Summary
간단 하 고, 다재 다능 한, 고 저가 생체 외에서 수경 시스템 성공적으로, 메 마른 조건 하에서 대규모 실험을 수 있도록 최적화 되었다. 이 시스템 솔루션 및 분자, 생화학, 생리 적 연구에 대 한 뿌리에 의해 그들의 효율적인 흡수 화학 물질의 응용 프로그램을 지원합니다.
Abstract
식물 생물학에 있는 연구의 넓은 범위는 수경 문화를 사용 하 여 수행 됩니다. 이 작품에는 체 외에서 수경 성장 시스템 식물 화학 물질 및 기타 물질의 응답을 평가 하기 위해 설계 된 제공 됩니다. 이 시스템은 각각의 C3 와 C4 모델 종 애기 thaliana 와 강아지 풀, 균질 하 고 건강 한 묘를 얻기에 매우 효율적입니다. 무 균 재배 식물 정상적인 성장과 개발 수경 법에 대 한 제한 요인으로 알려져 있다 조류 및 미생물 오염 방지 합니다. 또한,이 시스템은 확장성, 필요한 경우 작은 기계적 손상, 대규모 공장 설비 재료의 수확 뿐만 아니라 식물의 개별 부품의 수확을 사용. 자세한 프로토콜을 사용 하 여 피 펫 선반 주요 플랫폼으로 성장 하는 식물,이 시스템은 간편 하 고 저렴 한 비용 어셈블리, 있다 보여주는 제공 됩니다. 이 시스템의 타당성은 마약 AZD-8055, rapamycin (TOR) 키의 대상의 화학 억제제의 효과 평가 하기 위해 애기 묘를 사용 하 여 유효성이 검사 됩니다. TOR 금지 효율적으로 뿌리와 새싹에 AZD-8055 치료 후 30 분으로 일찍 발견 되었다. 또한, AZD 8055 치료 식물 표시 예상된 전 분 초과 표현 형. 우리 식물 연구원 식물 inducers 또는 억제제도의 동작을 모니터링 하는 것을 목표로 평가 일반적으로 비싼의 사용을 요구 하는 동위 원소 라벨 화합물을 사용 하 여 신진 대사 용으로 이상적인 방법으로이 수경 시스템 제안 시 약입니다.
Introduction
수경 법을 사용 하 여 성장 하는 식물의 장점은 재현 실험1,2,3을 사용 하는 크고 균일 한 공장의 생산에 널리 인정 되었습니다. 이 시스템에서 영양 솔루션의 구성 제대로 통제 되 고 식물 성장 및 개발의 모든 단계에 따라 재활용. 또한, 토양 재배, 식물 영양 기아 및 물 부족4등에서 발생할 수 있습니다으로 뿌리 abiotic 스트레스를 받게 하지 됩니다. 식물 성장 수경 존재 형태 및 생리 적 특성 토양에서 경작 하는 사람에 게 상당히 유사한로이 시스템은 광범위 하 게 고용 연구에서 루트/촬영 성장과 없이 그들의 수확의 모니터링을 허용 하기 때문에 부상2,5.
구성과 영양 용액의 농도 변경의 가능성으로 인해 수경 조건을 사용 하 여 연구의 대부분의 마이크로-macronutrients1,3 기능을 특성화 하 수행 되었습니다. 6,,78. 그러나,이 시스템은 다양 한 식물 생물학, 호르몬과 식물 화학 물질의 기능을 명료 하 게와 같은 응용 프로그램에 매우 유용을 입증 했다. 예를 들어, 호르몬9 및 brassinosteroid 응용 프로그램10 에 의해 실행 가속된 성장 표현 형의 새로운 클래스 strigolactones의 발견 수경 조건 하에서 수행 했다. 또한,이 시스템은 레이블이 동위 원소 실험을 수 있습니다 (예를 들어, 14N /15N 및 13CO2)11,단백질 및 대사 산물에 그들의 합동 평가12 의해 질량 분석.
