Summary
Basit, çok yönlü ve düşük maliyetli vitro hydroponic sistemi başarılı bir şekilde, Steril koşullar altında büyük ölçekli deneyler etkinleştirme optimize edildi. Bu sistem bir çözüm ve moleküler, biyokimyasal ve fizyolojik çalışmalar için kökleri tarafından verimli kendi emilimi kimyasal uygulama kolaylaştırır.
Abstract
Çok çeşitli bitki biyoloji çalışmalarda hydroponic kültürler kullanarak gerçekleştirilir. Bu çalışmada, bir vitro hydroponic büyüme sistemi bitki yanıt kimyasallar ve diğer maddelerin ilgi değerlendirmek için tasarlanmış sunulmaktadır. Bu sistem sırasıyla C3 ve C4 modeli tür Arabidopsis thaliana ve Setaria viridis, homojen ve sağlıklı fide elde etmek son derece etkilidir. Steril ekimi yosun ve mikroorganizma kirlenme, normal büyüme ve Kalkınma suda sınırlayan faktörler bilinen önler. Ayrıca, bu sistem bitki materyali ufak mekanik hasar ile büyük bir ölçekte hasat, hem de tek tek parçaları bir bitkinin hasat istenirse etkinleştirme ölçeklenebilir yapıdadır. Bu pipet rafları için büyüyen bitkiler, ana platformu olarak kullanır gibi bu sistemi kolay ve düşük maliyetli bir derleme, sahip olduğunu gösteren ayrıntılı bir protokol sağlanır. Bu sistemin fizibilite uyuşturucu AZD-8055, rapamycin (TOR) kinaz hedefinin kimyasal bir önleyici etkisini değerlendirmek için Arabidopsis fidan kullanılarak doğrulandı. TOR inhibisyon verimli roots ve shoots bir AZD-8055 tedavi sonrası erken 30 dk olarak algılandı. Ayrıca, AZD 8055 tedavi bitkiler beklenen nişasta-aşırı fenotip görüntülenir. Biz metabolik Cereyanlar, genel olarak, pahalı kullanımını gerektirir izotop etiketleme bileşikleri kullanarak değerlendirmek için bitki indükleyicileri veya inhibitörleri, de eylem izlemek için amaçlayan bitki araştırmacılar için ideal bir yöntem olarak bu hydroponic sistemi önerilen reaktifler.
Introduction
Büyüyen bitkiler hydroponics kullanarak avantajları büyük ve düzgün bitkiler, tekrarlanabilir deneyleri1,2,3etkinleştirme üretiminde yaygın olarak kabul edilmiştir. Bu sistemde besin çözüm bileşimi olabilir düzgün kontrollü ve bitki büyüme ve gelişmesi tüm aşamaları geri dönüştürülmüş. Ayrıca, kökleri için abiyotik stresleri, toprak-yetiştirilen bitkiler, besin açlık ve su eksikliği4gibi olabilir tabi değil. Kök/ateş büyüme ve onların olmadan hasat izlenmesi verdiğinden hydroponically mevcut morfolojik ve fizyolojik özellikleri oldukça benzeyen kültürlü toprakta yetişen bitkiler bu sistem geniş araştırma istihdam edilmiştir yaralanma2,5.
Kompozisyon ve besin çözüm konsantrasyonu değiştirme olasılığı nedeniyle, hydroponic koşullar kullanarak araştırma çoğunu gerçekleştirilen mikro - macronutrients1,ve3 işlevleri tanımlamak için ,6,7,8. Ancak, bu sistem çok geniş bir bitki biyolojisi, hormonlar ve kimyasallar bitkilerde işlevleri aydınlatmak gibi uygulamalarda yararlı olduğunu kanıtlamıştır. Örneğin, strigolactones, hormonlar9 ve brassinosteroid uygulama10 tarafından tetiklenen hızlandırılmış büyüme fenotip yeni bir sınıf olarak keşfi hydroponic koşullar altında gerçekleştirilen. Ayrıca, bu sistem ile etiketlenmiş izotoplar deneyler sağlar (Örneğin, 14N /15N ve 13CO2) protein ve metabolitleri içine onların birleşme değerlendirmek için11,12 Kütle spektrometresi tarafından.
