile evita alghe e contaminazione di microrganismi, che sono noti fattori limitanti per la normale crescita delle piante e lo sviluppo in coltura idroponica. Inoltre, questo sistema è scalabile, che permette la raccolta del materiale vegetale su larga scala con minori danni meccanici, come pure la raccolta di singole parti di una pianta se lo si desidera. Un protocollo dettagliato, dimostrando che questo sistema ha un montaggio facile e basso costo, in quanto utilizza pipetta rack come piattaforma principale per la coltivazione di piante, è fornito. La fattibilità di questo sistema è stata convalidata utilizzando piantine di Arabidopsis per valutare l'effetto del farmaco AZD-8055, un inibitore chimico del bersaglio della rapamicina (TOR) chinasi. L'inibizione di TOR è stato rilevato in modo efficiente più presto 30 min dopo un trattamento di AZD-8055 nelle radici e germogli. Inoltre, piante AZD-8055-trattati visualizzato il fenotipo di amido-eccesso previsto. Abbiamo proposto questo sistema idroponico come un metodo ideale per i ricercatori di impianto con l'obiettivo di monitorare l'azione della pianta induttori o inibitori, nonché valutare i cambiamenti continui metabolici utilizzando composti di marcatura a isotopi che, in generale, richiede l'uso di costosi reagenti.
Introduction
I vantaggi di usando la coltura idroponica coltivazione di piante sono state ampiamente riconosciuti nella produzione di impianti grandi e uniforme, consentendo esperimenti riproducibili1,2,3. In questo sistema, la composizione della soluzione nutritiva può essere adeguatamente controllata e riciclata lungo tutte le fasi della crescita delle piante e lo sviluppo. Inoltre, le radici non sono sottoposti a stress abiotici, come può accadere nelle piante coltivate in terreno, quali carenza di inedia e acqua nutriente4. Come piante coltivate idroponicamente presenti caratteristiche morfologiche e fisiologiche abbastanza simili a quelle coltivate in terreno, questo sistema è stato largamente impiegato nella ricerca perché permette il monitoraggio della crescita di radice/sparare e loro raccolta senza lesioni2,5.
Grazie alla possibilità di cambiare la composizione e la concentrazione della soluzione nutritiva, è stata eseguita la maggior parte della ricerca utilizzando condizioni idroponiche per caratterizzare le funzioni di micro - e macronutrienti1,3 ,6,7,8. Tuttavia, questo sistema ha dimostrato di essere molto utile per una vasta gamma di applicazioni in biologia vegetale, tali da delucidare le funzioni degli ormoni e sostanze chimiche nelle piante. Per esempio, la scoperta di strigolactones come una nuova classe di ormoni9 e il fenotipo di crescita accelerata innescato da Brassinosteroide applicazione10 sono stati effettuati in condizioni idroponiche. Inoltre, questo sistema permette di esperimenti con gli isotopi con etichettati (ad esempio, 14N /15N e 13CO2)11,12 per valutare la loro incorporazione in proteine e metaboliti mediante spettrometria di massa.
Considerando l'importanza di questo sistema nella ricerca della pianta, è stato progettato un elevato numero di colture idroponiche negli ultimi anni, compresi i sistemi che utilizzano (i) il trasferimento delle piantine da piastre a idroponici contenitori3, 13; (ii) rockwool che limita l'accesso agli stadi precoci della radice sviluppo2,14,15; (iii) Polietilene granulato come corpo galleggiante, che rende l'applicazione omogenea delle piccole molecole/trattamenti difficile16; o (iv) un ridotto numero di piante9,17. Il volume dei serbatoi idroponici descritto in molti di questi protocolli sono solitamente grandi (piccoli volumi che vanno da 1-5 L, fino a 32 L)18, che rende l'applicazione di sostanze chimiche estremamente costoso. Anche se alcuni studi descrivono una coltivazione idroponica sotto condizioni asettiche8,19, il montaggio dell'impianto è di solito abbastanza laborioso, costituito la perfetta regolazione di maglie di nylon in plastica o vetro contenitori5,8,17,20.
