Summary
Eine einfache, vielseitige und preisgünstige in-vitro- Hydrokultur-System wurde erfolgreich optimiert und ermöglichen umfangreiche Experimente unter sterilen Bedingungen. Dieses System erleichtert die Anwendung von Chemikalien in einer Lösung und deren effiziente Absorption von Wurzeln für molekularen, biochemischen und physiologischen Studien.
Abstract
Eine Vielzahl von Studien in Pflanzenbiologie werden mit hydroponischen Kulturen durchgeführt. In dieser Arbeit wird ein in-vitro- Hydroponische Wachstum System für die Bewertung der Pflanze Reaktionen auf Chemikalien und anderen Stoffen von Interesse vorgestellt. Dieses System ist höchst effizient in homogenen und gesunde Setzlinge der C3 und C4 Modell Spezies Arabidopsis Thaliana und Setaria Viridis, bzw. zu erhalten. Der sterile Anbau vermeidet Algen und Mikroorganismen Kontamination, die limitierende Faktoren für Anlage normales Wachstum und Entwicklung in Hydrokultur bekannt sind. Darüber hinaus ist dieses System skalierbar, ermöglicht die Ernte von Pflanzenmaterial in großem Maßstab mit kleinere mechanische Schäden als auch die Ernte der einzelnen Teile einer Pflanze, falls gewünscht. Ein detailliertes Protokoll zeigt, dass dieses System verfügt über eine einfache und kostengünstige Montage, da sie Pipette Racks als wichtigste Plattform verwendet für den Anbau von Pflanzen, steht zur Verfügung. Die Durchführbarkeit dieses Systems war mit Arabidopsis Sämlinge zur Beurteilung der Wirkung des Medikaments AZD-8055, eine chemische das Ziel von Rapamycin (TOR)-Kinase-Inhibitor validiert. TOR-Hemmung wurde effizient so früh wie 30 min nach einer AZD-8055-Behandlung in Wurzeln und Triebe erkannt. Darüber hinaus angezeigt AZD-8055-behandelten Pflanzen den erwarteten Stärke-Überschuss-Phänotyp. Wir diese Hydrokultur-System als eine ideale Methode für Pflanzenforscher mit dem Ziel, die Wirkung der Pflanze Induktoren oder Inhibitoren, sowie zu überwachen, bewerten metabolischen Flüsse mit Isotopen-Kennzeichnung Verbindungen, die in der Regel erfordert die Verwendung von teuren vorgeschlagen Reagenzien.
Introduction
Die Vorteile der Verwendung von Hydrokultur Pflanzen haben in der Produktion von großen und einheitliche Pflanzen ermöglichen reproduzierbare Experimente1,2,3weithin anerkannt. In diesem System kann die Zusammensetzung der Nährlösung ordnungsgemäß kontrolliert und recycelt alle Stufen von Wachstum und Entwicklung. Darüber hinaus sind Wurzeln nicht abiotischen Belastungen ausgesetzt, wie im Boden gewachsen Pflanzen, wie Nährstoff Hunger und Wasser-Mangel4auftreten können. Als Pflanzen hydroponisch vorliegende morphologische und physiologische Eigenschaften ziemlich ähnlich denen in Erde kultiviert hat dieses System im großen und ganzen in der Forschung tätig weil es erlaubt, die Überwachung der Wurzel/Sprosswachstum und ihre Ernte ohne Verletzungen2,5.
Aufgrund der Möglichkeit der Änderung der Zusammensetzung und Konzentration von der Nährlösung der Großteil der Forschung mit Hydrokultur Bedingungen durchgeführt wurde, um die Funktionen von Mikro- und Makronährstoffen1,3 charakterisieren ,6,7,8. Allerdings hat dieses System erwies sich als sehr nützlich, um ein breites Anwendungsspektrum in Pflanzenbiologie, wie die Funktionen von Hormonen und Chemikalien in Pflanzen aufzuklären. Zum Beispiel wurden die Entdeckung des Strigolactones als eine neue Klasse von Hormonen9 und der beschleunigten Wachstums Phänotyp ausgelöst durch Brassinosteroid Anwendung10 Hydrokultur Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus ermöglicht dieses System Experimente mit beschrifteten Isotope (z.B., 14N /15N und 13CO2)11,12 , deren Eingliederung in Proteinen und Metaboliten zu bewerten durch Massenspektrometrie.