Bu sistemde bitki araştırmaları önemi göz önüne alındığında, hydroponic kültürler yüksek sayıda tasarlanmıştır (i) aktarım hydroponic konteyner3, için plakalar üzerinden fidan kullanan sistemler dahil olmak üzere son birkaç yıl içinde 13; (ii) kök gelişimi2,14,15erken dönemlerinde erişimi sınırlar Taşyünü; (iii) Polietilen granül küçük moleküller/bakımları zor16homojen uygulama yapar kayan gövdesi olarak; veya (iv) azaltılmış bir numarası bitkiler9,17. Bu protokoller çoğunda açıklanan hydroponic tank hacmi genellikle büyük (1-5 L--dan 32 L kadar değişen küçük birimler)18kimyasalların uygulanması son derece pahalı hale getirir,. Her ne kadar birkaç çalışmalar aseptik koşullar8,altında bir hydroponic ekimi tarif19, sistem derleme genellikle oldukça zahmetli, naylon kafesler içine plastik ya da cam mükemmel uyum oluşan Konteyner5,8,17,20.
Bir modeli tesisi olarak Arabidopsis thaliana önemi nedeniyle, bu tür1,2,8,14,için18, hidroponik sistemleri çoğunluğu tasarlanmıştır 19 , 20. Bununla birlikte, birkaç çalışma raporlama onların çimlenme geliştirmek için tohumları Önarıtma ile diğer bitki türlerinin hydroponic büyüme özellikleri vardır ve eşitleme oranları vitro8,16 . A. thaliana ve ot Setaria gibi diğer türler de dahil olmak üzere bitki yetiştirme için steril koşullar sağlayan bir basit ve düşük maliyetli bakım hydroponic sistemi kurma için bir protokol geliştirdiğimiz büyük ölçüde çalışmak için viridis. Fide büyüme ekranı, senkronize ve kolayca takip gibi yöntem tanımlamak burada farklı deneyler için uygundur. Ayrıca, bu sistem olarak pek çok avantajı vardır: (i) onun derleme basittir ve bileşenlerini yeniden kullanılabilir; (ii) Bu sıvı orta içine farklı kimyasal uygulama kolaylığı sağlar; (iii) fidan çimlenme ve doğrudan kültür orta aktarım, gerek kalmadan hidroponik sistem büyümek; (iv çekim ve kök gelişimi/büyüme yakından nezaret etmek ve fidan hasar hasat; ve (v) bu mümkün kılan büyük ölçüde, çalışmak fizyolojik şartlarda sürdürmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sıvı ve katı Kültür medya hazırlanması
- Yarı güçte Murashige ve Skoog (MS) orta vitaminleri ile [0.0125 mg/L cobalt(II) klorür pentahydrate, 0.0125 mg/L copper(II) sülfat pentahydrate, 18,35 mg/L ethylenediaminetetraacetate ferrik sodyum, 3.10 mg/L kullanarak sıvı bir ortam hazırlamak Borik asit, potasyum iyodür, 8,45 mg/L manganez 0.415 mg/L sülfat monohidrat, 0,125 mg/L sodyum molibdat dihydrate, 4.30 mg/L çinko sülfat heptahydrate, 166.01 mg/L kalsiyum klorür, potasyum dihydrogen fosfat, 950 mg/L 85 mg/L Potasyum nitrat, magnezyum sülfat 90.27 mg/L, 825 mg/L amonyum nitrat, 1 mg/L glisin, 50 mg/L myo-inositol, 0.25 mg/L, Nikotinik asit, 0.25 mg/L piridoksin hidroklorür ve 0,05 mg/L tiamin hidroklorür] 0, 25 g/L ile desteklenmiş MES ve pH 10 M KOH ile 5.8 için ayarlayın.
