Summary
Un système hydroponique simple, polyvalent et économique le in vitro a été optimisé avec succès, permettant à des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques dans une solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques.
Abstract
Une large gamme d’études en biologie végétale sont effectuées à l’aide de cultures hydroponiques. Dans ce travail, un système hydroponique croissance in vitro conçu pour évaluer les réactions des plantes aux produits chimiques et autres substances d’intérêt est présenté. Ce système est très efficace pour obtenir des semis homogènes et saines des C3 C4 espèces de modèle Arabidopsis thaliana et Setaria viridis, respectivement. La culture stérile évite les algues et la contamination du micro-organisme, qui sont connus des facteurs limitants pour la croissance normale des plantes et le développement en culture hydroponique. En outre, ce système est évolutif, permettant la récolte de matériel végétal à grande échelle avec des dommages mécaniques mineurs, ainsi que la récolte des différentes parties d’une plante, si vous le souhaitez. Un protocole détaillé démontrant que ce système a un assemblage facile et peu coûteuse, puisqu’elle utilise les grilles de la pipette comme plate-forme principale pour cultiver des plantes, est fourni. La faisabilité de ce système a été validée à l’aide de Arabidopsis semis pour évaluer l’effet de la drogue AZD-8055, un inhibiteur chimique de la cible de la rapamycine (TOR) kinase. L’inhibition de TOR a été efficacement détectée dès 30 min après un traitement de AZD-8055 dans les racines et les pousses. En outre, les plantes traitées AZD-8055 affichent le phénotype d’amidon-excédent prévu. Nous avons proposé ce système hydroponique comme une méthode idéale pour les chercheurs de plantes visant à surveiller l’action des plantes inducteurs ou inhibiteurs, ainsi quant à évaluer les flux métaboliques à l’aide de composés de marquage isotopique qui, en général, nécessite l’utilisation du cher réactifs.
Introduction
Les avantages de la croissance des plantes à l’aide de culture hydroponique ont été largement reconnus dans la production des plantes grandes et uniformes, permettant des expériences reproductibles1,2,3. Dans ce système, la composition de la solution nutritive peut être correctement contrôlée et recyclée le long de toutes les étapes de la croissance des plantes et le développement. En outre, racines ne sont pas soumis aux stress abiotiques, comme cela peut arriver dans les plantes en terre, tels que des éléments nutritifs famine et eau carence en4. Comme plantes cultivées hydroponically présents caractéristiques morphologiques et physiologiques assez semblables à celles cultivées dans le sol, ce système a été largement employé dans la recherche car elle permet la surveillance de la croissance de la racine/tige et leur récolte sans blessures2,5.
En raison de la possibilité de modifier la composition et la concentration de la solution nutritive, la plupart des recherches à l’aide de conditions de culture hydroponiques a été effectuée pour caractériser les fonctions du micro et macronutriments1,3 ,6,7,8. Cependant, ce système s’est avéré pour être très utile pour un large éventail d’applications en biologie végétale, de nature à élucider les fonctions des hormones et de produits chimiques dans les usines. Par exemple, la découverte des strigolactones comme une nouvelle classe d’hormones9 et le phénotype d’une croissance accélérée déclenchée par brassinostéroïde demande10 ont été effectuées dans des conditions de culture hydroponiques. En outre, ce système permet des expériences avec des isotopes marqués (par exemple, 14N /15N et 13CO2)11,12 pour évaluer leur incorporation dans les protéines et de métabolites par spectrométrie de masse.
Compte tenu de l’importance de ce système en recherche sur les plantes, un grand nombre de cultures hydroponiques a été conçu dans les années précédentes, y compris les systèmes qui utilisent (i) le transfert des semis de plaques à conteneurs hydroponique3, 13; (ii) laine de roche qui limite l’accès aux premiers stades de la racine développement2,14,15; (iii) granulés de polyéthylène comme le corps flottant, ce qui rend l’application homogène des petites molécules/traitements difficiles16; ou (iv) un réduit nombre de plantes9,17. Le volume des réservoirs hydroponiques décrit dans plusieurs de ces protocoles sont généralement volumineux (petits volumes allant de 1 à 5 L, jusqu'à 32 L)18, ce qui rend l’application de produits chimiques extrêmement coûteux. Bien que peu d’études décrivent une culture hydroponique sous conditions aseptiques8,19, l’Assemblée du système est généralement très laborieux, consistant en l’ajustement parfait des mailles de nylon en plastique ou en verre conteneurs5,8,17,20.
