Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En flexibel lågpris hydroponiska System för bedömning av anläggningen Svaren till små molekyler i sterila förhållanden

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57800
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 1,2, 1, 1,5
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE), Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE, CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM), Max Planck Partner Group
* These authors contributed equally

Summary

En enkel, mångsidig och billig i vitro hydroponiska system optimerade framgångsrikt, aktivera storskaliga experiment under sterila förhållanden. Detta system underlättar tillämpningen av kemikalier i en lösning och deras effektiv absorption av rötter för molekylära, biokemiska och fysiologiska studier.

Abstract

Ett brett utbud av studier i växtbiologi utförs med hydroponiska kulturer. I detta arbete presenteras en in vitro- hydroponiska tillväxt system som utformats för att bedöma växt Svaren till kemikalier och andra ämnen av intresse. Detta system är mycket effektiva i att få homogena och friska plantor av C3 och C4 modell arter Arabidopsis thaliana och Setaria viridis, respektive. Steril odling undviker alger och mikroorganism förorening, som är kända begränsande faktorer för växternas normala tillväxt och utveckling i hydrokultur. Detta system är dessutom skalbar, så att skörden av växtmaterial i stor skala med mindre mekaniska skador, samt skörden av enskilda delar av en anläggning, om så önskas. Ett detaljerat protokoll som visar att detta system har en enkel och billig församling, som den använder pipetten rack som den huvudsakliga plattformen för odling av växter, tillhandahålls. Genomförbarheten av detta system har validerats med Arabidopsis plantor för att bedöma effekten av drogen AZD-8055, en kemiska hämmare av målet rapamycin (TOR)-Kinas. TOR hämning upptäcktes effektivt så tidigt som 30 min efter en AZD-8055 behandling i rötter och skott. Dessutom visas AZD-8055-behandlade växter den förvänta stärkelse-överskott fenotypen. Vi föreslog detta hydroponiska system som en idealisk metod för växt forskare som syftar till att övervaka effekten av växt-inducerare eller -hämmare, samt att bedöma metabola flöden använder isotop-märkning föreningar, som i allmänhet kräver användning av dyra reagenser.

Introduction

Fördelarna med odling av växter med hjälp av hydroponics har varit allmänt kända i produktion av stora och enhetliga växter, aktivera reproducerbara experiment1,2,3. I detta system, kan sammansättningen av nutritive lösningen kontrolleras ordentligt och återvunnet längs alla stadier i växternas tillväxt och utveckling. Dessutom utsätts rötter inte för abiotisk stress, som kan hända i jord-odlade växter, såsom näringsämne svält och vatten brist4. Som växter som odlas hydroponically närvarande morfologiska och fysiologiska egenskaper ganska liknande dem som odlade i jord, har detta system varit i stort sett anställd i forskningen eftersom den tillåter övervakning av root/skjuta tillväxt och deras skörd utan skador2,5.

På grund av möjligheten att ändra sammansättning och koncentration av nutritive lösning, forskningen använder hydroponiska villkor har genomförts för att karakterisera funktionerna av mikro- och makronäringsämnen1,3 ,6,7,8. Detta system har dock visat sig vara mycket användbar för ett brett spektrum av applikationer i växtbiologi, sådan att belysa funktioner hormoner och kemikalier i växter. Exempelvis upptäckten av strigolactones som en ny klass av hormoner9 och accelererad tillväxt fenotypen utlöses av brassinosteroid ansökan10 utfördes hydroponiska villkor. Dessutom, detta system gör experiment med märkta isotoper (t.ex., 14N /15N och 13CO2)11,12 att utvärdera deras införlivande i proteiner och metaboliter genom masspektrometri.

Som beaktar betydelsen av detta system i växtforskning, ett stort antal hydroponiska kulturer har utformats under de senaste åren, inklusive system som använder (i) överföringen av plantor från plåtar till hydroponiska behållare3, 13; (ii) rockwool som begränsar tillgången till de tidiga stadierna av roten utveckling2,14,15. (iii) polyeten granulat som flytande kroppen, vilket gör en enhetlig tillämpning av små molekyler/behandlingar svårt16; eller (iv) ett minskat antal växter9,17. Volymen av hydroponiska tankar beskrivs i många av dessa protokoll är vanligtvis stora (små volymer som sträcker sig från 1-5 L, upp till 32 L)18, vilket gör tillämpningen av kemikalier extremt dyrt. Även om några studier beskriver en hydroponiska odling under aseptiska förhållanden8,är19, montering av systemet oftast ganska mödosam, bestående av en perfekt anpassning av nylon maskor i plast eller glas behållare5,8,17,20.