Data l'importanza di Arabidopsis thaliana come pianta modello, la maggior parte dei sistemi di coltura idroponica sono stata progettata per questa specie1,2,8,14,18, 19 , 20. Tuttavia, ci sono pochi studi che riferiscono le caratteristiche di crescita idroponica di altre specie di piante con un pretrattamento dei semi per migliorare la loro germinazione e sincronizzazione i tassi in vitro8,16 . Al fine di lavorare su larga scala, abbiamo sviluppato un protocollo per l'impostazione di un sistema idroponico di manutenzione semplice e a basso costo che consente condizioni di sterilità per la coltivazione di piante, tra cui a. thaliana e altre specie, come l'erba Setaria viridis. Il metodo qui descritto è adatto a diversi esperimenti, come la crescita del semenzale può essere ingrandita, sincronizzata e facilmente monitorata. Inoltre, questo sistema ha molti vantaggi come: (i) il suo montaggio è semplice e suoi componenti possono essere riutilizzati; (ii) permette la facile applicazione di diverse sostanze chimiche nel liquido di coltura; (iii) le piantine germinano e crescono direttamente nel terreno di coltura senza la necessità di transfert per il sistema di coltura idroponica; (iv) la crescita/sviluppo sparare e radice può essere strettamente sorvegliata e le piantine vengono raccolte senza danni; e (v) lo rende possibile lavorare su larga scala, mantenendo condizioni fisiologiche.
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Protocol
1. preparazione di terreni di coltura solidi e liquidi
- Preparare un terreno liquido usando mezzo di Murashige e Skoog (MS) di metà-forza con vitamine [0,0125 mg/L di cobalto (II) cloruro pentaidrato, 0,0125 mg/L di rame (II) solfato pentaidrato, 18,35 mg/L di acido etilendiamminotetraacetico ferrico di sodio, 3,10 mg/L di acido borico, 0,415 mg/L di ioduro di potassio, 8,45 mg/L di manganese solfato monoidrato, 0,125 mg/L di sodio molibdato diidrato, 4,30 mg/L di solfato di zinco eptaidrato, 166,01 mg/L di cloruro di calcio, 85 mg/L di potassio diidrogeno fosfato, 950 mg/L di nitrato di potassio, 90,27 mg/L di solfato di magnesio, 825 mg/L di nitrato di ammonio, 1 mg/L di glicina, 50 mg/L di myo-inositolo, 0,25 mg/L di acido nicotinico, 0,25 mg/L di piridossina cloridrato e 0,05 mg/L del cloridrato della tiamina] completati con 0,25 g/L di MES e regolare il pH a 5,8 con 10 M di KOH.
- Aggiungere 10 g/L di agar in modo da rendere un metà-forza MS-solido supporto. Sterilizzare in autoclave il mezzo a 121 ° C per 20 min prima dell'uso.
2. idroponico sistema montaggio
Nota: Questa procedura deve essere seguita meticolosamente per costruire il sistema idroponico.
-
Sterilizzazione del materiale
- Trasportare nella borsa autoclave la punta della pipetta rack (senza fodero) che verrà utilizzato come minitanks. Autoclave le cremagliere a 121 ° C per 20 min, 15 psi.
Nota: Il rack di punta di pipetta in polipropilene abbiamo utilizzato aveva le seguenti dimensioni: 120 mm (lunghezza) x 89 mm (larghezza) x 55 mm (altezza). La superficie piana del suggerimento di pipetta deve avere un'area per l'aggiunta di terreno di coltura. Altri scaffali di punta possono essere utilizzati (Vedi Tabella materiali).
Nota: Durante la procedura di assemblaggio del sistema idroponico, è necessario utilizzare una cappa a flusso laminare, che dovrà essere pulita e disinfettata prima di etanolo al 70% di utilizzare. Lo sperimentatore deve indossare un camice da laboratorio, lavarsi le mani e qualsiasi esposte della pelle e disinfettarle con etanolo al 70%. I guanti sono facoltativi, ad eccezione di applicazione della droga. - Pulire tutti gli accessori descritti sopra (scatole di plastica usa e getta, nastro adesivo, pipette, forbici e pinzette) con etanolo al 70% prima di entrare la cappa a flusso laminare. Se il cofano permette, accendere la luce UV per 10 min prima del montaggio del sistema idroponico per mantenere l'area di lavoro decontaminato.