식물 연구에이 시스템의 중요성을 고려 하면 높은 수경 문화 수 수경 컨테이너3, 묘 판에서 전이 (i)을 사용 하는 시스템을 포함 하 여 지난 몇 년 동안에서 설계 되었습니다 13; (ii) rockwool 루트 개발2,,1415;의 초기 단계에 대 한 액세스를 제한 하 (3) 폴 리 에틸렌 알갱이 작은 분자/치료 어려운16;의 유형이 같은 응용 프로그램을 만드는 부동 본문으로 또는 (iv)는 감소 된 수의 식물9,17. 이러한 프로토콜의 대부분에서 설명 하는 수경 탱크의 볼륨은 일반적으로 대형 (최대 32 L 1-5 L에서 배열 하는 작은 볼륨)18, 화학 물질의 응용 프로그램을 매우 비싼 게. 몇 가지 연구는 무 균 조건8,에서 수경 재배를 설명 할19, 시스템의 어셈블리는 일반적으로 매우 힘 드는, 플라스틱이 나 유리에 나일론 메시의 완벽 한 조정의 구성 컨테이너5,8,,1720.
모델 식물으로 애기 thaliana 의 중요성 때문 수경 법 시스템의 대부분은이 종1,2,8,,1418, 을 위해 설계 되었습니다. 19 , 20. 그럼에도 불구 하 고, 그들의 발 아를 개선 하기 위해 씨앗의 전처리와 다른 식물 종의 수경 성장 기능을 보고 몇 가지 연구와 동기화 요금 체 외에서8,16 . 대규모 작업, 우리는 간단 하 고 저렴 한 비용 유지 보수 수경 시스템입니다 성장 하는 식물, A. thaliana 등 잔디 강아지 같은 다른 종족에 대 한 살 균 조건을 설정 하기 위한 프로토콜 개발 풀. 묘 종 성장을 최대화 수 있습니다 동기화, 그리고 쉽게 모니터링 방법을 여기에 설명 된 다른 실험을 위해 적당 하다. 또한,이 시스템은 많은 이점이 있다: (i) 해당 어셈블리는 간단 하 고 구성 요소를 다시 사용할 수 있습니다; (2) 액체 매체;에 다른 화학 물질의 쉬운 응용 프로그램 수 (iii) 묘 목 발 아 성장과 전이 필요 없이 문화 매체에서 직접 수경 법 시스템; (iv) 촬영 및 루트 개발/성장 밀접 하 게 감독 하 고 묘는 손해; 없이 수확 하 고 있다 (v) 그것은 가능 하 게 큰 규모로 일 생리 상태를 유지.
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Protocol
1. 액체와 고체 배양의 준비
- 비타민 [코발트 염화 물 pentahydrate의 0.0125 mg/L, copper(II) 황산 pentahydrate의 0.0125 mg/L, ethylenediaminetetraacetate 제 2 철 나트륨, 3.10 mg/L의 18.35 mg/L와 반 강도 Skoog (MS)와 村 重 매체를 사용 하 여 액체 매체 준비 붕 소의 산 성, 0.415 mg/L 요오드 화 칼륨, 망간의 8.45 mg/L의 황산 토스, 0.125 mg/L 나트륨 몰 리브 덴이 수화물, 4.30 mg/L 아연 황산 염 heptahydrate, 166.01 mg/L 칼슘 염화 물, 칼륨 디 인산, 950 mg/L의 85 mg/L의의 질 산 칼륨, 황산 마그네슘의 90.27 mg/L, 825 mg/L 질 산 암모늄의, 글리신의 1 mg/L, myo-이노 시 톨의 50mg/L, 니코틴산 산의 0.25 mg/L, 피리 독신 염 산 염의 0.25 mg/L 및 티 아민 염 산 염의 0.05 mg/L] 0.25 g/l의 보완 MES, 10 m 코 5.8에 pH를 조정 하 고.
- 한 천의 반 강도 MS-고체 매체를 만들기 위해 10 g/L를 추가 합니다. 압력솥 사용 하기 20 분 전에 121 ° C에서 매체.