- 10 g/L agar yarı güçte MS-katı orta yapmak için ekleyin. Otoklav kullanmadan 20 dk önce için 121 ° C'de orta.
2. hydroponic sistemi montajı
Not: Aşağıdaki adımları titizlikle hydroponic sistemi oluşturmak için takip edilmelidir.
-
Malzeme sterilizasyon
- Otoklav çantada pipet ucu minitanks kullanılacak raflar (olmadan kapakları) paketi. Otoklav 20 dk, 15 psi için 121 ° C'de rafları.
Not: Aşağıdaki boyutları biz kullanılan polipropilen pipet ucu raf vardı: 120 mm (uzunluk) x 89 mm (genişlik) x 55 mm (yükseklik). Pipet ucu düz bir yüzeye kültür orta eklenmesi için bir alan olması gerekir. Diğer ipucu raflar kullanılabilir ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: hydroponic sistemi montaj prosedürü bu temizlenmiş ve dezenfekte kullanmadan ile % 70 etanol önce bir laminar akış başlık kullanmak gereklidir. Deneyci bir laboratuar önlüğü giyiyorsun, ellerini yıkamak ve herhangi maruz deri ve onları % 70 etanol ile dezenfekte. Eldiven ilaç uygulama dışında isteğe bağlı bulunmaktadır. - (Tek kullanımlık plastik kutular, yapışkan bant, pipetler, makas ve cımbız) % 70 etanol ile laminar akış hood girmeden önce açıklanan tüm aksesuarları temiz. Kukuleta izin veriyorsa, hydroponic sistemi çalışma alanının dekontamine tutmak için montaj öncesinde 10 min için UV ışığı açın.
- Otoklav çantada pipet ucu minitanks kullanılacak raflar (olmadan kapakları) paketi. Otoklav 20 dk, 15 psi için 121 ° C'de rafları.
-
Montaj minitank
- Pipet Ucu yapışkan bant (Şekil 1B) ile düz üst yüzeyi kapatın. Mümkünse, UV altında 10 dakikadır açık bırakın.
- Erimiş katı MS kültür orta (hafif sıcak) 180 µL her şey çok kanallı pipet (Şekil 1 c) kullanarak ekleyin.
Not: birçok tankları hazırlanırken, bir Pinar güçlendirilerek üzerinden MS orta engellemek için kullanın. - Orta tamamen (yaklaşık 30 dk için) kuvvetlendirmek için izin.
Not: katılaşma süresi boyunca, UV ışığı açılabilir. - Pipet Ucu raf tamamen sıvı MS kültür orta (Şekil 1 d) ile doldurmak ve yakın temas katı ve sıvı medya arasında olduğundan emin olun.
- Pipet ucu düz üst yüzeyi yapışkan bantlar kaldırmak ve rafa dikkatli bir şekilde uygun. Hydroponic sistemi artık steril tohum almak hazırdır.
3. tohum sterilizasyon
- 500 Arabidopsis tohum bir 1.5 mL microtube yerleştirin. Deney için gerekli tesisleri sayısına göre gerektiği gibi çok mikrotüpler kullanın.
- Nazik bir ajitasyon ile 2 min için % 70 etanol ile tohum yıkayın. Tohumlar sakin, sonra etanol dikkatli bir şekilde çıkarın izin.
- 1 mL 2 µL polysorbate 20 deterjan içeren bir % 10 sodyum hipoklorit çözeltisi ekleyin. 5 dk. Kaldır için çözüm çözüm dikkatli bir şekilde tahrik.
- Tüm çamaşır suyu kalıntı tamamen (yaklaşık 5 x) kaldırılıncaya kadar tohum steril distile su ile durulayın.
Not: yüzey Sterilizasyon sonra tohumlar steril distile su içinde dalmış ve çimlenme eşitlemek 5 d için karanlıkta 4 ° C'de tabakalı.