På grund av betydelse Arabidopsis thaliana som en modell växt utformades flesta hydroponics system för denna art1,2,8,14,18, 19 , 20. ändå finns det några studier rapportering funktionerna hydroponiska tillväxt av andra växtarter med en förbehandling av frön för att förbättra sin grobarhet och synkronisering klassar in vitro8,16 . För att arbeta i stor skala, utvecklade vi ett protokoll för att inrätta ett enkelt och kostnadseffektivt underhåll hydroponiska system som möjliggör sterila förhållanden för odling av växter, inklusive A. thaliana och andra arter, såsom gräset Setaria viridis. Den metod som beskrivs här är lämplig för olika experiment, som fröplanta tillväxten kan vara maximerad, synkroniseras och enkelt övervakas. Dessutom detta system har många fördelar som: (i) dess montering är okomplicerad och dess komponenter kan återanvändas; (ii) det ger en lätt tillämpning av olika kemikalier i det flytande mediet; (iii) plantor gror och växer direkt i odlingsmediet utan behov av överföring till hydroponics system; (iv) skjuta och rot utveckling/tillväxt kan övervakas noga och plantorna skördas utan skador; och (v) det gör det möjligt att arbeta i stor skala, att upprätthålla fysiologiska förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av flytande och fasta odlingsmedier

  1. Förbereda ett flytande medium med halv-styrka Murashige och Skoog (MS) medium med vitaminer [0,0125 mg/L av kobolt (II) klorid pentahydrat, 0,0125 mg/L av copper(II) sulfat pentahydrat, 18.35 mg/L av etylendiamintetraacetat ferric natrium, 3.10 mg/L borsyra, 0.415 mg/L av kaliumjodid, 8,45 mg/L av manganese sulfate monohydrat, 0,125 mg/L natriummolybdatdihydrat, 4.30 mg/L av zinksulfat heptahydrat, 166.01 mg/L av kalciumklorid, 85 mg/L av kaliumdivätefosfat, 950 mg/L Kaliumnitrat, 90.27 mg/L av magnesiumsulfat, 825 mg/L av ammoniumnitrat, 1 mg/L av glycin, 50 mg/L av myo-inositol, 0,25 mg/L av nikotinsyra, 0,25 mg/L av pyridoxin hydroklorid och 0,05 mg/L av tiamin hydroklorid] kompletterad med 0,25 g/L MES, och justera pH till 5.8 med 10 M KOH.
  2. Tillsätt 10 g/L agar att göra ett halv-styrka MS-solid medium. Autoklav mediet vid 121 ° C i 20 min före användning.

2. hydroponiska System montering

Obs: Dessa steg bör följas noggrant för att bygga hydrokulturodlade systemet.