In Anbetracht der Bedeutung dieses Systems in der Pflanzenforschung, eine hohe Anzahl von hydroponischen Kulturen wurde in den letzten Jahren, einschließlich Systeme, mit denen (i) die Übertragung der Sämlinge aus Platten auf Hydrokultur Container3, 13; (Ii) Rockwool, die Zugang zu den frühen Stadien der Wurzel Entwicklung2,14,15begrenzt; (Iii) Polyethylen-Granulat als Schwimmkörper, wodurch die einheitliche Anwendung der kleinen Moleküle/Behandlungen schwierig16; oder (iv) eine reduzierte Anzahl von Pflanzen9,17. Das Volumen der Hydrokultur Panzer beschrieben in vielen dieser Protokolle sind in der Regel groß (kleine Volumen von 1-5 L, bis zu 32 L)18, die die Anwendung von Chemikalien extrem teuer macht. Obwohl einige Studien eine Hydrokultur unter aseptischen Bedingungen8,beschreiben ist19, die Montage des Systems in der Regel ziemlich mühsam, bestehend aus die perfekte Abstimmung von Nylon Maschen in Kunststoff oder Glas Container5,8,17,20.
Wegen der Bedeutung als Modellpflanze Arabidopsis Thaliana wurden die Mehrheit der Hydroponik-Systeme für diese Arten1,2,8,14,18, entwickelt. 19 , 20. Dennoch gibt es einige Studien, die die Hydroponische Wachstum Berichtsfunktionen anderer Pflanzenarten mit eine Vorbehandlung der Samen ihre Keimfähigkeit zu verbessern und Synchronisation Preise in-vitro-8,16 . Um im großen Maßstab zu arbeiten, entwickelten wir ein Protokoll für eine einfache und kostengünstige Wartung Hydrokultur-System, mit dem sterile Bedingungen für den Anbau von Pflanzen, darunter A. Thaliana und andere Arten, wie der Rasen Setaria kann einrichten Viridis. Die hier beschriebene Methode eignet sich für verschiedene Experimente, wie das Wachstum des Keimlings maximiert, synchronisiert und leicht überwacht werden kann. Dieses System hat viele Vorteile wie: (i) die Montage ist unkompliziert und seiner Komponenten wiederverwendet werden; (Ii) es ermöglicht die einfache Anwendung von verschiedenen Chemikalien in das flüssige Medium; (Iii) die Sämlinge Keimen und wachsen direkt in das Kulturmedium ohne die Notwendigkeit der Übertragung der Hydrokultur-System; (iv) das schießen und Wurzel Entwicklung/Wachstum eng überwacht werden können und die Keimlinge geerntet werden, ohne Schäden; und (V) es macht es möglich, auf einer großen Skala arbeiten Aufrechterhaltung der physiologischen Bedingungen.
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Protocol
1. Vorbereitung von flüssigen und festen Nährmedien
- Bereiten Sie ein flüssiges Medium mit Hälfte-Stärke Murashige und Skoog (MS) Medium mit Vitaminen [0,0125 mg/L von cobalt(II) chlorid Pentahydrat, 0,0125 mg/L Sulfat-Pentahydrat Kupfer(II), 18,35 mg/L Eisen Natrium Ethylenediaminetetraacetate, 3,10 mg/L Borsäure, Kaliumjodid, 8,45 mg/L Mangan 0,415 mg/L Sulfat Monohydrat, 0,125 mg/L Natrium Molybdat Dihydrat, 4,30 mg/L von Zinksulfat-Heptahydrat, 166,01 mg/L Kalzium-Chlorid, 85 mg/L Kalium Dihydrogen Phosphat, 950 mg/L Kaliumnitrat, 90,27 mg/L Magnesium-Sulfat, 825 mg/L von Ammoniumnitrat, 1 mg/L von Glycin, 50 mg/L von Myo-Inositol, 0,25 mg/L von Nikotinsäure, 0,25 mg/L von Pyridoxin Hydrochlorid und 0,05 mg/L von Thiamin Hydrochlorid] ergänzt mit 0,25 g/L MES, und passen Sie den pH-Wert auf 5,8 mit 10 M KOH.
- Fügen Sie 10 g/L Agar, ein halb-Stärke MS-Solid Medium zu machen. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min vor dem Gebrauch des Mediums.
(2) hydroponic System Montage
Hinweis: Diese Schritte sorgfältig befolgt werden um die hydroponic System zu bauen.