- Trasportare nella borsa autoclave la punta della pipetta rack (senza fodero) che verrà utilizzato come minitanks. Autoclave le cremagliere a 121 ° C per 20 min, 15 psi.
-
Minitank montaggio
- Sigillare la superficie superiore della punta della pipetta con nastro adesivo (Figura 1B). Se possibile, lasciare sotto UV luce per 10 min.
- Aggiungere 180 µ l fuso solido MS del terreno di coltura (leggermente caldo) ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale (Figura 1).
Nota: Nella preparazione di molti carri armati, utilizzare una piastra riscaldante per impedire il mezzo di MS di solidificazione. - Consentire a solidificare completamente (per circa 30 min).
Nota: Durante il periodo di solidificazione, la luce UV può essere attivata. - Riempire la griglia di punta di pipetta completamente con terreno di coltura liquido MS (Figura 1) e garantire c'è stretto contatto tra il solido e i liquido media.
- Rimuovere il nastro adesivo della superficie superiore della punta della pipetta piatta e montarla sul rack con attenzione. Il sistema idroponico è ora pronto a ricevere i semi sterilizzati.
3. le sementi sterilizzazione
- Posto 500 semi di Arabidopsis in una microprovetta 1,5 mL. Utilizzare microprovette come necessario in base al numero di impianti necessari per l'esperimento.
- Lavare i semi con etanolo al 70% per 2 min con una movimentazione delicata. Lasciate che i semi stabilirsi, quindi rimuovere con cautela l'etanolo.
- Aggiungere 1 mL di una soluzione di ipoclorito di sodio 10% contenente 2 µ l di un detergente di polisorbato 20. Agitare la soluzione per 5 min, Rimuovi la soluzione con attenzione.
- Sciacquare i semi con acqua distillata sterile fino a quando tutto il residuo di candeggina è completamente rimosso (circa 5 volte).
Nota: Dopo la sterilizzazione superficiale, i semi sono stati immersi in acqua distillata sterile e stratificati a 4 ° C al buio per 5 d sincronizzare la germinazione.
Nota: Semi di Setaria viridis (adesione A10.1) sono state preincubate in acido solforico concentrato per 15 min (rompere la dormienza fisica), accuratamente lavati in acqua distillata sterile e quindi disinfestate con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 5% contenente 0,1% polisorbato 20 per 5 min con una movimentazione delicata21. I rimanenti passaggi di sterilizzazione erano identici a quelle descritte per semi di Arabidopsis .
4. seme applicazione
- Tagliare leggermente l'estremità di una punta di 200 µ l con l'ausilio di un bisturi sterile.
- Pipettare i semi di Arabidopsis in terreno di coltura solido sulla superficie superiore della punta della pipetta piatta. Fare attenzione che il mezzo non si allenta dall'appartamento; in caso contrario, i semi saranno ombreggiati e le piantine non crescerà correttamente (Figura 1E).
Nota: Utilizzare una pinzetta sterile per semi di Setaria (con l'embrione posizionato verso l'alto). - Memorizzare come molti minitanks possibili all'interno di una scatola di plastica usa e getta per mantenere un'elevata umidità e mantenere l'ambiente libero da microrganismi (Figura 1F).
- Sigillare la scatola di plastica usa e getta accuratamente con del nastro adesivo per evitare la contaminazione.
- Inserire i sistemi idroponici in una camera di crescita con le condizioni di crescita appropriata per l'impianto di interesse.
Nota: In questo lavoro, le seguenti condizioni sono state utilizzate: 75% di umidità e 150 µmol m-2 s-1 di irradianza ed equinoziale condizioni di luce 12h (21 ° C) / 12h scuro (19 ° C) per Arabidopsis, o 300 µmol m-2 s-1 di luce di irradianza e 12 h (28 ° C) / 12 ore di buio (25 ° C) per Setaria (Figura 1 e 1 H).