  1. Material sterilisering
    1. Packa i autoklav påsen pipettspetsen rack (utan omslag) som ska användas som minitanks. Autoklav rack vid 121 ° C i 20 min, 15 psi.
      Obs: Polypropylen pipett tip racket använde vi hade följande dimensioner: 120 mm (längd) x 89 mm (bredd) x 55 mm (höjd). Pipett tip platta ytan måste ha ett område för tillägg av odlingsmedium. Andra tips rack kan användas (se Tabell för material).
      Obs: Under hela församlingen förfarandet av hydrokulturodlade systemet, det är nödvändigt att använda en LAF, som måste rengöras och desinficeras med 70% etanol före användning. Försöksledaren måste bära en labbrock, tvätta händerna och någon utsatt hud, och desinficera dem med 70% etanol. Handskar är valfritt, förutom läkemedel ansökan.
    2. Ren alla de tillbehör som beskrivs ovan (disponibel plastlådor, tejp, pipetter, sax och pincett) med 70% etanol innan LAF. Om huven tillåter, slå på UV-ljus för 10 min före montering av hydrokulturodlade systemet för att hålla arbetsområdet dekontamineras.
  2. Minitank montering
    1. Försegla den övre ytan av pipettspetsen platta med tejp (figur 1B). Om möjligt, lämna det i UV-ljus i 10 min.
    2. Tillsätt 180 µL av smält fast MS odlingsmedium (något varm) till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett (figur 1 c).
      Obs: När du förbereder många tankar, använda en kokplatta att förhindra att MS mediet stelnar.
    3. Låt medlet att stelna helt (i ca 30 min).
      Obs: Under perioden stelning, UV-ljus kan vara påslagen.
    4. Fyll pipetten tip rack helt med flytande MS odlingsmedium (figur 1 d) och säkerställa det finns nära kontakt mellan fast och flytande media.
    5. Ta bort tejp på ovansidan av pipettspetsen platt och montera den på sträckbänken noggrant. Hydrokulturodlade systemet är nu redo att ta emot de steriliserade fröna.

3. utsädet sterilisering

  1. Plats 500 Arabidopsis frön i en 1,5 mL mikrorör. Använda så många mikrorör som behövs enligt antalet plantor krävs för experimentet.
  2. Skölj fröna med 70% etanol för 2 min med en mild agitation. Låt fröna bosätta sig och ta sedan bort etanolen noggrant.
  3. Tillsätt 1 mL i en 10% natriumhypokloritlösning innehållande 2 µL polysorbat 20 tvätt-och rengöringsmedel. Agitera lösningen för 5 min. ta bort lösningen noga.
  4. Skölj fröna med sterilt destillerat vatten tills alla blekmedel återstoden är helt bort (ca 5 x).
    Obs: Efter ytan sterilisering, fröna var nedsänkt i sterilt destillerat vatten och stratifierat vid 4 ° C i mörker för 5 d att synkronisera grobarhet.
    Obs: Frön av Setaria viridis (anslutning A10.1) var teststamman i koncentrerad svavelsyra för 15 min (att bryta den fysiska dvala), tvättas noggrant i sterilt destillerat vatten och sedan disinfested med en 5% natriumhypokloritlösning som innehåller 0,1% polysorbat 20 för 5 min med en försiktig skakning21. De återstående stegen i sterilisering var identiska med de som beskrivits för Arabidopsis frön.

4. utsäde ansökan

  1. Skär något extremiteten en 200 µL spets med hjälp av en steril skalpell.
  2. Pipettera Arabidopsis frön i solid odlingssubstratet på den övre ytan av pipettspetsen platta. Ta hand att mediet inte kan lossna från lägenheten; annars fröna blir skuggade och plantorna växer inte korrekt (figur 1E).
    Obs: Använd en steril pincett för Setaria frön (med embryot placeras uppåt).
  3. Lagra så många minitanks som möjligt inuti en disponibel plast låda att behålla en hög luftfuktighet och miljö fri från mikroorganismer (figur 1F).
  4. Försegla disponibel plast lådan grundligt med tejp för att undvika kontaminering.
  5. Placera de hydroponiska system i en tillväxt kammare med lämpliga tillväxten villkorar för anläggningen av intresse.
    Obs: I detta arbete, följande villkor användes: 75% av fuktighet, och 150 µmol m-2 s-1 irradians och Ekvatorial villkor 12 h ljus (21 ° C) / 12 h mörk (19 ° C) för Arabidopsis, eller 300 µmol m-2 s-1 i irradians och 12 h ljus (28 ° C) / 12 h mörk (25 ° C) för Setaria (figur 1 g och 1 H).

5. validera användningen av detta hydroponiska System att hämma de mål av Rapamycin tyrosinkinashämmare

Obs: Detta hydroponiska system utvecklades ursprungligen för att underlätta administrationen av kemikalier till växter, som i allmänhet är mycket dyrt att tillämpas i storskaliga experiment. Som ett proof of concept, var den ATP-kompetitiv hämmaren AZD-8055, som är känd att specifikt rikta det ATP-bindningsstället av TOR protein kinase22, anställd att följa förtrycket av TOR aktivitet i plantor av A. thaliana Columbia-0 ( Till Nottingham Arabidopsis lager Centre, NASC-ID: N22681). Här är är protokollet som används kortfattat.