2. 수경 시스템 조립
참고:이 단계를 따라야 한다 꼼꼼하게 수경 시스템을 구축.
-
소재 살 균
- 팩 압력솥 가방에 피 펫 팁 랙 (커버) 없이 minitanks로 사용 될 것 이다. 오토 클레이 브 랙 20 분, 15 psi에 대 한 121 ° C에서.
참고: 우리가 사용 하는 폴 리 프로필 렌 피 펫 팁 랙 했다 다음 치수: 120 mm (길이) x 89 mm (폭) x 55 mm (높이). 피 펫 팁 평평한 표면 문화 매체의 추가 대 한 영역을가지고 있어야 합니다. 다른 팁 랙 사용 될 수 있다 ( 재료의 표참조).
참고: 수경 시스템의 조립 절차, 그것은 청소 되어야 하며 사용 하기 전에 70% 에탄올으로 소독 하는 층 류 후드, 사용 하는 데 필요한. 실험 실험실 외 투를 착용 해야 합니다, 그들의 손을 씻고 하 고 노출 된 피부, 70% 에탄올으로 소독. 장갑은 약물 응용 프로그램 제외 옵션입니다. - 층 류 두건에 들어가기 전에 70% 에탄올 (일회용 플라스틱 상자, 접착 테이프, 펫가 위, 및 핀셋) 위에서 설명한 모든 액세서리를 청소. 후드 허용 하는 경우 소독 작업 영역을 유지 하기 위해서는 수경 시스템을 조립 하기 전에 10 분 동안 UV 빛을 켜십시오.
- 팩 압력솥 가방에 피 펫 팁 랙 (커버) 없이 minitanks로 사용 될 것 이다. 오토 클레이 브 랙 20 분, 15 psi에 대 한 121 ° C에서.
-
Minitank 조립
- 피 펫 팁 평평 접착 테이프로 (그림 1B)의 상부 표면 인감. 가능 하면 두고 자외선 아래 빛 10 분.
- 잘 사용 하 여 각 멀티 채널 피 펫 (그림 1C)에 녹은 고체에 MS 문화 매체 (약간 따뜻한)의 180 µ L를 추가 합니다.
참고: 많은 탱크를 준비할 때 응고에서 MS 중간을 열판을 사용 합니다. - 완전히 (약 30 분) 동안 강화 하기 위해 매체를 허용 합니다.
참고: 응고 기간 동안 UV 빛 설정할 수 있습니다. - 피 펫 팁 랙 액체 MS 문화 매체 (그림 1D)와 완전히 위로 고체와 액체 미디어 간의 긴밀 한 접촉 보장.
- 피 펫 팁 플랫의 상부 표면의 접착제 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 선반에 맞는. 수경 시스템 이제 소독된 씨앗을 받을 준비가 되어 있습니다.
3. 종자 살 균
- 1.5 mL microtube에 장소 500 애기 씨앗. 많은 microtubes를 사용 하 여 실험에 필요한 식물의 수에 따라 필요에 따라.
- 부드러운 동요와 함께 2 분 동안 70% 에탄올과 씨앗을 씻어. 씨앗 정착, 다음 에탄올을 신중 하 게 제거 하자.
- 폴 20 세제의 2 µ L을 포함 하는 10% 염소 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 교 반 하십시오 5 분 제거를 위한 솔루션 솔루션 신중 하 게.
- 모든 표 백제 잔류물은 완전히 제거 (약 5 배) 될 때까지 살 균 증류수와 함께 씨 린스.
참고: 표면 살 균 후 씨앗 살 균 증류수에 몰입 되었고 5 d는 발 아를 동기화를 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 층 화.
참고: 강아지 풀 (증가 A10.1)의 씨앗 15 분 (휴식 물리적 휴면) 집중된 한 황산에 preincubated, 멸 균 증류수에 철저 하 게 세척 되었고 5% 염소 솔루션 disinfested 포함 하는 부드러운 동요215 분 0.1% 폴 20. 나머지 살 균 단계 애기 씨앗에 대 한 설명에 동일 했다.