En raison de l’importance de l’Arabidopsis thaliana comme une plante modèle, la majorité des systèmes de culture hydroponique ont été conçue pour cette espèce1,2,8,14,18, 19 , 20. Néanmoins, il existe quelques études présentant les caractéristiques de la culture hydroponique d’autres espèces végétales avec un prétraitement des semences pour améliorer leur germination et synchronisation des taux in vitro8,16 . Afin de travailler sur une grande échelle, nous avons développé un protocole pour la mise en place d’un système hydroponique de maintenance simple et peu coûteuse qui permet des conditions stériles pour la culture de plantes, dont a. thaliana et autres espèces, comme l’herbe Setaria viridis. La méthode décrite ici est adaptée aux différentes expériences, comme la croissance des semis peut être maximisée, synchronisée et facilement contrôlée. En outre, ce système présente de nombreux avantages comme : (i) son montage est simple et ses composants peuvent être réutilisés ; (ii) elle permet l’application facile des différents produits chimiques dans le milieu liquide ; (iii) les semis germent et poussent directement dans le milieu de culture sans la nécessité du transfert vers le système de culture hydroponique ; (iv) la développement/croissance caulinaire et racinaire peut être étroitement surveillée et les semis sont récoltées sans dommages-intérêts ; et (v) elle permet de travailler sur une grande échelle, maintenir des conditions physiologiques.
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Protocol
1. préparation des milieux de Culture liquides et solides
- Préparer un milieu liquide à l’aide de milieu de Murashige et Skoog (MS) de force avec les vitamines [0,0125 mg/L de cobalt (II) chlorure pentahydraté, 0,0125 mg/L de sulfate de cuivre (II) pentahydraté, 18,35 mg/L de sodium ferrique de tétrasodium, 3,10 mg/L de l’acide borique, 0,415 mg/L d’iodure de potassium, 8,45 mg/L de manganèse sulfate monohydrate, 0,125 mg/L de sodium molybdate dihydraté, 4,30 mg/L de sulfate de zinc heptahydraté, 166,01 mg/L de chlorure de calcium, 85 mg/L de phosphate monopotassique, 950 mg/L de nitrate de potassium, 90,27 mg/L de sulfate de magnésium, 825 mg/L de nitrate d’ammonium, 1 mg/L de la glycine, 50 mg/L de myo-inositol, 0,25 mg/L d’acide nicotinique, 0,25 mg/L de chlorhydrate de pyridoxine et 0,05 mg/L de chlorhydrate de thiamine] additionné de 0,25 g/L de MES et ajuster le pH à 5,8 avec 10 M KOH.
- Ajouter 10 g/L d’agar pour créer un milieu MS-solide de force. Stériliser le milieu à 121 ° C pendant 20 min avant de l’utiliser.
2. hydroponique système de montage
Remarque : Ces étapes doivent être suivies méticuleusement pour construire le système hydroponique.
-
Stérilisation de matériel
- Emballer dans le sac de l’autoclave l’embout de la pipette racks (sans cache) qui servira de minitanks. Autoclave les grilles à 121 ° C pendant 20 min, 15 lb/po2.
Remarque : Le panier de pointe de pipette en polypropylène, nous avons utilisé a les dimensions suivantes : 120 mm (longueur) x 89 mm (largeur) x 55 mm (hauteur). La surface plane de pointe de pipette doit avoir un espace pour l’ajout de milieu de culture. Autres supports de pointe peuvent être utilisés (voir Table des matières).
Remarque : Tout au long de la procédure de montage du système hydroponique, il est nécessaire d’utiliser une hotte à flux laminaire, qui doit être nettoyée et désinfectée avec avant l’utilisation d’éthanol à 70 %. L’expérimentateur doit porter une blouse de laboratoire, se laver les mains et toute exposées de la peau et les désinfecter avec l’éthanol à 70 %. Gants sont facultatifs, à l’exception de la demande de drogue. - Nettoyez tous les accessoires décrits ci-dessus (boîtes en plastique jetables, ruban adhésif, pipettes, ciseaux et pinces à épiler) avec l’éthanol à 70 % avant d’entrer dans la hotte à flux laminaire. Si la hotte permet, allumez la lumière UV pendant 10 min avant l’assemblage du système hydroponique afin de maintenir la zone de travail décontaminée.