-
Materiellen Sterilisation
- Verpacken Sie in den Autoklaven Tasche die PIPETTENSPITZE Racks (ohne Deckel), die als Minitanks verwendet werden. Autoklaven der Racks bei 121 ° C für 20 min, 15 Psi.
Hinweis: Das Polypropylen Pipette Tipp Rack wir verwendet hatten folgenden Dimensionen: 120 mm (Länge) x 89 mm (Breite) x 55 mm (Höhe). Die Pipette Spitze flache Oberfläche muss einen Bereich für den Zusatz von Kulturmedium aufweisen. Andere Tipp-Racks verwendet werden (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Während die Montage des hydroponischen Systems ist es notwendig, eine laminare Strömung Haube, verwenden die gereinigt und mit 70 % igem Ethanol vor dem Gebrauch desinfiziert werden müssen. Der Experimentator muss einen Laborkittel zu tragen, waschen Sie ihre Hände und ausgesetzt Haut und mit 70 % Ethanol zu desinfizieren. Handschuhe sind optional, mit Ausnahme der Zulassungsantrag. - Reinigen Sie alle Zubehörteile, die beschriebenen (Einweg-Kunststoff-Boxen, Klebeband, Pipetten, Scheren und Pinzetten) mit 70 % Ethanol vor dem Betreten der Laminar-Flow-Haube. Wenn die Haube erlaubt, schalten Sie das UV-Licht für 10 min vor der Montage der Hydrokulturen-Systems um den Arbeitsbereich dekontaminiert zu halten.
- Verpacken Sie in den Autoklaven Tasche die PIPETTENSPITZE Racks (ohne Deckel), die als Minitanks verwendet werden. Autoklaven der Racks bei 121 ° C für 20 min, 15 Psi.
-
Minitank Montage
- Versiegeln Sie die Oberfläche der Pipettenspitze flach mit Klebeband (Abbildung 1 b). Wenn möglich, lassen Sie es unter UV-Licht für 10 Minuten.
- 180 µL geschmolzene solide MS Kulturmedium (leicht warm) hinzu kommt jeder gut mit einer Mehrkanal-Pipette (Abbildung 1).
Hinweis: Wenn Sie viele Panzer vorbereiten, verwenden Sie eine Herdplatte um zu verhindern, dass die MS Medium erstarren. - Lassen Sie das Medium vollständig (für ca. 30 min) zu festigen.
Hinweis: Zur Zeit der Erstarrung kann das UV-Licht eingeschaltet werden. - Füllen Sie die Pipette Tipp Rack komplett mit flüssigem MS Kulturmedium (Abbildung 1) und stellen Sie sicher, es ist ein enger Kontakt zwischen der festen und flüssigen Medien.
- Entfernen der Klebebänder der oberen Oberfläche des flachen Pipettenspitze und sorgfältig auf das Gestell passt. Hydrokultur-System ist jetzt bereit, die sterilisierten Samen zu empfangen.
3. Samen Sterilisation
- Legen Sie 500 Arabidopsis Samen in einem 1,5 mL reaktionscup. Verwenden Sie möglichst viele mikroröhrchen nach Bedarf entsprechend der Anzahl der Pflanzen für das Experiment benötigt.
- Waschen Sie die Samen mit 70 % Ethanol, 2 min mit einer sanften Bewegung. Lassen Sie die Samen niederzulassen, dann entfernen Sie vorsichtig das Ethanol.
- Fügen Sie 1 mL einer 10 % Natriumhypochlorit-Lösung mit 2 µL Polysorbat 20 Reinigungsmittel. Schütteln Sie der Lösung für 5 min. entfernen die Lösung sorgfältig.
- Spülen Sie die Samen mit sterilem destilliertem Wasser, bis alles, was die Bleichmittel Rückstände vollständig ist (ca. 5 X) entfernt.
Hinweis: Nach der Oberfläche Sterilisation, die Samen wurden in sterilem destilliertem Wasser eingetaucht und geschichtet bei 4 ° C im Dunkeln für 5D um die Keimung zu synchronisieren.
Hinweis: Samen von Setaria Viridis (Beitritt A10.1) wurden preincubated in konzentrierter Schwefelsäure für 15 min (, die physische Keimruhe zu brechen), in sterilem destilliertem Wasser gründlich gewaschen und dann mit einer 5 % igen Natriumhypochlorit-Lösung disinfested 0,1 % Polysorbat 20 für 5 min mit einer sanften Bewegung21enthalten. Die verbleibenden Schritte der Sterilisation waren identisch mit denen für Arabidopsis Samen beschrieben.