5. convalida l'uso di questo sistema idroponico per inibire il bersaglio della rapamicina chinasi
Nota: Questo sistema idroponico è stato inizialmente sviluppato per agevolare la gestione dei prodotti chimici per le piante, che, in generale, sono molto costosi da applicare negli esperimenti su larga scala. Come un proof of concept, l'inibitore competitivo ATP AZD-8055, che è conosciuto come destinazione in particolare il sito di legame di ATP di TOR proteina chinasi22, è stato impiegato per seguire la repressione di attività di TOR nei semenzali di a. thaliana Columbia-0 ( Il centro di Nottingham Arabidopsis Stock, nascita ID: N22681). Qui, il protocollo utilizzato è brevemente descritto.
- Crescere semi idroponica finché stadio 1.04 secondo il BBCH scala23 (per circa 11 d) condizioni climatiche sopra descritto. Sostituire l'elemento nutritivo, con fresca Media contenente 0,05% DMSO (controllo), 2 µM AZD-8055 (inibitore di TOR) diluito in DMSO, o senza trattamento (Lupetto), alla fine della notte (EN).
- Raccogliere alcune piantine in diversi momenti dopo il trattamento e separarli in radici e germogli. Congelare i campioni in azoto liquido, li pestava polvere finissima in un macinino robotico (Vedi Tabella materiali) e conservare la polvere a-80 ° C fino all'utilizzo.
- Immunoblot contro fosforilate e non-fosforilate forme di 40S proteina ribosomiale S6 (RPS6) secondo Dobrenel et al. 24.
- Candeggina intatti piantine per depigmentazione campione, lavarli in acqua distillata, immergerli in una soluzione di iodio per 5 min25e fotografare le piantine in un microscopio stereoscopico (0.63 X obiettivo, 20 x ravvicinamento e grandezza x 7,5) per un valutazione qualitativa del contenuto di amido.
- Quantificare l'amido seguendo la degradazione enzimatica e la misurazione del glucosio rilasciato spettrofotometricamente accoppiando alla riduzione del NADP+ a NADPH26,27.
- Eseguire un estrazione di RNA totale, una sintesi di cDNA e analisi di RT-PCR quantitative come descritto da Caldana et al. 28 per valutare il livello di espressione dei geni relazionati a diversi tipi di sollecitazioni.
- Facoltativamente, crescere piantine su un substrato di orticolo in vasi di plastica con una capacità di 0,1 L sotto condizioni climatiche simili [60% di umidità, 150 µmol m-2 s-1 di irradianza ed equinoziale condizioni di luce 12h (21 ° C) / 12h scuro (19 ° C )] al fine di confrontarli con i semenzali coltivati hydroponically.
Nota: I geni bersaglio utilizzati per le analisi di espressione genica sono stati ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), e TPS5 (At4g17770) ed i loro livelli di espressione sono stati normalizzati che impiegano il metodo delta-Ct29 utilizzando ACT2 (At3g18780) o PDF2 (At4g04890) come i geni di riferimento interno, supponendo che il 100% di efficienza di amplificazione di PCR attraverso tutti i campioni. Le coppie di oligonucleotidi utilizzate per la PCR quantitativa erano: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) e PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
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Representative Results
La chinasi di TOR è un regolatore importante che integra la segnalazione per promuovere la proliferazione delle cellule e la crescita in tutti gli eucarioti di energia e nutrienti. Gli sforzi per delucidare le funzioni TOR in piante includono la generazione di linee transgeniche di Arabidopsis contenente il repressione condizionale TOR attraverso interferenza del RNA o artificiale microRNA28,30,31, dato il fenotipo letale embrionale di TOR knockout piante32,33,34,35. La maggior parte delle linee transgeniche condizionale sono sotto il controllo di estradiolo-, desametasone-, o promotori inducibili dall'etanolo, che potrebbero anche fare uso di questo sistema idroponico.
Uno degli obiettivi dell'attività di TOR in Arabidopsis ben noti è la diretta fosforilazione della proteina ribosomale S6 chinasi (S6K)34,36,37,38. Al momento di fosforilazione, S6K ulteriormente fosforila la proteina ribosomiale S6 di 40S (RPS6), che interessano la proteina ribosomale traduzione24,39,40. Recentemente, è stato dimostrato che la fosforilazione di un sito di RPS6 Ser240 è un buon indicatore di TOR attività24. Analisi di immunoblotting ha confermato che presto dopo 30 min di somministrazione del farmaco, una diminuzione significativa nella fosforilazione Ser240 è stata osservata sia radici e germogli (Figura 2). Condizioni sperimentali utilizzate, AZD-8055 è anche indicato per essere un inibitore potente di TOR, che rapidamente reprime l'attività chinasica.