- Emballer dans le sac de l’autoclave l’embout de la pipette racks (sans cache) qui servira de minitanks. Autoclave les grilles à 121 ° C pendant 20 min, 15 lb/po2.
-
Minitank assemblage
- Sceller la surface supérieure de l’embout de la pipette plat avec du ruban adhésif (Figure 1 b). Si possible, laisser sous exposition aux UV lumière pendant 10 min.
- Ajouter 180 µL fondu solid MS du milieu de culture (tiède) pour chaque bien en utilisant une pipette multicanaux (Figure 1).
Remarque : Lors de la préparation de nombreux chars, utiliser une plaque chauffante pour empêcher le milieu MS de solidification. - Laisser le milieu solidifier complètement (pour environ 30 min).
Remarque : Au cours de la période de la solidification, la lumière UV peut être allumée. - Remplir le panier de pointe de pipette complètement avec milieu de culture liquide MS (Figure 1) et s’assurer il y a un contact étroit entre le solide et le milieu liquide.
- Retirez les bandes adhésives de l’extrados de l’embout de la pipette plat et montez-la sur le rack avec soin. Le système hydroponique est maintenant prêt à recevoir les graines stérilisées.
3. la stérilisation des semences
- Placer 500 graines d’Arabidopsis dans un microtube 1,5 mL. Servir de microtubes nécessaires selon le nombre de plants nécessaires à l’expérience.
- Laver les graines avec de l’éthanol 70 % pendant 2 min avec une agitation douce. Laisser les graines s’installent, puis retirer l’éthanol avec précaution.
- Ajouter 1 mL d’une solution d’hypochlorite de sodium 10 % contenant 2 µL de détergent polysorbate 20. Agiter la solution pendant 5 min. Retirer la solution avec précaution.
- Rincer les graines à l’eau distillée stérile jusqu'à ce que tous les résidus d’eau de Javel sont complètement retirés (environ 5 x).
NOTE : Après la stérilisation en surface, les graines ont été immergés dans l’eau distillée stérile et stratifiées à 4 ° C dans l’obscurité pour 5D synchroniser la germination.
NOTE : Graines de Setaria viridis (adhésion A10.1) sont préincubés dans l’acide sulfurique concentré pendant 15 min (briser la dormance physique), lavés dans l’eau distillée stérile et puis désinfectées avec une solution d’hypochlorite de sodium 5 % contenant 0,1 % de polysorbate 20 pendant 5 min avec une agitation douce21. Les étapes restantes de stérilisation étaient identiques à celles décrites pour les graines d’Arabidopsis .
4. Application de semences
- Couper légèrement l’extrémité d’une pointe µL 200 à l’aide d’un scalpel stérile.
- Pipetter les graines d’Arabidopsis dans le milieu de culture solid sur la surface supérieure du plat de la pipette. Veiller à ce que le milieu ne pas desserrer de l’appartement ; Sinon, les graines sont ombrées et les plants ne seront développera pas correctement (Figure 1E).
Remarque : Utilisez une pince stérile pour graines Setaria (avec l’embryon positionné vers le haut). - Stocker minitanks autant que possible à l’intérieur d’une boîte en plastique jetable pour maintenir une humidité élevée et de garder l’environnement exempt de micro-organismes (Figure 1F).
- Scellez la boîte en plastique jetable soigneusement à l’aide de ruban adhésif pour éviter toute contamination.
- Placer les systèmes hydroponiques dans une chambre de culture avec les conditions de croissance approprié pour l’usine d’intérêt.
Remarque : Dans ce travail, les conditions suivantes ont été utilisées : 75 % d’humidité et 150 µmol m-2 s-1 d’éclairement et de conditions équinoxiales de 12 h de lumière (21 ° C) / 12 h d’obscurité (19 ° C) d’Arabidopsis, ou 300 µmol m-2 s-1 de irradiance et 12 h de lumière (28 ° C) / 12 h d’obscurité (25 ° C) pour Setaria (Figure 1 et 1 H).