(4) Seed-Anwendung
- Schneiden Sie leicht der Extremität von 200 µL Tipp mit Hilfe von einem sterilen Skalpell.
- Pipette die Arabidopsis -Samen in festen Nährmedium auf der oberen Fläche der Pipettenspitze flach. Achten Sie darauf, dass das Medium nicht aus der Wohnung lösen kann; andernfalls die Samen schattiert und die Sämlinge wachsen nicht richtig (Abbildung 1E).
Hinweis: Verwenden Sie eine sterile Pinzette für Setaria Samen (mit dem Embryo nach oben positioniert). - Speichern Sie so viele Minitanks wie möglich innerhalb einer Einweg-Kunststoff-Box, eine hohe Luftfeuchtigkeit und die Umgebung frei von Mikroorganismen (Abbildung 1F) halten.
- Der Einweg-Kunststoff-Box, sorgfältig mit Klebeband zur Vermeidung von Kontaminationen zu versiegeln.
- Legen Sie die Hydroponische Systeme in ein Wachstum Kammer mit den geeigneten Wachstumsbedingungen für die Anlage von Interesse.
Hinweis: In dieser Arbeit wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 75 % Luftfeuchtigkeit und 150 µmol m-2 s-1 Bestrahlungsstärke und äquatorialer Bedingungen von 12 h Licht (21 ° C) / 12 h dunkel (19 ° C) für Arabidopsisoder 300 µmol m-2 s-1 Bestrahlungsstärke und 12 h Licht (28 ° C) / 12 h dunkel (25 ° C) für Setaria (Abbildung 1 und 1 H).
(5) Validierung die Verwendung von diesem Hydroponic System Target of Rapamycin-Kinase hemmen
Hinweis: Diese Hydrokultur-System wurde ursprünglich entwickelt, um die Verwaltung von Chemikalien zu Pflanzen, zu erleichtern, sind im Allgemeinen sehr teuer in groß angelegten Experimenten angewendet werden. Als ein Proof of Concept wurde die ATP-kompetitiver Inhibitor AZD-8055, das bekannt ist, gezielt die ATP-Bindungsstelle des TOR Protein Kinase22, eingesetzt, um die Unterdrückung der TOR-Aktivität in Sämlinge von A. Thaliana Columbia-0 (folgen Die Nottingham Arabidopsis Lager Zentrum, NASC-ID: N22681). Das verwendete Protokoll wird hier kurz beschrieben.
- Wachsen Sie Samen hydroponisch bis Bühne 1,04 nach dem BBCH skalieren23 (für etwa 11 d) unter den klimatischen Bedingungen, die oben beschriebenen. Ersetzen die Nährlösung, entweder mit frischen Medium mit 0,05 % DMSO (Kontrolle), 2 µM AZD-8055 (TOR-Inhibitor) verdünnt in DMSO oder ohne Behandlung (Mock), am Ende der Nacht (EN).
- Einige Sämlinge zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung zu ernten und in Wurzeln und Triebe zu trennen. Die Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren, zu einem feinen Pulver in einer Roboter-Mühle zu mahlen (siehe Tabelle der Materialien), und das Pulver bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
- Immunoblot gegen phosphorylierten und nicht phosphoryliert Formen der 40er Jahre ribosomale Protein S6 (RPS6) nach Dobrenel Et al. 24.
- Bleichen intakt Sämlinge für Probe Depigmentierung, in destilliertem Wasser zu waschen, tauche sie ein in eine Jod-Lösung für 5 min25und fotografieren die Sämlinge in ein Stereomikroskop (0,63 X Ziel, 20 X Annäherung und 7,5 X Größe) für eine qualitative Beurteilung des Stärkegehalts.
- Quantifizierung der Stärke nach der enzymatischen Abbau und Messung der freigesetzten Glucose spektralphotometrisch indem man es zur Reduktion von NADP+ an NADPH26,27.
- Führen Sie eine total RNA-Extraktion, eine cDNA-Synthese und quantitative RT-PCR-Assays wie beschrieben von Caldana Et al. 28 , die Expression von Genen im Zusammenhang mit verschiedenen Arten von Belastungen zu bewerten.