Linee transgeniche di Arabidopsis con una ridotta espressione del gene di TOR o componenti del complesso TOR presentano un fenotipo in eccesso di amido chiaro28,31. Analisi qualitativa dell'amido con soluzione di Lugol ha rivelato il modello previsto di accumulo di amido e di degradazione durante il ciclo di diel (Figura 3). Piantine che non hanno ricevuto un'applicazione di DMSO o AZD-8055 ha mostrato nessun maggiore accumulo di amido nelle loro foglie alla fine della notte (EN), e l'accumulo di amido negli impianti di controllo (che ha ricevuto 0,05% DMSO) era coerenza con la letteratura 41 , 42. Inoltre, piante trattate con AZD-8055 ha presentato una maggiore quantità di amido rimanente al EN rispetto ad i semenzali di controllo. Questi risultati hanno indicato l'utilità del sistema idroponico proposto nella coltivazione di piantine che imita condizioni fisiologiche. Questo sistema abilitato anche la conferma del fenotipo in eccesso amido tipico di una repressione del TOR componenti complessi24,28,31.
Contenuto di amido è stata misurata anche con precisione utilizzando una metodologia sensibile, dimostrando che il trattamento di AZD-8055 portava a semenzali che contengono i livelli elevati significativamente di amido entrambe alla fine della giornata (ED) ed EN rispetto al controllo di DMSO-trattati piante (Figura 4). Amido si accumula nelle foglie durante il giorno e si costeggiano durante la notte per sostenere l'attività metabolica, principalmente la respirazione e l'esportazione continua di saccarosio per altre pianta organi41,42. In condizioni normali, solo una piccola frazione di amido (tra 5% e il 10% dell'importo al momento del de) rimane a EN43,44,45. Questi risultati attestano che l'amido in eccesso fenotipo osservato sotto la repressione di TOR si verifica in tutto il ciclo di diel.
Piante hydroponically sviluppate sono state confrontate alle piantine coltivate in un substrato orticolo in condizioni climatiche molto simili riguardo l'espressione livello del fattore elemento-legante acido abscissico-reattivo 3 (ABF3) gene (Figura 5A ), che direttamente correla con interno livelli ABA, una classe di ormoni ampiamente conosciuto come un marcatore dovuto il relativo ruolo in più stress abiotici risposte46,47,48. Anche se piantine coltivate in sistema idroponico hanno presentato un aumento significativo del livello di ABF3, l'espressione di asparagina sintasi 1 (ASN1) non è stata colpita dai trattamenti di DMSO o AZD (figura 5B). Tuttavia, trealosio fosfato sintasi 5 (TPS5) è stata aumentata significativamente dopo 8 h di inibizione di TOR (figura 5B). ASN1 e TPS5 rispondere a bassa e alta zucchero livelli49,50,51,52,53,54, rispettivamente, suggerendo che queste piante non stavano vivendo energico sforzo.