5. valider l’utilisation de ce système hydroponique pour inhiber la cible de la rapamycine Kinase
Remarque : Ce système hydroponique a été initialement développé pour faciliter l’administration de substances chimiques aux plantes, qui, en général, sont très chers à appliquer dans les expériences à grande échelle. Comme une preuve de concept, l’inhibiteur compétitif ATP AZD-8055, qui est connu pour cibler spécifiquement le site de liaison ATP du TOR protéine kinase22, a été utilisé pour suivre la répression de l’activité chez les plantules d’a. thaliana Columbia-0 (TOR Le Centre de Nottingham Arabidopsis Stock, NASC ID : N22681). Ici, le protocole utilisé est brièvement décrit.
- Hydroponique graines jusqu'à ce stade 1.04 selon le BBCH échelle23 (pour environ 11 jours) dans les conditions climatiques décrites ci-dessus. Remplacer la solution nutritive, soit avec frais moyen contenant 0,05 % DMSO (contrôle), 2 µM AZD-8055 (inhibiteur de la TOR) dilué dans le DMSO ou sans traitement (mock), à la fin de la nuit (fr).
- Récolter des semis à des moments différents après le traitement et séparez-les dans les racines et les pousses. Congeler les échantillons dans l’azote liquide, broyer en une poudre fine dans un broyeur de robotique (voir Table des matières) et conserver la poudre à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Immunoblot contre formes phosphorylées et non-phosphorylés de 40 s protéine ribosomale S6 (RPS6) selon Dobrenel et al. 24.
- Semis intacts pour dépigmentation de l’échantillon d’eau de Javel, lavez-les à l’eau distillée, les plonger dans une solution d’iode pour 5 min25et photographier les semis dans un stéréomicroscope (0,63 X 7,5 grandeur x objectif et rapprochement de x 20) pour un évaluation qualitative de l’amidon.
- Quantifier l’amidon suite à la dégradation enzymatique et la mesure du glucose libéré par spectrophotométrie par couplant à la réduction du PNDA+ à NADPH26,27.
- Effectuer une extraction d’ARN totale, une synthèse de cDNA et dosages quantitatifs de RT-PCR comme décrit par Caldana et al. 28 pour évaluer le niveau d’expression des gènes liés à différentes sortes de contraintes.
- Éventuellement, cultiver des semis sur un substrat horticole dans des pots en plastique d’une contenance de 0,1 L sous des conditions climatiques similaires [60 % d’humidité, 150 µmol m-2 s-1 de l’éclairement énergétique et équinoxiales conditions de 12 h de lumière (21 ° C) / 12 h d’obscurité (19 ° C )] afin de les comparer avec les plantules cultivées hydroponically.
Remarque : Les gènes cibles utilisées pour les essais d’expression de gène ont été ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), et TPS5 (At4g17770) et leurs niveaux d’expression ont été normalisées qui emploient la méthode delta-Ct29 à l’aide de Act2 (At3g18780) ou PDF2 (At4g04890) comme les gènes de référence interne, en supposant que 100 % de l’efficacité de l’amplification PCR dans l’ensemble de tous les échantillons. Les paires d’oligonucléotide utilisés pour la PCR quantitative ont été : ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC ; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG ; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC ; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG ; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) et PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC ; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
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Representative Results
La kinase TOR est un régulateur majeur qui intègre des éléments nutritifs et l’énergie de signalisation promouvoir la prolifération cellulaire et la croissance chez tous les eucaryotes. Efforts pour élucider les fonctions de TOR chez les plantes incluent la génération d’Arabidopsis lignées transgéniques contenant répression conditionnelle TOR via l’interférence ARN ou des micro-ARN artificiels28,30,31, étant donné le phénotype létal embryon de TOR knockout plantes32,33,34,35. La plupart des lignées transgéniques conditionnelles sont sous le contrôle de l’estradiol, dexaméthasone- ou promoteurs inductibles par l’éthanol, qui pourraient également faire usage de ce système hydroponique.