4. 씨앗 응용 프로그램
- 약간 메 마른 메스의 도움으로 200 µ L 팁의 말단 절단.
- 애기 씨 플랫 피 펫 팁의 상부 표면에 고체 배양으로 플라스틱. 매체는 평면;에서 느슨하게 하지 않습니다 돌 봐 그렇지 않으면, 씨앗 음영 처리 되며 묘 제대로 성장 하지 것입니다 (그림 1E).
참고: (와 함께 위쪽으로 위치 배아) 강아지 씨에 대 한 살 균 족집게를 사용 합니다. - 환경 미생물 (1 층 그림)에서 무료로 유지 하 고 높은 습도 유지 하는 일회용 플라스틱 상자 안에 가능한 많은 minitanks를 저장 합니다.
- 철저 하 게 오염을 피하기 위하여 접착 테이프를 사용 하 여 일회용 플라스틱 상자를 봉인 합니다.
- 수경 시스템의를 공장에 대 한 적절 한 성장 조건 성장 챔버에 넣으십시오.
참고:이 작품에서 다음 조건 사용 되었다: 75%의 습도, 및 150 µmol m-2의 -1 의 irradiance 무더운 12 h 빛 (21 ° C) / 12 h 어두운 (19 ° C)에 대 한 조건을 애기, 또는 300 µmol m-2의 -1 의 irradiance와 12 h 빛 (28 ° C) / 12 h 어두운 (25 ° C) 강아지 (그림 1G 및 1 시간).
5. 검증 대상 Rapamycin 키 니 아 제를 억제 하기 위해이 수경 시스템의 사용
참고:이 수경 시스템 처음 식물을, 일반적으로 매우 비싼 대규모 실험에 적용 되는 화학 물질의 관리를 촉진 하기 위하여 개발 되었다. 개념의 증거로 서 ATP 경쟁 억제 물 AZD-8055, 특히 토르 단백질 키 니 아 제22의 ATP 바인딩 사이트를 대상으로 알려져, A. thaliana 컬럼비아-0 (모 종에서 토르 활동의 억압에 따라 고용 했다 노팅엄 애기 사진 센터, NASC ID: N22681). 여기, 사용 하는 프로토콜은 간단히 설명 합니다.
- 성장 씨앗 수경 무대 1.04는 BBCH 따라 규모23 (약 11 d) 때까지 위에서 설명한 기후 조건. 신선한 중간 포함 0.05 %DMSO (제어), 2 µ M로 영양소 솔루션 교체 AZD-8055 (토르 억제제) 밤 (EN)의 끝에 치료 (모의) 없이 DMSO, 또는 희석.
- 치료 후 다른 시간 지점에서 일부 묘 목 수확 하 고 뿌리와 새싹으로 그들을 분리. 액체 질소에서 샘플을 동결, 로봇 분쇄기에 정밀한 분말에 갈기 ( 재료의 표참조), 사용까지-80 ° C에서 분말을 저장.
- Phosphorylated 및 비 phosphorylated 형태의 로부터 40 ribosomal 단백질 S6 (RPS6) Dobrenel 그 외 여러분 에 따르면 Immunoblot 24.
- 샘플 depigmentation에 대 한 그대로 묘 표 백제, 증류수에 세척, 5 분25, 요오드 용액에 담가 그리고 stereomicroscope (목표, 20 x 근사, 및 7.5 x 크기 X 0.63)에 묘 목에 대 한 사진 한 녹말 함유량의 질적 평가입니다.
- NADPH26,27NADP+ 의 감소에 결합 하 여 효소 저하 및 출시 된 혈당 측정을 spectrophotometrically 다음 전 분을 계량.
- 총 RNA 추출, cDNA 합성, 그리고 Caldana 그 외 여러분 에 의해 설명된대로 양적 RT-PCR 분석 실험을 수행 긴장의 다른 종류와 관련 된 유전자의 식 수준을 평가에 28 .