Figura 1 : Flusso di lavoro per l'assemblaggio del sistema idroponico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Effetto di inibizione di TOR sulla fosforilazione di RPS6 in diversi tessuti di Arabidopsis thaliana . Immunoblotting dimostra l'abbondanza della RPS6 totale e fosforilata nella directory principale (A) e (B) sparare estratti delle piantine trattati con 2 µM AZD-8055 o 0,05% DMSO (controllo). I valori rappresentano i rapporti normalizzati dalla proteina non-fosforilate RPS6. Anticorpo anti-actina è stato usato come un controllo di carico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Arabidopsis thaliana piantine macchiato con reattivo di Lugol. Trattamenti con 2 µM AZD-8055 o 0,05% DMSO (controllo) erano applicati all'EN (freccia rossa) e rispetto per deridere piantine (no--trattamento). I semenzali sono state raccolte prima dell'applicazione del trattamento (0 h) e a 12 h (ED) e 24 h (EN) dopo il trattamento, indicati da frecce nere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Effetto di inibizione di TOR sul contenuto di amido di Arabidopsis thaliana piantine. Amido è stata misurata enzimaticamente prima (0 h) e a 12 h (ED) o 24 h (EN) dopo il trattamento con 2 µM AZD-8055 (nero) o 0.05% DMSO (controllo, bianco). I valori riportati sono la media ± errore standard (SE) (n = 4). Differenze significative tra piantine trattati con AZD-8055 e DMSO, utilizzo di Student t-test, sono indicati da un asterisco: * (P < 0,05) e * * * (P < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Livello di espressione dei geni correlati allo stress. (A) confronto delle trascrizioni di ABF3 in idroponica e substrato-cresciuto Col-0 piantine di Arabidopsis . (B) confronto delle trascrizioni ASN1 e TPS5 nei semenzali di Arabidopsis trattati con 2 µM AZD-8055 e 0.05% DMSO. I livelli di espressione normalizzato sono indicati come 2^(-dCt). I valori riportati sono la media ± SE (n = 3). Differenze significative, utilizzando di Student t-test, sono indicati da un asterisco: * * * (P < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare Figura 1:questo in vitro sistema idroponico rende possibile sincronizzare germinazione e ottenere piantine omogenee. Semi di a. thaliana (C3) e S. viridis (C4) furono fatti germinare direttamente in questo sistema. (A e C) i semenzali sono stati omogenei in relazione alla fase di sviluppo e il trattamento è stato applicato dopo 11 d (Arabidopsis) o 7D (Setaria). (B e D) le radici si sviluppano direttamente verso la soluzione nutritiva, facilitando l'aggiunta di sostanze diverse e il loro assorbimento. Questi risultati indicano fortemente che questo sistema offre un ambiente ottimale per la crescita delle piante e può essere utilizzato per eseguire in modo efficiente un'ampia gamma di dosaggi. Inoltre, questo sistema idroponico è molto utile per gli esperimenti su larga scala.
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Discussion
Questa struttura di idroponica ottimizzata permette la cultura di successo in vitro di piante. Semi germinano bene sul mezzo solido alla superficie piana della punta di pipetta, un guadagno considerevole rispetto ai sistemi dove semi siano imbevuti di soluzione nutritiva. Un grande vantaggio di questo sistema è che durante lo sviluppo del semenzale, radici ottenere direttamente a contatto con il liquido di coltura senza la necessità di transfert. Inoltre, trattamento chimico può applicarsi facilmente nel liquido di coltura in un volume ridotto. Umidità è mantenuta elevata, evitando l'evaporazione della soluzione nutritiva e sua ricostituzione. Inoltre, la crescita omogenea e sviluppo durante l'istituzione del semenzale può essere facilmente ottenuto, e l'aerazione non è necessaria quando si lavora con piccoli serbatoi e piantine a questo stadio di sviluppo1,10,18 . Al fine di garantire che il sistema sarà completamente libero da contaminanti, un passaggio fondamentale è la sterilizzazione di ogni materiale utilizzato e terapia intensiva durante la sua Assemblea. A causa dell'impossibilità di sterilizzare alcuni componenti in autoclave (per esempio, scatole di plastica usa e getta), è consigliabile prima di eliminarle con etanolo al 70% e quindi applicare un breve periodo di UV luce prima dell'uso. Nella nostra esperienza, l'uso della luce UV, sigillando la superficie piana con nastro adesivo e durante la solidificazione di media, inoltre evita la contaminazione batterica e fungina. Inoltre, essere prestando attenzione a non toccare i media, sempre in movimento le cremagliere di pipetta al suo fianco laterale.