Une des cibles bien connus de l’activité de TOR dans Arabidopsis est la directe phosphorylation de la protéine ribosomale S6 kinase (S6K)34,36,37,38. Lors de la phosphorylation, S6K outre phosphoryle la protéine ribosomique 40 s S6 (RPS6), qui affectent la protéine ribosomique traduction24,39,40. Récemment, il a été démontré que la phosphorylation d’un site RPS6 Ser240 est un bon marqueur de l' activité de TOR24. Immunoblotting essais ont confirmé que peu de temps après 30 min d’administration des médicaments, une diminution significative de la phosphorylation de Ser240 a été observée dans les racines et les pousses (Figure 2). Dans les conditions expérimentales utilisées, AZD-8055 a également montré un puissant inhibiteur de TOR, qui réprime rapidement son activité kinase.
Les lignées transgéniques d’Arabidopsis avec une réduction de l’expression du gène TOR ou des composants du complex TOR présentent un amidon claire phénotype excès28,31. Analyse qualitative de la fécule à l’aide de la solution de Lugol a révélé le modèle attendu de l’accumulation d’amidon et de la dégradation au cours du cycle nycthéméral (Figure 3). Les semis n’ayant pas reçu une demande de DMSO ou AZD-8055 a montré aucune plus grande accumulation de l’amidon dans leurs feuilles à la fin de la nuit (fr), et l’accumulation de l’amidon chez les plantes de contrôle (qui a reçu 0.05 % DMSO) était conforme à la littérature 41 , 42. en outre, les plantes traitées avec AZD-8055 présenté une plus grande quantité de fécule restant à l’EN par rapport aux semis témoins. Ces résultats montrent l’utilité du système hydroponique proposé dans la croissance des plantules imitant des conditions physiologiques. Ce système a aussi permis la confirmation du phénotype excès amidon typique d’une répression des composants complexes TOR24,28,31.
Teneur en amidon était aussi précisément mesurée à l’aide d’une méthode sensible, ce qui démontre que le traitement AZD-8055 conduit à semis contenant des quantités significativement plus élevées d’amidon aux deux extrémités de la journée (ED) et EN comparaison avec le témoin DMSO plantes (Figure 4). Amidon s’accumule dans les feuilles pendant la journée et est remobilisée pendant la nuit pour soutenir l’activité métabolique, principalement la respiration et l’exportation continue de saccharose aux autres plantes organes41,42. Dans des conditions normales, seule une petite fraction de l’amidon (entre 5 % et 10 % du montant à l’ED) reste à la fr43,44,45. Ces résultats attestent que l’amidon excès phénotype observé sous la répression TOR se produit partout dans le cycle nycthéméral.
Les plantes hydroponiques ont été comparés à des plants cultivés dans un substrat horticole, dans des conditions climatiques très similaires concernant l’expression niveau du facteur favorisant l’acide abscissique liaison élément 3 (ABF3) gène (Figure 5 a ), ce qui directement est en corrélation avec l’interne ABA niveaux, une classe d’hormones largement connu comme un marqueur en raison de son rôle dans plusieurs stress abiotique réponses46,47,,48. Bien que les plants cultivés dans le système hydroponique présentaient une augmentation significative du niveau de ABF3, l’expression de l’asparagine synthétase 1 (ASN1) n’est pas affectée par les traitements de DMSO ou AZD (Figure 5 b). Cependant, tréhalose phosphate synthase 5 (TPS5) augmente significativement après 8 h d’inhibition de TOR (Figure 5 b). ASN1 et TPS5 répondre aux niveaux bas et haut sucre49,50,51,52,53,54, respectivement, ce qui suggère que ces plantes ne connaissaient pas de stress énergétique.