- 필요한 경우, 유사한 기후 조건 [습도 60%, 150 µmol m-2의 -1 의 방사, 및 무더운 조건 12 h 빛 (21 ° C) / 12 h 어두운 (19 ° C에서 0.1 L 용량 플라스틱 화분에서 원 예 기판에 묘 목 성장 )] 모 종 수경 재배와 그들을 비교 하기 위해
참고: 대상 유전자 유전자 표정 분석 실험에 사용 했다 ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), 및 TPS5 (At4g17770), 및 그들의 식 수준 를 사용 하 여 델타 Ct 방법29 고용 정상화 했다 ACT2 (At3g18780) 또는 PDF2 (At4g04890) 내부 기준 유전자로 모든 샘플에서 PCR 증폭 효율의 100%를 가정. 양이 많은 PCR에 사용 하는 oligonucleotide 쌍 했다: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), 및 PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT)입니다.
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Representative Results
토르 니 영양소와 세포 증식 및 성장 모든 진핵생물에서 신호 에너지를 통합 하는 주요 레 귤 레이 터 이다. 애기 유전자 변형 줄 RNA 간섭 또는 인공 예측에 관한28,,3031, 토르 조건부 억압의 생성을 포함 하는 식물에서 TOR 기능을 명료 하 게 하는 노력 토르 녹아웃 식물32,33,,3435의 배아 치명적인 표현 형 주어진. 조건부 유전자 변형 라인의 대부분의 estradiol-통제은 dexamethasone-또는 또한 만들 수 있는 에탄올을 유도할 수 있는 발기인이 수경 시스템의 사용.
애기 에 토르 활동의 잘 알려진 목표 중 하나입니다 ribosomal 단백질 S6 키 니 아 제 (S6K)34,36,,3738의 직접 인 산화. 인 산화에 S6K 추가 40 ribosomal 단백질 S6 phosphorylates (RPS6), ribosomal 단백질 번역24,,3940에 영향을 미치는. 최근에, 그것은 RPS6 Ser240 사이트의 인 산화 토르 활동24의 좋은 표시자는 증명 되었습니다. Immunoblotting 분석 확인 약국의 30 분 후 곧 Ser240 인 산화에 중요 한 감소가 뿌리와 새싹 (그림 2)에서 관찰 되었다. 사용 하는 실험 조건에서 AZD-8055는 또한 급속 하 게 그것의 키 니 아 제 활동을 누르는 강력한 토르 억제제로 표시 됩니다.
유전자 변형 애기 라인 토르 유전자의 감소 식 또는 복잡 한 토르의 구성 요소는 분명 전 분 초과 형28,31제시. Lugol의 솔루션을 사용 하 여 전 분의 정성 분석의 전 분 축적과 diel 주기 (그림 3) 동안 저하 예상된 패턴을 공개 했다. DMSO 또는 AZD-8055의 응용 프로그램에 영향을 받지 않은 묘 목 (EN), 밤의 끝에 그들의 잎에 전 분의 더 큰 축적을 보였다 그리고 제어 식물 (받은 0.05 %DMSO)에 전 분 축적 했다 문학과 일치 41 , 42. 또한, AZD-8055로 치료 식물 제어 모 종에 비해 EN 나머지 전 분의 큰 금액을 제시. 이러한 결과 생리 적 상태를 흉내 낸 묘 목 성장에 제안 된 수경 시스템의 유용성 표시. 이 시스템은 또한 토르 복잡 한 구성 요소24,,2831의 억압의 일반적인 전 분 과잉 형의 확인을 사용할 수 있습니다.