Per assicurare la crescita ottima dei semenzali, che è importante monitorare lo stretto contatto tra i media solidi e liquidi, garantendo la completa immersione delle radici dopo la germinazione del seme. Il mezzo solido deve essere adeguatamente denso (agar 10 g/L) e completamente solidificata per non allentare dalla superficie piatta e galleggiare nella soluzione nutritiva. Oltre a Arabidopsis, questo sistema utilizzabile per la coltivazione di altre specie vegetali, come i semi sono abbastanza piccoli adattarsi i pozzi dell'appartamento. In questo senso, il metodo idroponico presentato qui è stato anche efficiente per la coltivazione di Setaria viridis, una piccola erba che recentemente è emerso come un sistema di modello di romanzo per Studio C4 fotosintesi, biologia dello stress ed altri tratti di raccolto di bioenergia 55. simile a Arabidopsis, questo sistema consente di produrre piantine di Setaria uniformemente crescente con un buon sistema di root e su larga scala (complementare Figura 1), perché ogni rack supporta 96 semi, garantendo molte piantine per replicare biologici e, di conseguenza, materiale sufficiente per una miriade di applicazioni a valle. Un numero maggiore di ripetizioni aumenta l'efficienza del test statistici, portando a risultati più accurati e affidabili in studi sperimentali56. Ad esempio, utilizzando una camera di crescita con una superficie di soli 1,5 m2, siamo riusciti a crescere 6.000 piantine contemporaneamente, rendendo possibile effettuare temporale cinetica della risposta a un trattamento desiderato. Inoltre, i campioni raccolti possono essere utilizzati per molteplici e complementari 'omics' analizza che può richiedere una grande quantità di tessuto (ad es., immunoblotting). Questa struttura di idroponica è di particolare interesse per i gruppi con l'obiettivo di analizzare gli organi di piante distinte (per esempio, radici e germogli), perché consente loro separazione facile e veloce.
Un piccolo numero di studi ha descritto l'uso di scatole di tip pipetta durante lo sviluppo di pianta iniziale prima di un trasferimento a più grandi serbatoi idroponici11,20, e più recentemente, un sistema molto simile è stato usato per valutare l'amminico acido assorbimento e traslocazione in 5 week-old Arabidopsis piante57. Il protocollo descritto qui offre ulteriori vantaggi in termini di coltivare le piante in condizioni di sterilità.
Anche se questo sistema è stato inizialmente sviluppato per coltivare piantine, potrebbe anche essere adatto per impianti più grandi. In questo scenario, vale la pena ricordare che si deve prestare attenzione a mettere i semi più distanti tra loro per evitare tanto ombreggiatura possibile durante la crescita. Inoltre, l'aerazione può essere introdotto nel rack per evitare ipossia attraverso un pozzetto di piatto, la punta della pipetta un problema comune nel sommerso Arabidopsis radici che crescono per periodi più lunghi. Dovuto la loro natura sessile, impianti sono sottoposti a diversi tipi di stress abiotici e biotici, a seconda del loro ambiente circostante. Pertanto, considerando l'obiettivo dello studio e lo stadio di sviluppo, potrebbe essere importante monitorare se le piante che crescono in questo sistema sono affetti da qualche tipo di stress.
I risultati presentati qui hanno dimostrato che questo sistema idroponico è molto utile per l'applicazione di prodotti chimici per la soluzione nutritiva, soprattutto quando si lavora con sostanze costosi, a causa del ridotto volume d'i rack di punta della pipetta. Abbiamo riuscito nell'utilizzo di questo sistema per reprimere efficacemente l'attività della chinasi di TOR da AZD-8055 e confermato che lo stato di fosforilazione del relativo obiettivo a valle RPS6 è già interessato dopo 30 min di applicazione del trattamento. Inoltre, l'inibizione di TOR conduce a semenzali che contengono i livelli elevati di amido durante il giorno e la notte in confronto i semenzali di controllo. Tali dosaggi possono essere facilmente impiegati per estendere le osservazioni già ottenute con linee transgeniche, permettendo una repressione viscoelastica dei componenti gene codificante del TOR complessi, o qualsiasi altro percorso di interesse. In sintesi, il sistema idroponico proposto possiede molti vantaggi perché è molto facile e semplice da montare, ha un basso costo (i componenti principali sono economici e possono essere ampiamente riutilizzati), è versatile (permette lo studio di intatti piantine o di tessuti distinti nello specifico o lungo le fasi di sviluppo di pianta) ed è altamente scalabile (permette la coltivazione di un numero enorme di semenzali in un'area molto piccola).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di ricerca di São Paulo (FAPESP; Concedere 12/19561-0) e la società Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e vi sono grati per le borse di Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013). Gli autori ringraziano Christian Meyer dall'Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Francia) per generosamente fornendo anticorpi contro RPS6. Gli autori ringraziano RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza per il loro supporto tecnico durante l'audio registrazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
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