Figure 1 : "Workflow" pour assembler le système hydroponique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effet d’inhibition de TOR sur la phosphorylation de RPS6 dans divers tissus de Arabidopsis thaliana . Immunoblotting montre l’abondance de la RPS6 totale et phosphorylée dans la racine (A) et (B) extraits de pousses de semis traitement avec 2 µM AZD-8055 ou 0,05 % DMSO (contrôle). Les valeurs représentent les ratios normalisés par la protéine non-phosphorylés RPS6. Anticorps anti-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Arabidopsis thaliana semis colorées avec le réactif de Lugol. Traitements avec 2 µM AZD-8055 ou 0,05 % DMSO (contrôle) ont été appliqués à la fr (flèche rouge) et par rapport à des simulacres de semis (non-traitement). Les semis ont été récoltées avant l’application de traitement (0 h) et à 12 h (ED) et 24 h (fr) après le traitement, indiqués par les flèches noires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet d’inhibition de TOR sur la teneur en amidon de Arabidopsis thaliana semis. Amidon a été mesurée par voie enzymatique avant (0 h) et à 12 h (ED) ou 24 heures (fr) après le traitement avec 2 µM AZD-8055 (noir) ou 0,05 % DMSO (contrôle, blanc). Les valeurs indiquées sont la moyenne ± l’écart-type (SE) (n = 4). Des différences significatives entre les semis traitement avec AZD-8055 et DMSO, à l’aide de Student t-test, sont indiquées par des astérisques : * (P < 0,05) et *** (P < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Niveau d’expression de gènes liés au stress. (A) Comparaison des transcriptions de ABF3 en culture hydroponique et semis substrat Arabidopsis Col-0. (B) Comparaison des transcriptions ASN1 et TPS5 dans Arabidopsis semis traités avec 2 µM AZD-8055 et 0.05 % DMSO. Les niveaux d’expression normalisée apparaissent comme des 2^(-dCt). Les valeurs indiquées sont la moyenne ± écart type (n = 3). Des différences significatives, à l’aide de Student t-test, sont indiquées par des astérisques : *** (P < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1:This in vitro système hydroponique permet de synchroniser la germination et d’obtenir des plants homogènes. Graines d' Arabidopsis (C3) et S. viridis (C4) ont été mises à germer directement dans ce système. (A et C) les semis étaient homogènes en ce qui concerne le stade de développement et le traitement a été appliqué après 11 j (Arabidopsis) ou 7D (Setaria). (B et D), les racines se développent directement vers la solution nutritive, facilitant l’ajout de différentes substances et leur absorption. Ces résultats indiquent fortement que ce système offre un environnement optimal pour la croissance des plantes et peut être utilisé pour effectuer efficacement un large éventail de tests. En outre, ce système hydroponique est très utile pour des expériences à grande échelle.
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Discussion
Cette structure hydroponique optimisée permet la culture réussie in vitro de plantes. Les graines germent bien sur le milieu solide à la surface plane de pointe de pipette, un gain considérable par rapport aux systèmes où les graines sont trempées avec la solution nutritive. Un grand avantage de ce système est que, pendant le développement de la plantule, racines obtenir directement en contact avec le milieu liquide sans avoir besoin du transfert. En outre, traitement chimique peut être facilement appliqué dans le milieu liquide dans un volume réduit. Humidité est encore élevée, en évitant l’évaporation de la solution nutritive et sa reconstitution. En outre, croissance homogène et le développement au cours de la mise en place des semis peuvent être facilement obtenues et aération n’est pas requise lorsque vous travaillez avec petites citernes et semis à ce stade de développement1,10,18 . Afin de garantir que le système sera complètement exempt de contaminants, une étape cruciale est la stérilisation du matériel utilisé et les soins intensifs au cours de son Assemblée. En raison de l’impossibilité de stériliser certains composants dans l’autoclave (p. ex., des boîtes en plastique jetables), il est fortement recommandé d’effacer tout d’abord avec l’éthanol à 70 % puis appliquer une courte période d’ultraviolets avant utilisation. Dans notre expérience, l’utilisation de la lumière UV, après avoir scellé la surface plane avec du ruban adhésif et au cours de la solidification de médias, permet également d’éviter la contamination bactérienne et fongique. En outre, être prudent de ne pas y toucher les médias, toujours en mouvement les grilles de la pipette par son côté latéral.