녹말 함유량도 정확 하 게 AZD-8055 치료 하루 (ED)의 두 끝에서 전 분의 상당히 높은 수준의 포함 된 묘를 지도 보여주는 중요 한 방법론을 사용 하 여 측정 되었다와 DMSO 처리 제어에 비해 EN 식물 (그림 4)입니다. 전 분 낮에 잎에 축적 하 고 대사 활동, 주로 호흡과 다른 식물 기관41,42는 자당의 지속적인 수출을 유지 하기 위해 하룻밤 사이 remobilized. 정상적인 조건 하에서 (사이 5%와 드에서 금액의 10%) 전 분의 극히 일부에 EN43,,4445에 남아 있다. 이 결과 인증 초과 형 토르 억압 아래 관찰 전 분 diel 주기 전체에 발생 합니다.
수경 재배 식물 묘 3 (ABF3) 유전자 (그림 5A abscisic 산 응답 요소 바인딩 요소의 수준 식에 관한 매우 유사한 기후 조건 원 기판에 성장에 비교 했다 )를 직접 내부와 관계가 ABA 수준, 여러 비 생물 적인 긴장 응답46,,4748에 있는 그것의 역할 때문 표식으로 널리 알려진 호르몬의 클래스. 묘 목 성장 수경 시스템에 ABF3의 수준에서 크게 증가 제시 않았다, 비록 표현의 아스파라긴 synthase 1 (ASN1)은 영향을 받지 DMSO 또는 AZD 치료 (그림 5B). 그러나, 트 레 할 로스 인산 염 synthase 5 (TPS5) 토르 억제 (그림 5B) 8 h 후 크게 증가 했다. ASN1 TPS5 응답 낮고 높은 설탕 수준49,50,51,,5253,54, 각각, 제안 이러한 식물 에너지 스트레스 발생 하지 했다.
그림 1 : 수경 시스템을 조립에 대 한 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 :의 다른 조직에 RPS6 인 산화에 토르 억제의 효과 애기 thaliana . AZD-8055 또는 0.05 %DMSO (제어) 묘 목의 (B) 촬영 추출 물 2 µ M로 치료 및 Immunoblotting (A) 루트에서 총과 phosphorylated RPS6의 풍부를 보여준다. 값 비 phosphorylated 단백질 RPS6 정상화 하는 비율을 나타냅니다. 반대로 말라 항 체는 로드 제어로 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 애기 thaliana 묘 Lugol의 시 약으로 물. 2 µ M AZD-8055 또는 0.05 %DMSO (제어)와 함께 치료 EN (빨간색 화살표)에 적용 되었고 모의 묘 (no-치료)에 비해. 모 종은 치료 응용 프로그램 (0 h) 전에 수확 되었고 12 h (ED)과 치료 후 24 시간 (EN) 검은 화살표로 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 :의 전 내용에 토르 억제의 효과 애기 thaliana 묘. 전 분 효소 (0 h) 전에 측정 했다 그리고 12 h (ED)에 또는 2 µ M와 치료 후 24 시간 (EN) AZD-8055 (블랙) 또는 0.05 %DMSO (제어, 흰색). 표시 된 값은 평균 ± 표준 오차 (SE) (n = 4). 모 사이 큰 차이가 치료 AZD-8055와 DMSO, 학생의 t를 사용 하 여-테스트, 별표로 표시 됩니다: * (P < 0.05)와 * * * (P < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 스트레스 관련 유전자의 식 수준. (A) 비교에서 ABF3 성적 수경 및 기판 성장 애기 열-0 묘. 애기 모 종에서 ASN1 및 TPS5 내용은의 (B) 비교 AZD-8055 및 0.05% DMSO 2 µ M로 치료. 정규화 된 표현 레벨 2^(-dCt)로 표시 됩니다. 표시 된 값은 평균 ± SE (n = 3). 학생의 t를 사용 하 여 큰 차이가-테스트, 별표로 표시 됩니다: * * * (P < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1:이 생체 외에서 수경 시스템은 발 아를 동기화 하 고 균질 묘를 얻을 수. A. thaliana (C3) 및 미 풀 (C4)의 씨앗은이 시스템에서 직접 출 아 했다. (A 와 C) 묘 개발 단계에 관하여 균질 되었고 치료 11 d (애기) 후 또는 7 d (강아지)를 적용 했다. (B 와 D) 뿌리는 다른 물질과 그들의 흡수를 촉진 하는 영양 솔루션으로 직접 성장. 이러한 결과 강하게이 시스템 식물 성장 위한 최적의 환경을 제공 하 고 효율적으로 다양 한 분석 실험을 수행 하는 데 사용 수를 나타냅니다. 또한,이 수경 시스템은 대규모 실험에 대 한 매우 유용 합니다.