Not: Setaria viridis (katılım A10.1) tohumları konsantre sülfürik asit (fiziksel uyuşukluk kırmak) 15 dakika içinde preincubated, steril distile suda iyice yıkanır ve sonra % 5 sodyum hipoklorit çözümle disinfested % 0.1 polysorbate 20 nazik ajitasyon21ile 5 min için içeren. Kalan sterilizasyon adımları için Arabidopsis tohumlar açıklananlara aynıydı.
4. tohum uygulama
- 200 µL bahşiş ekstremite steril neşter yardımıyla hafifçe kesilmiş.
- Pipet ucu düz üst yüzeyi sağlam kültür orta içine Arabidopsis tohum pipette. Orta düz--dan gevşetin değil dikkat çekmek; Aksi takdirde, tohum gölgeli olacak ve fidan düzgün genişleyemez (Şekil 1E).
Not: (yukarı doğru konumlandırılmış embriyo ile) Setaria tohumlar için steril bir cımbız kullanın. - Yüksek nem korumak ve çevrenin mikroorganizmalar (1F rakam) ücretsiz tutmak için tek kullanımlık plastik kutu içinde mümkün olduğunca çok sayıda minitanks saklayın.
- İyice kirlenmesini önlemek için yapışkan bant kullanarak tek kullanımlık plastik kutu mühür.
- Hydroponic sistemleri faiz bitki için uygun büyüme şartları ile bir büyüme odasına koyun.
Not: Bu çalışmada, aşağıdaki koşullar kullanılmıştır: nem oranı % 75 ve 150 µmol m-2 s-1 olma ve Arabidopsisequinoctial koşulları 12 h ışık (21 ° C) / 12 h karanlık (19 ° C) veya 300 µmol m-2 s-1 , olma ve 12 h ışık (28 ° C) / 12 h karanlık (25 ° C) Setaria (Şekil 1G ve 1 H) için.
5. hedef Rapamycin kinaz etkisizleştirmek için bu Hydroponic sistemi doğrulanıyor
Not: Bu hydroponic sistemi başlangıçta bitkiler, genel olarak, çok büyük ölçekli deneyler uygulanması pahalıdır kimyasal yönetimini kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Kavramının bir kanıtı olarak, ATP rekabetçi inhibitörü AZD-8055, özellikle ATP bağlama sitesi TOR protein kinaz22hedef bilinmektedir, A. thaliana Columbia-0 (fidan faaliyete TOR baskı takip etmek istihdam edildi Nottingham Arabidopsis stok Merkezi, NASC ID: N22681). Burada, kullanılan iletişim kuralı kısaca açıklanmıştır.
- Sahne 1,04 BBCH göre ölçekli kadar23 (için yaklaşık 11 d) tohumları hydroponically yukarıda açıklanan iklim koşulları altında büyümeye. Besin çözüm, ya da taze orta içeren % 0.05 DMSO (kontrol), 2 µM ile yerine AZD-8055 (TOR inhibitörü) DMSO, veya tedavi (sahte), geceler (tr) sonunda seyreltilmiş.
- Tedavi sonrası bazı fidan farklı zaman noktalarda hasat veya roots ve shoots ayırabilirsiniz. Sıvı azot örnekleri olduğun yerde kal, robot bir değirmeni ince bir toz için eziyet (bkz. Tablo reçetesi) ve toz-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
- Immunoblot karşı fosforile ve sigara fosforile formlara 40'lı ribozomal protein S6 (RPS6) göre Dobrenel vd. 24.
- Örnek depigmentasyon için sağlam fidan çamaşır suyu, onları distile suda yıkayın, iyot çözümünü 5 dk25için onları bırakın ve bir stereomicroscope (0,63 X amaç, 20 x yaklaşım ve 7,5 x büyüklüğü) fidan için fotoğraf bir Nişasta içeriği nitel değerlendirilmesi.
- Enzimatik bozulması ve yayımlanan glikoz ölçüm spectrophotometrically NADPH26,27NADP+ azaltılması için kaplin tarafından takip nişasta ölçmek.
- Toplam RNA ayıklama, cDNA sentezi ve kantitatif RT-PCR deneyleri Caldana vd tarafından tanımlandığı gibi gerçekleştirmek gerilmeler farklı türde için ilgili genlerin ifade düzeyini değerlendirmek için, 28 .