  1. Växa frön hydroponically tills scenen 1,04 enligt BBCH skala23 (för ca 11 d) under de klimatförhållanden som beskrivs ovan. Ersätta näringslösning, antingen med färskt medium innehållande 0,05% DMSO (kontroll), 2 µM AZD-8055 (TOR-hämmare) utspädd DMSO, eller utan behandling (mock), i slutet av natten (sv).
  2. Skörda några plantor vid olika tidpunkter efter behandlingen och separera dem i rötter och skott. Frysa proverna i flytande kväve, mala dem till ett fint pulver i en robotic kvarn (se Tabell för material), och förvara pulvret vid-80 ° C fram till användning.
  3. Immunoblot mot fosforyleras och icke-fosforyleras former av 40S ribosomala proteinet S6 (RPS6) enligt Dobrenel et al. 24.
  4. Bleach intakt plantor för provet pigmentborttagning, tvätta dem i destillerat vatten, doppa dem i en jodlösning för 5 min25och fotografera plantor i ett stereomikroskop (0,63 X mål, 20 x tillnärmning och 7,5 x magnitud) för en kvalitativ bedömning av stärkelse.
  5. Kvantifiera den stärkelse som efter den enzymatiska nedbrytningen och mätning av utsläppt glukos spektrofotometriskt genom att koppla det till förminskningen av NADP+ till NADPH26,27.
  6. Utföra en total RNA-extraktion, en cDNA-syntes och kvantitativ RT-PCR-analyser som beskrivs av Caldana o.a. 28 för att bedöma hur uttrycket av gener besläktade med olika typer av påfrestningar.
  7. Du kan också växa plantor på en horticultural substrat i plastkrukor med 0.1 L kapacitet enligt liknande klimatiska förhållanden [60% luftfuktighet, 150 µmol m-2 s-1 av irradians, Ekvatorial 12 h ljus (21 ° C) / 12 h mörk (19 ° C )] för att jämföra dem med plantor odlas hydroponically.
    Obs: De målgener som används för gen uttryck analyserna var ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), och TPS5 (At4g17770), och deras uttryck nivåer var normaliserade sysselsätter den delta-Ct metod29 med ÄRV2 (At3g18780) eller PDF2 (At4g04890) som intern referens generna, förutsatt att 100% av PCR-amplifiering effektivitet över alla prover. Oligonukleotid paren används för den kvantitativa PCREN var: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ÄRV2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), och PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De TOR-Kinas är en viktig regulator som integrerar näringsämnen och energi signalering främja cellproliferation och tillväxt i alla eukaryota organismer. Ansträngningar att belysa TOR funktioner i växter omfattar generering av Arabidopsis transgena linjerna som innehåller TOR villkorlig förtryck genom RNA-interferens eller konstgjorda mikroRNA28,30,31, med tanke på embryo lethal fenotypen av TOR knockout växter32,33,34,35. De flesta av de villkorliga transgena linjerna är under kontroll av estradiol-, dexametason- eller etanol-inducerbara initiativtagare, som kunde också göra använda av detta hydroponiska system.

En av de välkända målen i TOR aktivitet i Arabidopsis är direkt fosforyleringen av ribosomala proteinet S6 kinase (S6K)34,36,37,38. Vid fosforylering, S6K ytterligare phosphorylates 40S ribosomala proteinet S6 (RPS6), som påverkar de ribosomala protein översättning24,39,40. Det har nyligen visats att fosforyleringen av en RPS6 Ser240 webbplats är en bra markör för TOR aktivitet24. Immunoblotting analyser bekräftade att snart efter 30 min av Läkemedelslära, observerades en signifikant minskning av Ser240 fosforyleringen i både rötter och skott (figur 2). Under experimentella förhållanden används har AZD-8055 också visat sig vara en potent TOR-hämmare, som snabbt förtränger dess Kinas aktivitet.