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Discussion
이 최적화 된 수경 구조 식물의 성공적인 생체 외에서 문화를 수 있습니다. 씨앗은 잘 피 펫 팁 평평한 표면에 고체 매체, 씨앗 영양 솔루션 젖된 시스템에 비해 상당한 이득에 출 아 할. 이 시스템의 큰 장점은 그 종묘 개발 하는 동안 뿌리 연락해 직접 전이의 필요 없이 액체 매체 이다. 또한, 화학 치료 감소 볼륨에 액체 매체에 쉽게 적용할 수 있습니다. 습도 높은 영양소 솔루션 및 그것의 보충의 증발을 방지 유지 됩니다. 또한, 균질 성 성장과 개발 묘 종 설립 동안 쉽게 얻을 수 있습니다, 그리고이 발달 단계1,10,18 작은 탱크 및 모 종 작업 시 통 기 통풍 필요 하지 않습니다. . 보증 시스템 오염 물질에서 완전 무료 될 것입니다, 중요 한 단계는 조립 하는 동안 사용 되는 재료의 살 균과 집중 치료입니다. 때문에 일부 구성 요소 (예를 들어, 일회용 플라스틱 상자) 오토 클레이 브에서 소독 불가능, 그것은 좋습니다 먼저 70% 에탄올과 그들을 취소 하 고 다음 사용 하기 전에 자외선의 짧은 기간을 적용 하. 우리의 경험에서 평평한 표면 접착 테이프와 미디어 응고 하는 동안 씰링 후 자외선를 사용 하 여도 세균과 곰 팡이 오염을 방지 합니다. 또한,를 항상 그것의 측면 쪽으로 피 펫 랙 이동 미디어를 건드리지 않도록 주의 해야 합니다.
보장 최적의 성장의 묘 목, 씨앗 발 아 후 뿌리의 완전 한 집중 보장 고체와 액체 미디어 간의 긴밀 한 접촉을 모니터링 하는 것이 중요 하다. 단단한 매체 적절 하 게 조밀한 되어야 합니다 (한 천 10 g/L)과 평평한 표면에서 풀고 영양소 솔루션에 플 로트를 그렇게 하지 않도록 완전히 응고. 애기, 게다가이 시스템 사용할 수 있습니다 성장 하는 다른 식물 종으로 씨앗 플랫의 우물에 맞게 충분히 작은. 이런이 의미에서 여기에 제시 된 수경 메서드는 또한 강아지 풀, C4 광합성, 스트레스 생물학, 및 기타 bioenergy 작물 특성을 공부에 대 한 새로운 모델 시스템으로 최근에 나왔다 작은 잔디 성장에 대 한 효율적 55. 애기와 마찬가지로,이 시스템에 있습니다 좋은 루트 시스템 및 대규모에 균일 하 게 성장猫묘 목 생산 (보충 그림 1)모든 랙 96 씨앗, 보장을 지원 하기 때문에, 생물 복제 당 많은 묘 및, 따라서, 무수 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 충분 한 자료. 복제의 높은 수 실험 연구56에 더 정확 하 고 신뢰할 수 있는 결과 통계 테스트의 효율성을 증가 한다. 예를 들어 성장 챔버를 사용 하 여 유일한 1.5 m2의 면적, 우리 수 있었다 동시에, 6000 모 성장 원하는 치료에 응답의 시간 활동을 수행할 수 있습니다. 또한, 여러 수확된 샘플을 사용할 수 있습니다 및 보완 'omics' 분석 하는 조직 (예를 들어, immunoblotting)의 큰 금액을 요구할 수 있다. 이 수경 구조는 그들의 쉽고 빠른 분리 수 있기 때문에 고유 식물 기관 (예, 뿌리와 새싹), 분석을 목표로 하는 그룹에 대 한 특별 한 관심의.