Pour assurer la croissance optimale des semis, il est important de surveiller le contact étroit entre les milieux solides et liquides, assurer l’immersion complète des racines après la germination des graines. Le support solid doit être suffisamment dense (Gélose de 10 g/L) et totalement solidifié pour ne pas à détacher de la surface plane et flotter dans la solution nutritive. En plus de l' Arabidopsis, ce système peut servir pour la culture des autres espèces de plantes, aussi longtemps que les graines sont assez petits pour tenir les puits de l’appartement. En ce sens, la méthode hydroponique présentée ici a été aussi efficace pour la culture Setaria viridis, une petite herbe qui a récemment émergé comme un système nouveau modèle pour l’étude de C4 la photosynthèse, biologie du stress et autres caractéristiques de cultures bioénergétiques 55. comme Arabidopsis, ce système permet de produire des pousses de Setaria uniformément croissants avec un bon système racinaire et à grande échelle (supplémentaire Figure 1), parce que tous ses supports 96 graines, veiller à ce plusieurs plantules par réplicat biologique et, par conséquent, suffisamment de matière pour une multitude d’applications en aval. Un plus grand nombre de répétitions augmente l’efficacité des tests statistiques, conduisant à des résultats plus précis et plus fiables dans des études expérimentales56. Par exemple, à l’aide d’une chambre de culture avec une superficie de seulement 1,5 m2, nous pouvaient pousser 6 000 semis simultanément, ce qui permet d’exécuter cinétique temporelle de la réponse à un traitement souhaité. En outre, les échantillons récoltés peuvent être utilisés pour multiples et complémentaires « omiques » analyse qui peut exiger une grande quantité de tissu (par exemple, immunoblotting). Cette structure hydroponique est d’un intérêt particulier pour les groupes visant à analyser les organes distincts (par exemple, racines et pousses), car elle permet leur séparation facile et rapide.
Un petit nombre d’études décrit l’utilisation de boîtes de pointe de pipette pendant le développement de la plante initiale avant un transfert à plus gros réservoirs hydroponique11,20, et plus récemment, un système très similaire a été utilisé pour évaluer l’amino absorption de l’acide et la translocation dans 5 semaines de plantes Arabidopsis 57. Le protocole décrit ici offre des avantages supplémentaires en termes de cultiver les plantes dans des conditions stériles.
Bien que ce système a été initialement développé pour cultiver des semis, il pourrait également convenir pour les plus grandes plantes. Dans ce scénario, il est à noter qu’il faut placer les graines plus éloignés des uns des autres afin d’éviter tout autant ombrage que possible durant la croissance. En outre, aération peut être introduite dans les grilles de façon à éviter l’hypoxie à travers un puits de la pointe de pipette plate, un problème courant dans des racines d’Arabidopsis submergés pendant de longues périodes de plus en plus. En raison de leur nature sessile, les plantes sont soumises à plusieurs sortes de contraintes abiotiques et biotiques, selon leur milieu environnant. Par conséquent, compte tenu de l’objectif de l’étude et le stade de développement, il serait important de surveiller si les plantes qui poussent dans ce système sont atteints d’une sorte de stress.
Les résultats présentés ici ont montré que ce système hydroponique est très utile pour l’application de produits chimiques à la solution nutritive, en particulier lorsque vous travaillez avec des substances coûteux, en raison du faible volume des paniers embout pipette. Nous avons réussi à utiliser ce système pour réprimer efficacement l’activité de la kinase de TOR par AZD-8055 et a confirmé que l’état de phosphorylation de son objectif en aval RPS6 est déjà affectée après 30 min de demande de traitement. De plus, l’inhibition de TOR aboutit à semis contenant des niveaux plus élevés d’amidon pendant la journée et la nuit par rapport aux semis témoins. Ces tests peuvent être facilement utilisés pour étendre les observations déjà obtenues avec des lignées transgéniques, ce qui permet une répression inductible des composantes de la TOR-gène codant complexe, ou toute autre voie d’intérêt. En résumé, le système hydroponique proposé possède de nombreux avantages car il est très facile et simple à assembler, a un faible coût (les principales composantes sont bon marché et peuvent être largement réutilisés), est polyvalent (permet l’étude des semis intacts ou tissus distincts en particulier, ou le long du stade de DEVELOPPEMENT VEGETAL) et est hautement évolutive (il permet la culture d’un grand nombre de plants dans une très petite zone).
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP ; Accorder 12/19561-0) et la Société Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Caroline C. Monte-Bello (FAPESP ; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP ; Grant 14/07918-6), et Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sommes reconnaissants pour les bourses. Les auteurs remercient Christian Meyer de l’Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, France) pour offrir généreusement anticorps contre RPS6. Les auteurs remercient RTV UNICAMP et Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza pour leur soutien technique au cours de l’audio d’enregistrement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
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