Transgena Arabidopsis linjer med ett minskat uttryck av genen TOR eller komponenter av TOR komplexa presenterar en tydlig stärkelse överskott fenotyp28,31. Kvalitativ analys av stärkelse med Lugols lösning visade det förväntade mönstret av stärkelse ackumulering och nedbrytning under diel cykeln (figur 3). Plantor som inte fick en ansökan av DMSO eller AZD-8055 visade ingen större ackumulering av stärkelse i sina blad i slutet av natten (sv) och stärkelse ansamling i kontroll växter (som fick 0,05% DMSO) överensstämde med litteraturen 41 , 42. Dessutom växter behandlas med AZD-8055 presenteras en större mängd resterande stärkelse på EN jämfört med kontroll plantor. Dessa resultat visade nyttan av de föreslagna hydroponiska systemet i växande plantor imitera fysiologiska förhållanden. Detta system aktiveras också bekräftelsen av den stärkelse överskott fenotypen typiska för ett förtryck av den TOR komplexa komponenter24,28,31.

Stärkelseinnehåll mättes också noggrant med hjälp av en känslig metod, visar att AZD-8055 behandling ledde till plantor som innehåller betydligt högre halter av stärkelse båda i slutet av dagen (ED) och sv jämfört med kontrollen DMSO-behandlade växter (figur 4). Stärkelse ackumuleras i bladen under dagen och är remobilized över natten för att upprätthålla metabolisk aktivitet, främst respirationen och kontinuerlig export av sackaros till andra växt organ41,42. Under normala förhållanden återstår bara en bråkdel av stärkelse (mellan 5% och 10% av beloppet på ED) på sv43,44,45. Dessa resultat intygas att stärkelsen överskott fenotyp observerats under TOR förtrycket sker över diel cykeln.

Hydroponically odlade växter jämfördes med plantor som odlas i trädgårdsodling substrat under mycket liknande klimatförhållanden om uttrycket nivå av abscisic syra-responsive element-bindande faktor 3 (ABF3) genen (figur 5A ), som direkt korrelerar med interna ABA nivåer, en klass av hormoner allmänt känd som en markör på grund av dess roll i flera abiotisk stress Svaren46,47,48. Även om plantorna odlas i hydrokulturodlade systemet presenterar en betydande ökning av ABF3, påverkades inte uttrycket av aminosyran asparagin syntas 1 (ASN1) av DMSO eller AZD behandlingar (figur 5B). Dock trehalos fosfat syntas 5 (TPS5) ökades betydligt efter 8 h TOR hämning (figur 5B). Asn1 och TPS5 svarar på låga och höga socker nivåer49,50,51,52,53,54, respektive, vilket tyder på att dessa växter inte upplever energisk stress.