적은 수의 연구 더 큰 수경 탱크11,20, 전이 이전 초기 공장 개발 하는 동안 피 펫 팁 상자를 사용 하 여 설명 하 고 최근, 매우 비슷한 시스템 평가 아미노를 고용 했다 산 통풍 관 그리고 5 주 된 애기 식물57에 전. 여기에 설명 된 프로토콜 메 마른 조건 하에서 식물 재배 측면에서 추가 혜택을 제공 합니다.
처음이 시스템 성장 묘 종을 위해 개발 되었습니다, 하지만 그것은 또한 더 큰 식물에 적합 수 있습니다. 이 시나리오에는 주의 해야 한다 씨앗을 성장 하는 동안 최대한 많은 음영을 피하기 위해 서로에서 더 멀리 떨어져 있는 장소를 언급 가치가 있다. 또한, 통 기 통풍 피 펫 팁 플랫, 긴 기간에 대 한 성장 중된 애기 뿌리에 일반적인 문제에의 한 잘 통해 hypoxia를 방지 하기 위해 선반에 도입 될 수 있습니다. 그들의 무 특성상 식물 그들의 주변 환경에 따라 생물 비 생물 적인 긴장의 여러 종류를 받게 됩니다. 따라서, 목표는 연구 및 개발 단계, 고려 그것은이 시스템에서 성장 하는 식물 스트레스의 일종을 앓고 있다면 모니터링 하는 것이 중요 수 있습니다.
여기에 제시 된 결과이 수경 시스템은 화학 물질의 영양 솔루션에 응용 프로그램에 대 한 매우 유용한 비싼 물질, 피 펫 팁 랙 작은 볼륨으로 작업 하는 경우에 특히 나타났습니다. 우리는 효과적으로 AZD-8055로 토르 니의 활동을 억 누르기 위해이 시스템을 사용 하 여 성공 하 고 다운스트림 대상 RPS6의 인 산화 상태 치료 응용 프로그램의 30 분 후 이미 영향을 확인. 또한, 토르 억제 제어 모 종에 비해 밤낮 동안 상부 전 분을 포함 하는 묘 이끌어 낸다. 이러한 분석 이미 유전자 변형, 유전자 인코딩 구성 요소는 토르의 유도할 수 있는 억압을 복잡 한, 수 선이나 관심의 다른 통로와 얻은 관측 확장을 쉽게 사용할 수 있습니다. 요약, 제안 된 수경 시스템 그것은 매우 간단 하 고 조립 간단 하기 때문에 많은 장점을 보유 하 고 있다는 저렴 한 비용 (주요 구성 요소 저렴 하 고 광범위 하 게 다시 사용할 수 있습니다), 다목적 (수 그대로 묘 또는 별개 조직 연구 특정 또는 식물 발달 단계에 따라), 확장성 (매우 작은 영역에 묘 목의 거 대 한 수의 재배 수 있습니다)입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 상 파울로 연구 재단 (FAPESP;에 의해 지원 되었다 12/19561-0 부여) 및 막스 플랑크 협회. 엘리아스 F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), 캐롤라이나 C. 몬테 벨로 (FAPESP; 14/10407-3 그랜트) Valéria Mafra (FAPESP; 부여 14/07918-6), 그리고 비비 안 C. H. 다 실바 (망 토/CNPEM 24/2013)는 장학금에 대 한 감사. 저자 아낌없이 RPS6에 대하여 항 체를 제공 하는 기독교 메이어 인 장 피에르 Bourgin (INRA, 베 르 사 이유, 프랑스)에서 감사 합니다. 저자 감사 RTV UNICAMP와에 드 파울로 Aparecido de Souza Manoel 오디오 동안 그들의 기술 지원에 대 한 기록.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