- İsteğe bağlı olarak, fidan benzer iklim koşulları [% 60 nem, 150 µmol m-2 s-1 olma ve equinoctial koşulları 12 h ışık (21 ° C) / 12 h karanlık (19 ° C altında 0.1 kapasite ile plastik tencere bahçıvanlıkla ilgili bir substrat olarak büyümek )] bunları hydroponically büyüyen fidan ile karşılaştırmak için.
Not: ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), gen ifade deneyleri için kullanılan hedef genlerin vardı ve TPS5 (At4g17770) ve ifade seviyelerine kullanarak delta-Ct yöntemi29 istihdam normalleştirilmiş ACT2 (At3g18780) veya PCR güçlendirme verimliliği % 100'ünü tüm örnekler üzerindeki varsayarak PDF2 (At4g04890) iç başvuru genler olarak. Kantitatif PCR için kullanılan oligonükleotid çifti vardı: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) ve PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TOR kinaz besin ve enerji hücre çoğalması ve büyüme tüm ökaryotlarda tanıtmak sinyal entegre büyük bir düzenleyicisidir. Çabaları TOR işlevleri tesislerinde aydınlatmak için TOR koşullu baskı RNA müdahale veya yapay mikroRNA28,30,31aracılığıyla içeren Arabidopsis transgenik satırların nesil içerir, embriyo öldürücü fenotip TOR nakavt bitkiler32,33,34,35verilen. Koşullu transgenik satırları çoğu, estradiol-, kontrol altında deksametazon veya olmasını da sağlayabilir etanol indüklenebilir rehberleri bu hydroponic sistemi kullanın.
Doğrudan fosforilasyon ribozomal protein S6 kinaz (S6K)34,36,37,38 Arabidopsis faaliyete TOR tanınmış hedeflerinden biridir. Fosforilasyon, 40'lı ribozomal protein S6 S6K daha fazla phosphorylates (RPS6), ribozomal protein çeviri24,39,40etkileyen. Son zamanlarda, bir RPS6 Ser240 sitesi fosforilasyon TOR etkinlik24iyi bir işaretleyicidir kanıtlanmıştır. Immunoblotting deneyleri ilaç idaresi yakında 30 dk sonra kökler ve shoots (Şekil 2) Ser240 fosforilasyon önemli bir azalma gözlenmiştir doğruladı. Kullanılan deneysel koşullarda AZD-8055 da hızla kendi kinaz aktivitesi represses güçlü bir TOR inhibitörü olarak göstermiştir.
Transgenik Arabidopsis hatları TOR gen azaltılmış bir ifade veya TOR karmaşık bileşenleri ile bir açık nişasta aşırı fenotip28,31mevcut. Kalitatif analiz Lugol'ın çözüm kullanarak nişasta nişasta birikimi ve yıkımı sırasında diel döngüsü (Şekil 3) beklenen deseni ortaya koydu. Did değil almak bir uygulama DMSO veya AZD-8055 fidan nişasta büyük hiçbir birikimi onların yapraklarda (tr) gecenin sonunda gösterdi ve nişasta birikimi (hangi % 0.05 DMSO alınan) denetim tesislerinde edebiyat ile tutarlı 41 , 42. Ayrıca, kalan nişasta daha büyük bir miktarı kontrol fidan karşılaştırıldığında en AZD-8055 ile tedavi bitkiler sundu. Bu sonuçlar fizyolojik şartlarda taklit eden fidan büyüyen önerilen hydroponic sistemi kullanışlılığı belirtti. Bu sistem ayrıca nişasta aşırı fenotip TOR karmaşık bileşenleri24,28,31bir baskı tipik onay etkin.