- Optional, wachsen Sie Sämlinge auf einem Gartenbau Substrat in plastiktöpfen mit einer 0,1 L Fassungsvermögen unter ähnlichen klimatischen Bedingungen [60 % Luftfeuchtigkeit, 150 µmol m-2 s-1 der Bestrahlungsstärke und äquatorialer Bedingungen von 12 h Licht (21 ° C) / 12 h dunkel (19 ° C [)] um diese mit Setzlingen hydroponisch vergleichen.
Hinweis: Die Zielgene für die Gen-Expression-Assays verwendet wurden ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), und TPS5 (At4g17770) und deren Ausdruck Niveaus wurden normalisiert, beschäftigt die Delta-Ct Methode29 mit ACT2 (At3g18780) oder PDF2 (At4g04890) als die interne Referenz-Gene, vorausgesetzt 100 % der PCR-Amplifikation Effizienz über alle Proben. Die Oligonukleotid-Paare für die quantitative PCR verwendet wurden: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) und PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
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Representative Results
TOR-Kinase ist ein wichtiger Regulator, der Nährstoff- und Förderung der Zellproliferation und Wachstum in allen Eukaryoten Signalisierung integriert. Bemühungen, TOR-Funktionen in Pflanzen aufzuklären beinhalten die Generation der Arabidopsis transgenen Linien mit TOR bedingte Unterdrückung durch RNA-Interferenz oder künstliche MicroRNA28,30,31, Angesichts den Embryo tödliche Phänotyp TOR ko Pflanzen32,33,34,35. Die meisten bedingte transgenen Linien sind unter der Kontrolle von Östradiol-Dexamethason oder Ethanol-induzierbaren Promotoren, die auch machen könnte diese Hydrokultur-System nutzen.
Eines der bekannten Ziele der TOR-Aktivität in Arabidopsis ist die direkte Phosphorylierung der ribosomalen Proteins S6 Kinase (S6K)34,36,37,38. Nach Phosphorylierung, phosphorylates S6K weitere 40 s ribosomalen Proteins S6 (RPS6), beeinflussen die ribosomale Protein Übersetzung24,39,40. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass die Phosphorylierung einer RPS6 Ser240-Site ein guter Marker für TOR Aktivität24 ist. Immunoblotting Tests bestätigt, dass bald nach 30 min von Medikamentengabe, ein deutlichen Rückgang der Ser240 Phosphorylierung in Wurzeln und Triebe (Abbildung 2) beobachtet wurde. Unter den experimentellen Bedingungen verwendet hat AZD-8055 auch gezeigt, ein potenter Inhibitor der TOR, der schnell die Kinase-Aktivität unterdrückt.
Transgene Arabidopsis -Linien mit einer reduzierten Expression des Gens TOR oder Komponenten der komplexen TOR präsentieren eine klare Stärke überschüssige Phänotyp28,31. Qualitative Analyse der Stärke mit Lugol Lösung offenbart das erwartete Muster der Stärke Akkumulation und Abbau während der Diel-Zyklus (Abbildung 3). Sämlinge, die keine Anwendung von DMSO oder AZD-8055 erhielten zeigte keine größere Ansammlung von Stärke in den Blättern am Ende der Nacht (EN), und die Stärke-Akkumulation in den kontrollpflanzen (die 0,05 % DMSO erhalten) Stand im Einklang mit der Literatur 41 , 42. Darüber hinaus präsentiert Pflanzen mit AZD-8055 behandelt eine größere Menge der verbleibenden Stärke im Vergleich zu der Kontrolle Sämlinge EN. Diese Ergebnisse zeigten die Nützlichkeit des vorgeschlagenen hydroponischen Systems in wachsende Sämlinge imitiert physiologische Bedingungen. Dieses System ermöglichte auch die Bestätigung der Stärke überschüssige Phänotyp typisch für eine Unterdrückung der TOR komplexe Bauteile24,28,31.
Stärkegehalt war auch genau gemessen mit einer sensiblen Methodik, zeigen, dass die AZD-8055-Behandlung zu Sämlinge mit einem deutlich höheren Gehalt an Stärke am Ende des Tages (ED) geführt und EN im Vergleich zur Kontrolle DMSO behandelt Pflanzen (Abbildung 4). Stärke in den Blättern sammelt sich während des Tages und wird über Nacht reaktiviert, um metabolische Aktivität, vor allem die Atmung und die fortlaufende Export von Saccharose zu anderen pflanzlichen Organe41,42aufrecht zu erhalten. Unter normalen Bedingungen bleibt nur ein kleiner Bruchteil von Stärke (zwischen 5 % und 10 % des Betrages an die ED) EN43,44,45. Diese Ergebnisse bestätigt, dass die Stärke, die überschüssige Phänotyp unter die TOR-Unterdrückung beobachtet alles über den Diel-Zyklus auftritt.
Hydroponisch angebaute Pflanzen wurden im Vergleich zu Sämlinge angebaut in einem Gartenbau Substrat unter sehr ähnlichen klimatischen Bedingungen bezüglich des Ausdrucks von der Abscisic Säure-responsive Element-bindungsfaktor 3 (ABF3)-Gen (Abbildung 5A ), welche direkt korreliert mit internen ABA Ebenen, eine Klasse von Hormonen, die weithin als eine Markierung wegen seiner Rolle in mehreren abiotischen Stress Antworten46,47,48. Obwohl Sämlinge angebaut in der Hydrokultur-System eine deutliche Steigerung des Niveaus der ABF3präsentiert hat, war die Expression von Asparagin Synthase 1 (ASN1) die DMSO oder AZD Behandlungen (Abb. 5 b) nicht betroffen. Jedoch Trehalose-Phosphat-Synthase 5 (TPS5) wurde nach 8 h TOR Hemmung (Abb. 5 b) deutlich erhöht. ASN1 und TPS5 reagieren auf niedrigen und hohen Zucker Ebenen49,50,51,52,53,54, beziehungsweise, was darauf hindeutet dass diese Pflanzen nicht energisch Stress erlebten.
Abbildung 1 : Workflow für die Montage der Hydrokulturen-Systems. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Wirkung der TOR-Hemmung auf den RPS6 Phosphorylierung in verschiedenen Geweben von Arabidopsis thaliana . Immunoblotting zeigt die Fülle der Gesamt- und phosphorylierten RPS6 im Stamm (A) und (B) schießen Extrakte der Keimlinge mit 2 µM AZD-8055 oder 0,05 % DMSO (Kontrolle) behandelt. Werte repräsentieren die Verhältnisse durch das Protein nicht phosphoryliert RPS6 normiert. Anti-Aktin-Antikörper diente als ein Steuerelement laden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Arabidopsis thaliana Sämlinge mit Lugol Reagenz befleckt. Behandlungen mit 2 µM AZD-8055 oder 0,05 % DMSO (Kontrolle) waren in der EN (roter Pfeil) aufgetragen und verglichen, um Sämlinge (keine-Behandlung) zu verspotten. Sämlinge wurden vor der Behandlung Anwendung (0 h) geerntet und um 12 h (ED) und 24 h (EN) nach der Behandlung durch Schwarze Pfeile angedeutet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Wirkung der TOR-Hemmung auf den Stärkegehalt der Arabidopsis thaliana Sämlinge. Stärke enzymatisch vor (0 h) gemessen wurde und um 12 h (ED) oder 24 h (EN) nach der Behandlung mit 2 µM AZD-8055 (schwarz) oder 0,05 % DMSO (Control, weiß). Die angezeigten Werte sind der Mittelwert ± Standardfehler (SE) (n = 4). Signifikante Unterschiede zwischen Sämlinge behandelt mit AZD-8055 und DMSO, mit Student t-test, sind mit Sternchen gekennzeichnet: * (P < 0,05) und *** (P < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Ausdruck Ebene der betonen-in Verbindung stehende Gene. (A) Vergleich von ABF3 Abschriften in Hydrokultur und Substrat gewachsen Arabidopsis Col-0 Sämlinge. (B) Vergleich der ASN1 und TPS5 Transkripte in Arabidopsis Sämlinge behandelt mit 2 µM AZD-8055 und 0,05 % DMSO. Die normalisierte Ausdruck Niveaus werden als 2^(-dCt) angezeigt. Die angezeigten Werte sind der Mittelwert ± SE (n = 3). Signifikante Unterschiede mit der Student t-test, sind mit Sternchen gekennzeichnet: *** (P < 0,001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung 1:dieses in-vitro- Hydrokultur-System ermöglicht es, Keimung zu synchronisieren und zu homogenen Sämlinge erhalten. Samen von A. Thaliana (C3) und S. Viridis (C4) wurden direkt in dieses System gekeimt. (A und C) waren die Sämlinge homogen in Bezug auf die Entwicklungsstufe und die Behandlung nach 11d (Arabidopsis) oder 7D (Setaria) angewendet wurde. (B und D) wachsen die Wurzeln direkt in Richtung der Nährlösung, die Zugabe von verschiedenen Substanzen und deren Absorption zu erleichtern. Diese Ergebnisse zeigen nachdrücklich, dass dieses System ein optimales Umfeld für das Pflanzenwachstum bietet und verwendet werden, kann um effizient eine Vielzahl von Tests durchführen. Darüber hinaus ist dieser Hydrokultur-System sehr nützlich für umfangreiche Experimente.
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Discussion
Diese optimierte Hydrokultur Struktur ermöglicht die erfolgreiche in-vitro- Kultur von Pflanzen. Die Samen keimen gut auf festem Medium an der Pipette Spitze flache Oberfläche, ein erheblicher Gewinn im Vergleich zu Systemen, wo die Samen mit der Nährlösung getränkt sind. Ein großer Vorteil dieses Systems ist, dass während der Sämling-Entwicklung, Wurzeln direkt in Kontakt mit dem flüssigen Medium ohne die Notwendigkeit der Übertragung. Darüber hinaus kann chemischer Behandlung leicht in das flüssige Medium im reduzierten Umfang angewendet werden. Luftfeuchtigkeit ist hoch, die Verdunstung von der Nährlösung und seinen Nachschub zu vermeiden gehalten. Darüber hinaus homogenes Wachstum und Entwicklung während der Einrichtung der Keimling leicht erzielt werden, und Belüftung ist nicht erforderlich, beim Arbeiten mit kleinen Behältern und Sämlinge in diesem Entwicklungsstadium1,10,18 . Um zu gewährleisten, dass das System völlig frei von Verunreinigungen sein wird, ist ein entscheidender Schritt während der Montage die Sterilisation von Materialien verwendet und Intensivmedizin. Aufgrund der Unmöglichkeit, einige Komponenten in den Autoklaven (z.B. Einweg-Kunststoff-Boxen) zu sterilisieren ist es dringend empfohlen, zunächst mit 70 % Ethanol zu löschen und dann bewerben Sie sich kurzfristig von UV-Licht vor dem Gebrauch. Nach unserer Erfahrung vermeidet die Verwendung von UV-Licht, nach der Versiegelung der Fläche mit Klebeband und während der Erstarrung Medien auch bakterielle und Pilzinfektionen Kontamination. Darüber hinaus seien Sie vorsichtig, nicht zu die Medien, immer in Bewegung die Pipette Racks durch seine seitliche Seite berühren.
Um das optimale Wachstum der Sämlinge zu gewährleisten, ist es wichtig, den engen Kontakt zwischen festen und flüssigen Medien, gewährleistet das komplette Eintauchen der Wurzeln nach der Keimung der Samen zu überwachen. Die feste Medium muss ausreichend dicht sein (10 g/L Agar) und völlig erstarrte nicht zu lösen von der glatten Oberfläche und schweben in der Nährlösung. Neben Arabidopsiskann dieses System für den Anbau von anderen Pflanzenarten verwendet werden, solange die Samen klein genug sind, um die Brunnen der Wohnung passen. In diesem Sinne war die Hydrokultur, die hier vorgestellte Methode auch effizient für den Anbau von Setaria Viridis, einem kleinen Rasen, die vor kurzem als neuartige Modellsystem zur Untersuchung C4 Photosynthese, Stress Biologie und andere Bioenergie Ernte Merkmale entstanden ist 55. ähnlich wie bei Arabidopsis, dieses System ermöglicht es, um einheitlich wachsenden Setaria Sämlinge mit ein gutes Wurzelwerk und im großen Maßstab zu produzieren (ergänzende Abbildung 1), weil jedes Rack 96 Samen unterstützt, Gewährleistung viele Sämlinge pro biologische replizieren und somit ausreichend Material für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen. Eine höhere Anzahl von Wiederholungen erhöht die Effizienz der statistischen Tests, genauere und zuverlässigere Ergebnisse in experimentellen Studien56. Zum Beispiel konnten mit Hilfe einer Wachstums-Kammer mit einer Fläche von nur 1,5 m2, wir 6.000 Sämlinge wachsen gleichzeitig macht es möglich, zeitliche Kinetik der Reaktion auf eine gewünschte Behandlung durchzuführen. Darüber hinaus die geernteten Proben eignen sich für Multiple und ergänzende "Omics" analysiert, die eine große Menge an Gewebe (z.B. Immunoblotting) verlangen können. Diese Hydroponische Struktur ist von besonderem Interesse für Gruppen mit dem Ziel, die unterschiedlichen PFLANZENORGANEN (z.B., Wurzeln und Triebe), zu analysieren, weil es ihre einfache und schnelle Trennung ermöglicht.
Eine kleine Anzahl von Studien beschrieben die Verwendung von Pipette Tip-Boxen während der anfänglichen Pflanzenentwicklung vor einer Übertragung auf größere Hydrokultur Panzer11,20, und in jüngerer Zeit, ein sehr ähnliches System wurde eingesetzt, um die amino bewerten saure Aufnahme und Translokation in 5 Wochen altes Baby Arabidopsis Pflanzen57. Das hier beschriebene Protokoll bietet weitere Vorteile in Bezug auf den Anbau der Pflanzen unter sterilen Bedingungen.
Obwohl dieses System ursprünglich entwickelt wurde, um Sämlinge wachsen, könnte es auch für größere Anlagen geeignet. In diesem Szenario ist es erwähnenswert, dass darauf geachtet werden muss, legen Sie die Samen weiter entfernt von einander, so viel Schatten wie möglich während des Wachstums zu vermeiden. Darüber hinaus kann Belüftung in den Racks, Hypoxie durch einen Brunnen die PIPETTENSPITZE flach, ein häufiges Problem bei getauchten Arabidopsis Wurzeln wachsen über einen längeren Zeitraum zu verhindern eingeführt werden. Pflanzen sind aufgrund ihrer Traubeneichen mehrere Arten von abiotischen und biotischen betont, je nach ihrer Umgebung ausgesetzt. Daher, wenn man bedenkt das Ziel der Studie und der Entwicklungsphase möglicherweise wichtig, wenn die Pflanzen wachsen in diesem System eine Art von Stress leiden zu überwachen.
Die hier vorgestellten Ergebnisse haben gezeigt, dass diese Hydrokultur-System sehr nützlich für die Anwendung von Chemikalien auf die Nährlösung ist, besonders bei der Arbeit mit teuren Stoffen, aufgrund des geringen Volumens der Pipette Tipp Regale. Wir haben mit diesem System effektiv unterdrücken die Aktivität der TOR-Kinase durch AZD-8055 gelungen und bestätigt, dass der Phosphorylierung Status seiner nachgelagerten Zieles RPS6 bereits nach 30 min Behandlung Anwendung betroffen ist. Darüber hinaus führt TOR Hemmung zu Sämlinge mit höherer Stärke bei Tag und Nacht im Vergleich zu der Kontrolle Sämlinge. Solche Tests können leicht eingesetzt werden, um die Beobachtungen erzielten mit transgenen Linien, ermöglicht einen induzierbaren Unterdrückung der Gen-Codierung Komponenten der TOR Komplex, oder jeder andere Weg von Interesse zu verlängern. Zusammenfassend lässt sich sagen, die vorgeschlagenen Hydroponische System hat viele Vorteile, weil es sehr leicht und einfach zu montieren ist, hat einen niedrigen Kosten (die Hauptkomponenten sind billig und können weitgehend wiederverwendet werden), ist vielseitig (ermöglicht die Untersuchung von intakten Sämlinge oder unterschiedliche Gewebe im besonderen oder entlang Entwicklungsstadien der Pflanze), und ist hochgradig skalierbar (es erlaubt den Anbau einer großen Anzahl von Sämlingen in einem sehr kleinen Gebiet).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Forschungsgemeinschaft von São Paulo (FAPESP; Gewähren Sie 12/19561-0) und der Max-Planck-Gesellschaft. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14-3/10407), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), und Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sind dankbar für die Stipendien. Die Autoren danken für die großzügige Bereitstellung von Antikörpern gegen RPS6 Christian Meyer vom Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankreich). Die Autoren danken RTV UNICAMP und Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel für ihre technische Unterstützung während der Audio aufzeichnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
- Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
- Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
- Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
- Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
- Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
- Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
- Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
- Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
- Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
- Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
- Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
- Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
- Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
- Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
- Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
- Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
- Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
- Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
- Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
- Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
- Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
- Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
- Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
- Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
- Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
- Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
- Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
- Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
- Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
- Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
- Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
- Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
- Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
- Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
- Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
- Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
- Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
- Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
- Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
- Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
- Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
- Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
- Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
- Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
- Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