Figure 1
Figur 1 : Arbetsflöde för montering hydrokulturodlade systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Effekt av TOR hämning på RPS6 fosforyleringen i olika vävnader i Arabidopsis thaliana. . Immunoblotting visar överflödet av den totala och fosforyleras RPS6 i roten (A) och (B) skjuta extrakt av plantor som behandlats med 2 µM AZD-8055 eller 0,05% DMSO (kontroll). Värdena representerar de nyckeltal som normaliseras av icke-fosforyleras proteinet RPS6. Anti aktin antikropp användes som en lastning kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Arabidopsis thaliana. plantor färgas med Lugols reagens. Behandlingar med 2 µM AZD-8055 eller 0,05% DMSO (kontroll) tillämpades på EN (röd pil) och jämfört med för att håna plantor (nr-behandling). Plantor var skördas innan behandling (0 h) och på 12 h (ED) och 24 h (sv) efter behandlingen, indikeras av svarta pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Effekt av TOR hämning på potatisens Arabidopsis thaliana. plantor. Stärkelse mättes enzymatiskt innan (0 h) och på 12 h (ED) eller 24 h (sv) efter behandling med 2 µM AZD-8055 (svart) eller 0,05% DMSO (kontroll, vit). De värden som visas är den medelvärde ± medelfel (SE) (n = 4). Betydande skillnader mellan plantor behandlade med AZD-8055 och DMSO, med Student's t-test, markeras med asterisker: * (P < 0,05) och *** (P < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Uttrycket nivå av stress-relaterade gener. (A) jämförelse av ABF3 avskrifter i hydroponically och substrat-odlade Arabidopsis Col-0 plantor. (B) jämförelse av ASN1 och TPS5 avskrifter i Arabidopsis plantor som behandlats med 2 µM AZD-8055 och 0,05% DMSO. De normaliserade nivåerna visas som 2^(-dCt). De värden som visas är den medelvärde ± SE (n = 3). Betydande skillnader, med Student's t-test, markeras med asterisker: *** (P < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Kompletterande bild 1:denna in vitro- hydroponiska system gör det möjligt att synkronisera grobarhet och få homogena plantor. Frön av A. thaliana (C3) och S. viridis (C4) var grodde direkt i detta system. (A och C) plantorna var homogen när det gäller utvecklingsstadiet och behandling tillämpades efter 11 d (Arabidopsis) eller 7 d (Setaria). (B och D) rötterna växa direkt mot den nutritive lösning, att underlätta tillsats av olika ämnen och deras absorbering. Dessa resultat tyder starkt på att detta system erbjuder en optimal miljö för växternas tillväxt och kan användas för att effektivt utföra ett brett utbud av analyser. Dessutom är detta hydroponiska system mycket användbart för storskaliga experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna optimerad hydroponiska struktur möjliggör framgångsrika i vitro kultur växter. Fröna gror bra på fasta mediet vid pipett tip platta ytan, en betydande vinst i jämförelse med system där fröna är indränkt med näringslösning. En stor fördel med detta system är att rötterna under plantan utveckling, få direkt kontakt med det flytande mediet utan behov av överföring. Dessutom kan kemisk behandling lätt tillämpas i det flytande mediet i en minskad volym. Fuktighet hålls hög, att undvika avdunstning av näringslösning och dess påfyllning. Dessutom homogen tillväxt och utveckling under plantan etableringen lätt kan erhållas, och luftning krävs inte när du arbetar med små tankar och plantor på denna utvecklingsfas1,10,18 . För att garantera att systemet kommer att vara helt fri från föroreningar, är ett kritiskt steg sterilisering av alla material som används och intensivvård under dess montering. På grund av omöjligheten att sterilisera vissa komponenter i autoklav (t.ex., disponibel plast lådor), rekommenderas det starkt att först rensa dem med 70% etanol och sedan tillämpa en kort period av UV-ljus före användning. Enligt vår erfarenhet inte användning av UV-ljus, efter tätning den plana ytan med tejp och under media solidifiering, även bakteriell och fungal kontamineras. Dessutom vara försiktig inte till touch media, alltid flyttar pipetten rack av dess laterala sidan.

För att säkerställa optimal tillväxt av plantor, är det viktigt att övervaka den nära kontakten mellan fast och flytande medier, att säkerställa fullständig nedsänkning av rotar efter frögroning. Det fasta mediet måste vara tillräckligt tät (10 g/L agar) och helt stelnat så att inte att lossa från den plana ytan och flyter i näringslösning. Förutom Arabidopsis, kan detta system användas för att odla andra växtarter, så länge fröna är liten nog att passa brunnarna på plana. I denna mening var Hydroponiska metoden presenteras här också effektivt för växande Setaria viridis, en liten gräs som har nyligen uppstått som romanen modellsystem för att studera C4 fotosyntes, stress biologi och andra bioenergi gröda drag 55. liknar Arabidopsis, detta system gör det möjligt för att producera jämnt växande Setaria plantor med ett bra rotsystem och i stor skala (kompletterande figur 1), eftersom varje rack stöder 96 frön, säkerställa många plantor per biologiska replikat och följaktligen tillräckligt underlag för en myriad av nedströms tillämpningar. Ett högre antal replikat ökar effektiviteten av statistiska tester, vilket leder till mer noggranna och pålitliga resultat i experimentella studier56. Till exempel kunde använder en tillväxt kammare med en yta på bara 1,5 m2, vi växa 6000 plantor samtidigt, vilket gör det möjligt att utföra temporal kinetik av svar till en önskad behandling. Dessutom skördas proverna kan användas för flera och kompletterande 'omics' analyser som kan kräva en stor mängd vävnad (t.ex., immunoblotting). Denna hydroponiska struktur är av särskilt intresse för grupper som syftar till att analysera olika växt organ (t.ex., rötter och skott), eftersom det gör separationen enkelt och snabbt.