Nişasta içeriği de doğru AZD-8055 tedavi nişasta anlamlı olarak daha yüksek düzeyde içeren her iki gün (ED) sonunda fidan yol gösteren hassas bir metodoloji kullanarak ölçülen ve tr DMSO tedavi kontrol ile karşılaştırıldığında bitkiler (Şekil 4). Nişasta yapraklarında gündüzleri birikir ve gecede metabolik aktivite, esas olarak solunum ve diğer bitki organları41,42sükroz sürekli ihracatı sürdürmek için remobilized. Normal şartlar altında nişasta (%5 ve ED olarak yüzde 10'u arasında) sadece küçük bir kısmını tr43,44,45, kalır. Bu sonuçlar aşırı fenotip TOR baskı altında gözlenen nişasta tüm diel döngüsü üzerinde ortaya çıkar karşımıza.
Hydroponically bitkilerin bahçıvanlıkla ilgili bir substrat ifade ile ilgili çok benzer iklim koşulları altında 3 (ABF3) gen (Şekil 5A Absisik asit-yanıt veren öğe bağlama faktör düzeyi yetiştirilen Fideler karşılaştırıldı ), hangi doğrudan iç ile ilişkilendirir ABA düzeyleri, bir sınıfın birden çok abiyotik stres yanıt46,47,48rolü nedeniyle bir işaretleyici olarak yaygın olarak bilinen hormonlar. Hydroponic sistemi yetiştirilen Fideler ABF3düzeyde önemli bir artış mevcut rağmen asparagine synthase 1 ifadesi (ASN1) DMSO veya AZD tedaviler (Şekil 5B) tarafından etkilenen değil. Ancak, trehalose fosfat synthase 5 (TPS5) önemli ölçüde TOR inhibisyon (Şekil 5B) 8 h sonra artış oldu. ASN1 ve TPS5 düşündüren düşük ve yüksek şeker düzeyleri49,50,51,52,53,54, sırasıyla, yanıt Bu bitkiler enerjik stres yaşıyor yok ki.
Resim 1 : Hydroponic sistemi hazırlamak için iş akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Üzerinde farklı dokuların RPS6 fosforilasyon TOR etkisi Arabidopsis thaliana . (B) ateş özleri fidan ile 2 µM AZD-8055 veya % 0.05 DMSO (kontrol) tedavi ve Immunoblotting toplam ve fosforile RPS6 bolluk(a)kök gösterir. Değerleri normalleştirilmiş sigara fosforile protein tarafından RPS6 oranları temsil eder. Anti-aktin antikor yükleme denetimi olarak kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Arabidopsis thaliana fidan'ın Lugol reaktifi ile lekeli. Tedaviler ile 2 µM AZD-8055 veya % 0.05 DMSO (kontrol) tr (kırmızı ok) uygulanan ve fidan (no-tedavi) alay kıyasla. Fidan tedavi uygulama (0 h) önce hasat ve 12 h (ED) ve 24 h (tr) tedavi sonra siyah oklarla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Nişasta içeriği üzerinde TOR etkisi Arabidopsis thaliana fidan. Nişasta enzimatik (0 h önce) ölçülen ve 12 h (ED), veya 24 h (tr) 2 µM ile tedavi sonrası AZD-8055 (siyah) veya % 0.05 DMSO (kontrol, beyaz). Gösterilen değerler ortalama ± standart hata (SE) (n = 4). Fidan arasında önemli farklılıklar tedavi AZD-8055 ve DMSO, öğrencinin tkullanımı ile-test, yıldız tarafından belirtilmiştir: * (P < 0,05) ve *** (P < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : İfade düzey stres kaynaklı genlerin. ABF3 transkript karşılaştırılması(a)hydroponically ve substrat-yetiştirilen Arabidopsis Col-0 fidan. ASN1 ve TPS5 transkript Arabidopsis fidan olarak karşılaştırılması (B) ile 2 µM AZD-8055 ve % 0.05 DMSO tedavi. Normalleştirilmiş ifade düzeyleri 2^(-dCt) gösterilir. Gösterilen değerler ortalama ± SE (n = 3). Önemli farklılıklar, öğrencinin tkullanımı-test, yıldız tarafından belirtilmiştir: *** (P < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 1:Bu vitro hydroponic sistemi çimlenme eşitlemek ve homojen fide elde etmek mümkün kılan. A. thaliana (C3) ve S. viridis (C4) tohumları doğrudan bu sistemde germinated. Fidan (A ve C) gelişimsel sahne alanı ile ilgili olarak homojen ve tedavi 11 d (Arabidopsis) sonra veya 7 d (Setaria) uygulandı. (B ve D) Ayrıca farklı maddeler ve kendi emilimi kolaylaştırma doğrudan besin çözüm doğru kökleri büyümek. Bu sonuçları kuvvetle bu sistemi bitki büyüme için en iyi bir ortam sunar ve verimli bir şekilde çok çeşitli deneyleri gerçekleştirmek için kullanılan gösterir. Buna ek olarak, bu hydroponic sistemi büyük ölçekli deneyler için çok yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu en iyi duruma getirilmiş hydroponic yapı başarılı vitro kültür bitkilerin sağlar. Tohum çimlenme su kuyusu üstünde pipet ucu düz yüzey sağlam orta, tohum ile besin çözüm batırılmış nerede sistemleri ile karşılaştırıldığında önemli bir kazanç. Bu sistemin büyük bir avantaj fide geliştirme sırasında sıvı orta aktarım, gerek kalmadan doğrudan temas kökleri elde edilmesi. Ayrıca, kimyasal arıtma azaltılmış bir hacim içinde sıvı ortamda kolayca uygulanabilir. Nem oranı yüksek, besin çözüm ve onun stok yenileme buharlaşma kaçınarak tutulur. Buna ek olarak, homojen büyüme ve gelişme fide kuruluş sırasında kolayca elde edilebilir, ve havalandırma küçük tanklar ve fidan ile bu gelişim aşaması1,10,18 çalışırken gerekli değildir . Sistem kirletici tamamen ücretsiz olacak sağlamak için önemli bir adım herhangi bir malzeme kullanılan sterilizasyon ve yoğun bakım onun sırasında derlemedir. Bazı bileşenler (Örneğin, tek kullanımlık plastik kutular) Otoklav içinde sterilize etmek için imkansızlığı nedeniyle önce onları % 70 etanol ile temizleyin ve UV ışığı kullanmadan önce kısa bir süre sonra uygulamak için önerilir. Deneyim, yapışkan bant ile ve medya Katılaşma sırasında düz yüzey sızdırmazlık sonra UV ışık, kullanımı da bakteriyel ve mantar kirlenme önler. Ayrıca, her zaman hareketli pipet rafları yan yan tarafından medya, dokunmatik değil dikkatli olun.
Fidan optimal büyüme sağlamak için katı ve sıvı medya, kökleri tam daldırma tohum çimlenme sonra sağlanması arasındaki yakın temas izlemek önemlidir. Katı orta yeterince yoğun olması gerekir (10 g/M agar) ve tamamen katılaşmış şekilde değil düz yüzeyden gevşetin ve besin çözüm float için. Tohumlar düz kuyu sığacak kadar küçük olduğu sürece Arabidopsisyanı sıra, bu sistemi diğer bitki türleri yetiştirmek için kullanılabilir. Bu anlamda, burada sunulan hydroponic Yöntemi ayrıca Setaria viridis, son zamanlarda C4 fotosentez, stres biyoloji ve diğer Biyoenerji ürün özellikleri çalışmak için bir roman modeli sistem ortaya çıkmıştır bir küçük çim büyüme için verimli 55. Arabidopsisbenzer, bu sistemi sağlar düzgün büyüyen Setaria fidan iyi bir kök sistemi ile ve büyük ölçüde üretmek için (Tamamlayıcı Şekil 1), çünkü her raf 96 tohum sağlanması, destekler biyolojik REPLICATE başına birçok fidan ve sonuç olarak, aşağı akım uygulamaları sayısız için yeterli malzeme. Çoğaltır daha yüksek bir sayı daha doğru ve güvenilir sonuçlar deneysel çalışmalar56yılında lider istatistiksel test, verimliliğini artırır. Örneğin, bir büyüme odası ile sadece 1,5 m2bir alanı kullanarak, istenilen tedavi için yanıt zamansal kinetik gerçekleştirmek mümkün hale aynı anda, 6000 fidan büyümeye başardık. Buna ek olarak, hasat örnekleri-ebilmek var olmak kullanılmış için çoklu ve tamamlayıcı 'omics' inceliyor doku (Örneğin, immunoblotting) büyük bir miktarda talep edebilirsiniz. Bu hydroponic yapısı kolay ve hızlı ayırma verdiğinden farklı bitki organları (Örneğin, roots ve shoots), analiz amaçlayan gruplar için özel ilgi var.
Çalışmalar az sayıda bir transfer daha büyük hydroponic tankları11,20önce ilk bitki geliştirme sırasında pipet ucu kutuları kullanımı açıklanmıştır ve daha yakın zamanlarda, çok benzer bir sistem amino değerlendirmek için istihdam edildi asit alımı ve 5-hafta-yaşlı Arabidopsis translocation bitkiler57. Burada açıklanan protokol steril koşullarda bitki yetiştirilmesi açısından ek yararlar sağlar.
Her ne kadar bu sistemi başlangıçta fidan büyümeye geliştirildi, aynı zamanda daha büyük bitkiler için uygun olabilir. Bu senaryoda, bu bakım tohumları daha uzak birbirinden büyüme sırasında mümkün olduğunca fazla gölgelendirme kaçınmaya yerleştirmek için alınması gereken kayda değer olduğunu. Ayrıca, havalandırma pipet ucu düz, uzun süre büyüyen batık Arabidopsis kökleri'yaygın bir sorun bir şey aracılığıyla hipoksi önlemek için raflar tanıttı olabilir. Sesil kendi doğasından dolayı bitkiler bağlı olarak kendi çevresini abiyotik ve biyotik streslere birkaç türlü tabi tutulmaktadır. Bu nedenle, çalışma ve gelişimsel sahne amacı göz önüne alındığında, bu sistemde büyüyen bitkiler stres bir çeşit acı varsa izlemek önemli olabilir.
Sonuçları burada sunulan bu hydroponic sistemi özellikle pipet ucu raflar küçük hacmi nedeniyle pahalı maddeler ile çalışırken çok kimyasallar uygulamaya besin çözüm için yararlı olduğunu göstermiştir. Biz etkili AZD-8055 tarafından TOR kinaz aktivitesinin bastırmak için bu sistemi kullanarak başarılı oldu ve aşağı akım hedefine RPS6 fosforilasyon durumunu tedavi uygulama 30 dakika sonra zaten etkilenir doğruladı. Ayrıca, TOR inhibisyon fidan gece ve gece kontrol fidan ile karşılaştırıldığında daha yüksek nişasta düzeyleri içeren yol açar. Bu tür deneyleri kolayca zaten transgenik çizgiler, TOR gen kodlama bileşenlerinin indüklenebilir bir baskı karmaşık, izin veya herhangi bir diğer yolu ilgi ile elde edilen gözlemler genişletmek için istihdam edilebilir. Özet olarak, önerilen hydroponic sistemi çünkü çok kolay ve basit bir araya pek çok avantajı vardır, bir düşük maliyetli (ana bileşenler ucuz ve kapsamlı bir şekilde yeniden kullanılabilir) vardır, çok yönlü (sağlam fidan veya farklı dokuların çalışma sağlar özel veya bitki gelişim dönemleri boyunca) ve (, fidan çok küçük bir alanda çok sayıda ekimi sağlar) yüksek oranda ölçeklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP; tarafından desteklenen 12/19561-0 vermek) ve Max Planck toplum. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), ve Viviane C. H. da Silva (burunları/CNPEM 24/2013) arkadaş grupları için müteşekkiriz. Yazarlar Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Fransa) Christian Meyer cömertçe RPS6 karşı antikor verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar RTV UNICAMP teşekkür ve Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel ses sırasında teknik destek için kayıt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