Ett litet antal studier beskrivs användningen av pipett tip lådor under inledande växt utvecklingen före en överföring till större hydroponiska tankar11,20, och mer nyligen, ett mycket liknande system användes för att utvärdera de amino sura upptag och flyttning i 5 veckor gamla Arabidopsis växter57. Protokollet beskrivs här ger ytterligare fördelar i form av odla växterna under sterila förhållanden.

Även om detta system utvecklades ursprungligen för att odla plantor, kan det också vara lämplig för större växter. I det här fallet är det värt att nämna att vård måste man placera frön mer avlägsna från varandra för att undvika så mycket skugga som möjligt under tillväxt. Luftningen kan dessutom införas i racken att förhindra hypoxi genom ett väl av pipettspetsen platt, ett vanligt problem i nedsänkt Arabidopsis rötter växa under längre perioder. På grund av beskaffenhet fastsittande utsätts växter för flera typer av abiotiska och biotiska betonar, beroende på deras omgivande miljö. Därför, med tanke på syftet med studien och utvecklingsstadiet, det kan vara viktigt att övervaka om de växter som växer i detta system lider av någon form av stress.

De resultat som presenteras här har visat att detta hydroponiska system är mycket användbart för tillämpningen av kemikalier till nutritive lösning, särskilt när man arbetar med dyra ämnen, på grund av den lilla volymen av pipett tip rack. Vi har lyckats med detta system att effektivt undertrycka aktiviteten av TOR kinase av AZD-8055 och bekräftade att phosphorylation status för dess nedströms mål RPS6 påverkas redan efter 30 min behandling ansökan. Dessutom leder TOR hämning till plantor som innehåller stärkelse högre under dag och natt jämfört med kontroll plantor. Sådana analyser kan användas enkelt att förlänga de synpunkter som redan erhållits med transgena linjerna, möjliggör en inducerbara repression av gen-encoding komponenterna i TOR komplexa, eller någon annan väg av intresse. Sammanfattningsvis, det föreslagna hydroponiska systemet äger många fördelar eftersom det är mycket lätt och enkel att montera, har en låg kostnad (huvudbeståndsdelarna är billiga och kan återanvändas i stor utsträckning), är mångsidig (möjliggör studiet av intakt plantor eller distinkta vävnader i specifika eller längs växt utvecklingsstadier), och är mycket skalbart (det tillåter odling av ett stort antal plantor i ett mycket litet område).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av de São Paulo Research Foundation (FAPESP; Bevilja 12/19561-0) och den Max Planck-sällskapet. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valeria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), och Viviane C. H. da Silva (uddar/CNPEM 24/2013) är tacksamma till stipendierna. Författarna vill tacka Christian Meyer från den Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankrike) för att generöst ge antikroppar mot RPS6. Författarna tackar RTV UNICAMP och Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel för deras tekniska support under audio inspelning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
  2. Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
  3. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  4. Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
  5. Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
  6. Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
  7. Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
  8. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  9. Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
  10. Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
  11. Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
  12. Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
  13. Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
  14. Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
  15. Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
  16. Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
  17. Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
  18. Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
  19. Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
  20. Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
  21. Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
  22. Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
  23. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
  24. Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
  25. Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
  26. Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
  27. Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
  28. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
  29. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  30. Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
  31. Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
  32. Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
  33. Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
  34. Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
  35. Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
  36. Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
  37. Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
  38. Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
  39. Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
  40. Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
  41. Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
  42. Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
  43. Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
  44. Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
  45. Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
  46. Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
  47. Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
  48. Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
  49. Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  50. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
  51. Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
  52. Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
  53. Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
  54. Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
  55. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  56. Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
  57. Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).

Tags

Fråga 138 in vitro- kultur hydroponiska system miljövetenskap små molekyler Arabidopsis thaliana Setaria viridis Pipettera tip rack mål av rapamycin hämmare AZD-8055
En flexibel lågpris hydroponiska System för bedömning av anläggningen Svaren till små molekyler i sterila förhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F.,… More

Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C. M., Mafra, V., da Silva, V. C. H., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter