Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

En fleksibel lavpris Hydroponic System for å vurdere anlegget Svar å små molekyler i Sterile forhold

Published: August 25, 2018 doi: 10.3791/57800
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 4, 1,2, 1, 1,5
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE), Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE, CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM), Max Planck Partner Group
* These authors contributed equally

Summary

En enkel, allsidig og rimelig i vitro hydroponic system ble optimalisert, slik at store eksperimenter under sterile forhold. Dette systemet muliggjør bruk av kjemikalier i en løsning og deres effektive absorpsjon av røtter for molekylær biokjemiske og fysiologiske studier.

Abstract

En rekke studier i plant biology utføres ved hjelp av hydroponic kulturer. I dette arbeidet vises et i vitro hydroponic vekst system designet for å vurdere anlegget Svar å kjemikalier og andre stoffer rundt. Dette systemet er svært effektiv i å oppnå homogene og sunn seedlings C3 og C4 modell arter Arabidopsis thaliana og Setaria viridis, henholdsvis. Sterilt dyrking unngår alger og microorganism forurensning, som er kjent for Begrensende faktorer for plante normal vekst og utvikling i hydroponics. I tillegg er dette systemet skalerbar, slik at avlingen av plantemateriale i stor skala med mindre mekaniske, samt innhøstingen av enkeltdeler av en plante hvis ønskelig. En detaljert protokoll viser at dette systemet har en enkel og rimelig forsamling, som den bruker pipette stativer som den viktigste plattformen for voksende planter, tilbys. Muligheten for dette systemet ble validert ved hjelp Arabidopsis planter for å vurdere effekten av stoffet AZD-8055, en kjemisk hemmer av målet på rapamycin (TOR) kinase. TOR hemming fant effektivt så tidlig som 30 min etter en AZD-8055 behandling i røtter og skyter. Videre vises AZD 8055-behandlet planter forventet stivelse-overflødig fenotypen. Vi foreslått denne hydroponic system som en ideell metode for plante forskere å overvåke av anlegget indusere eller hemmere, samt å vurdere metabolske flukser bruker isotop-merking forbindelser som vanligvis krever bruk av dyre reagenser.

Introduction

Fordelene med voksende planter bruker hydroponics har vært anerkjent i produksjon av store og ensartet planter, aktivere reproduserbar eksperimenter1,2,3. I dette systemet, kan sammensetningen av nutritive løsningen være kontrollert og resirkulert langs alle faser av plantevekst og utvikling. Videre utsettes røtter ikke for abiotiske påkjenninger, som kan skje i jord-vokst planter, for eksempel næringsstoffer sult og vann mangel4. Som planter dyrket hydroponically stede morfologiske og fysiologiske trekk ganske lik de kultivert i jord, har dette systemet vært grovt ansatt i forskning fordi overvåking av rot/skyte vekst og deres høsting uten skader2,5.

På grunn av muligheten for å endre sammensetningen og konsentrasjonen av nutritive løsningen, meste av forskningen hydroponic betingelser er utført betegner funksjonene til mikro- og makronæringsstoffer1,3 ,6,7,8. Men dette systemet har vist seg for å være svært nyttig for et bredt spekter av programmer i anlegget biologi, slik som å belyse funksjonene av hormoner og kjemikalier i planter. For eksempel oppdagelsen av strigolactones som en ny klasse av hormoner9 og akselererende vekst fenotypen utløst av brassinosteroid programmet10 ble utført under hydroponic forhold. Videre, dette systemet muliggjør eksperimenter med merket isotoper (f.eks, 14N /15N og 13CO2)11,12 evaluere inn i proteiner og metabolitter av massespektrometri.

Vurderer betydningen av dette systemet i planteforskning, et høyt antall hydroponic kulturer er designet i de siste årene, inkludert systemer som bruker (i) overføring av frøplanter fra platene til hydroponic beholdere3, 13; (ii) rockwool som begrenser tilgang til de tidlige stadiene av root utvikling2,14,15; (iii) polyetylen granulate som flytende kroppen, noe som gjør programmet homogen av små molekyler og behandling vanskelig16; eller (iv) en redusert antall planter9,17. Volumet av hydroponic tanker beskrevet i mange av disse protokollene er vanligvis store (små volumer som spenner fra 1-5 L, opp til 32 L)18, som gjør bruk av kjemikalier som er svært kostbart. Selv om noen studier gjør beskrive en hydroponic dyrking under aseptiske forhold8,er19, montering av systemet vanligvis ganske arbeidskrevende, bestående av perfekt justering av nylon masker i plast eller glass beholdere5,8,17,20.

På grunn av viktigheten av Arabidopsis thaliana som, ble fleste hydroponics systemer utformet for denne arten1,2,8,14,18, 19 , 20. likevel er det noen studier rapporterer hydroponic vekst funksjonene andre plantevekster med en forbehandling av frø å forbedre sin spiring og synkronisering priser i vitro8,16 . For å arbeide i stor skala, utviklet vi en protokoll for å sette opp en enkel og rimelig vedlikehold hydroponic system som muliggjør sterile forhold for voksende planter, inkludert A. thaliana og andre arter, som gresset Setaria viridis. Metoden beskrevet her er egnet for forskjellige eksperimenter, frøplante veksten kan maksimeres, synkronisert, og lett overvåkes. Videre, dette systemet har mange fordeler som: (i) sin montering er grei og komponentene kan brukes igjen; (ii) det tillater enkel bruk av ulike kjemikalier til flytende medium; (iii) seedlings spirer og vokser direkte i kultur medium uten behov for overføring til hydroponics systemet; (iv) skyte og root utvikling/vekst kan være nøye tilsyn og seedlings høstes uten skader; og (v) det gjør det mulig å arbeide i stor skala, opprettholde fysiologiske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse flytende og fast kultur medier

  1. Forberede en flytende medium med vitaminer [0.0125 mg/L av cobalt(II) chloride pentahydrate, 0.0125 mg/L av copper(II) sulfate pentahydrate, 18.35 mg/L av ethylenediaminetetraacetate ferric natrium, 3,10 mg/L av halv-styrke Murashige og Skoog (MS) medium borsyre, 0.415 mg/L av kalium iodide, 8.45 mg/L av manganese sulfate laktosemonohydrat, 0.125 mg/L av natrium molybdate dihydrate, 4.30 mg/L av sinksulfat heptahydrate, 166.01 mg/L av veisalt, 85 mg/L av kalium dihydrogen fosfat, 950 mg/L av kalium nitrat, 90.27 mg/L av magnesium sulfat, 825 mg/L av ammoniumnitrat, 1 mg/L av glysin, 50 mg/L av myo-inositol, 0,25 mg/L av nikotinsyre, 0,25 mg/L av pyridoksin som hydroklorid og 0,05 mg/L av Thiamin hydrochloride] supplert med 0,25 g/L MES, og justere pH til 5,8 med 10 M KOH.
  2. Legge til 10 g/L agar å gjøre en halv-styrke MS-solid medium. Autoclave middels på 121 ° C for 20 min før bruk.

2. hydroponic System montering

Merk: Disse trinnene bør følges omhyggelig for å bygge hydroponic systemet.

  1. Materielle sterilisering
    1. Pakke i autoklav posen pipette spissen stativ (uten dekker) som skal brukes som minitanks. Autoclave stativer ved 121 ° C i 20 minutter, 15 psi.
      Merk: Polypropylen pipette tips stativet vi hadde følgende dimensjoner: 120 mm (lengde) x 89 mm (bredde) x 55 mm (høyde). Pipetter tips flat overflate må ha et område for tillegg av kultur medium. Andre tips rack kan brukes (se Tabell for materiale).
      Merk: Hele forsamlingen prosedyren av hydroponic system er det nødvendig å bruke laminær strømning hette, som må rengjøres og desinfiseres med 70% etanol før bruk. Eksperimentator må ha en labfrakk, vaske hendene og noen utsatt huden og desinfisere dem med 70% etanol. Hanskene er valgfritt, unntatt medikament programmet.
    2. Rengjør alt tilbehør beskrevet ovenfor (engangs plast bokser, teip, Pipetter, saks og pinsett) med 70% etanol før laminær strømning panseret. Hvis hetten tillater, slå på UV-lyset i 10 min før montering av hydroponic system for å holde arbeidsområdet dekontaminert.
  2. Minitank montering
    1. Forsegle den øvre overflaten pipette tips flatt med teip (figur 1B). Hvis mulig, la det under UV-lys for 10 min.
    2. Legg til 180 µL av smeltet solid MS kultur medium (litt varm) i hver brønn ved å en flerkanals pipette (figur 1 c).
      Merk: Når du forbereder mange tanker, bruk en kokeplate hindre at MS mediet styrket.
    3. Tillate medium å størkne helt (i ca 30 min).
      Merk: I herding perioden, UV-lyset kan være slått på.
    4. Fylle opp pipette tips stativet helt med flytende MS kultur medium (figur 1 d) og sikre det er nær kontakt mellom solid og flytende media.
    5. Fjern selvklebende bånd av den øvre overflaten pipette tips flat og passe den på stativet nøye. Hydroponic system er nå klar til å motta sterilisert frøene.

3. frø sterilisering

  1. Sett 500 Arabidopsis frø i en 1,5 mL microtube. Bruke så mange microtubes som nødvendig av antall planter kreves for eksperimentet.
  2. Vask frøene med 70% etanol i 2 minutter med en mild agitasjon. La frøene slå seg ned, og deretter fjerner etanol nøye.
  3. Legg 1 mL av en 10% natriumhypokloritt løsning som inneholder 2 µL av en polysorbat 20 vaskemiddel. Agitere løsningen for 5 min. fjerne løsningen nøye.
  4. Skyll frøene med sterilt destillert vann Inntil blekemiddel rester er helt fjernet (ca 5 x).
    Merk: Etter at overflaten sterilisering, var frøene midt i sterilt destillert vann og lagdelte ved 4 ° C i mørket 5 d synkronisere spiring.
    Merk: Frø av Setaria viridis (tiltredelse A10.1) ble preincubated i konsentrert svovelsyre i 15 min (å brekke det fysiske dormancy) vasket grundig i sterilt destillert vann og deretter disinfested med en 5% natriumhypokloritt løsning inneholder 0,1% polysorbat 20 i 5 min med en mild agitasjon21. Trinnene for sterilisering var identisk med de på Arabidopsis frø.

4. frø program

  1. Trimme litt enden av en 200 µL tips ved hjelp av sterile skalpell.
  2. Pipetter Arabidopsis frø til solid kultur medium på den øvre overflaten pipette tips flat. Pass på at mediet ikke løsne fra leiligheten; ellers frøene blir skyggelagt og seedlings vil ikke vokser riktig (figur 1E).
    Merk: Bruk en steril tweezer for Setaria frø (med embryoet plassert oppover).
  3. Lagre så mange minitanks som mulig i en engangs plast for å opprettholde en høy luftfuktighet og holde miljøet gratis fra mikroorganismer (figur 1F).
  4. Forsegle engangs plast boksen grundig bruke teip for å unngå forurensning.
  5. Plass hydroponic systemer i en vekst kammer til riktig vekst forholdene for anlegget rundt.
    Merk: I dette arbeidet, følgende ble brukt: 75% av fuktighet og 150 µmol m-2 s-1 Irradians og equinoctial forhold 12t lys (21 ° C) / 12 h mørk (19 ° C) for Arabidopsiseller 300 µmol m-2 s-1 av Irradians og 12t lys (28 ° C) / 12 h mørk (25 ° C) for Setaria (figur 1G og 1 H).

5. validering bruk av denne Hydroponic System å hemme målet på Rapamycin Kinase

Merk: Denne hydroponic system ble opprinnelig utviklet for å forenkle administrasjon av kjemikaliene som planter, som vanligvis er svært dyrt å brukes i store eksperimenter. Som et bevis på konseptet, var den ATP-konkurransedyktig inhibitor AZD-8055, som er kjent for å spesifikt mål ATP binding området TOR protein kinase22, ansatt å følge undertrykkelse av TOR aktivitet i planter av A. thaliana Columbia-0 ( Nottingham Arabidopsis lager sentrum, NASC-ID: N22681). Her beskrives kort protokollen som brukes.

  1. Vokse frøene hydroponically til scenen 1.04 ifølge BBCH skala23 (for ca 11 d) under de klimatiske forholdene beskrevet ovenfor. Erstatte næringsstoffet løsning, enten med fersk middels inneholder 0,05% DMSO (kontroll), 2 µM AZD-8055 (TOR hemmer) fortynnet i DMSO eller uten behandling (falske), på slutten av natten (EN).
  2. Høste noen planter på ulike tidspunkt etter behandling og skille dem i røtter og skyter. Fryse prøvene i flytende nitrogen, male dem til et fint pulver i en robot jeksel (se Tabell for materiale), og lagre pulveret ved-80 ° C før bruk.
  3. Immunoblot mot fosforylert og ikke-fosforylert former for 40S ribosomal protein S6 (RPS6) etter Dobrenel et al. 24.
  4. Bleke intakt stiklinger for eksempel depigmentering, vaske dem i destillert vann, legg dem i en jod for 5 min25og fotografere seedlings i en stereomicroscope (0,63 X mål, 20 x tilnærming og 7.5 x omfanget) for en kvalitativ vurdering av stivelsen innhold.
  5. Kvantifisere stivelse følge enzymatisk degradering og måling av utgitt glukose spektrofotometrisk ved å koble det til reduksjon av NADP+ til NADPH26,27.
  6. Utføre en totale RNA utvinning, cDNA syntese og kvantitative RT PCR analyser som beskrevet av Caldana et al. 28 å evaluere uttrykket av gener som er knyttet til forskjellige typer påkjenninger.
  7. Eventuelt vokse planter på et hagebruk substrat i plast potter med 0,1 L kapasitet under lignende klimatiske forhold [60% av fuktighet, 150 µmol m-2 s-1 av Irradians og equinoctial forhold 12t lys (21 ° C) / 12 h mørk (19 ° C )] for å sammenligne dem med planter dyrket hydroponically.
    Merk: Målet genene brukes for gene expression analyser var ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), og TPS5 (At4g17770), og deres uttrykk nivåer var normalisert ansette delta-Ct metoden29 med ACT2 (At3g18780) eller PDF2 (At4g04890) som intern referanse genene, forutsatt at 100% av PCR forsterkning effektivitet over alle prøvene. Oligonucleotide par brukes for den kvantitative PCR var: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG), og PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TOR kinase er en viktig regulator som integrerer næringsstoffer og energi signalering å fremme celle spredning og vekst i alle eukaryoter. Innsats for å belyse TOR funksjoner i planter inkludere generering av Arabidopsis transgene linjer som inneholder TOR betinget undertrykkelse gjennom RNA-interferens eller kunstig microRNA28,30,31, gitt embryoet dødelige fenotypen TOR knockout planter32,33,34,35. De fleste av betinget transgene linjene er under kontroll av østradiol-, deksametason eller etanol-induserbart arrangører, som kan også gjøre bruk av denne hydroponic system.

En av de kjente målene for TOR aktivitet i Arabidopsis er det direkte fosforylering i ribosomal protein S6 kinase (S6K)34,36,37,38. Ved fosforylering, S6K ytterligere phosphorylates 40S ribosomal protein S6 (RPS6), påvirker ribosomal protein oversettelsen24,39,40. Nylig har det blitt demonstrert at fosforylering av et RPS6 Ser240 nettsted er en god markør TOR aktivitet24. Immunoblotting analyser bekreftet at etter 30 min bedøve administrasjon, en betydelig reduksjon i Ser240 fosforylering ble observert både røtter og skudd (figur 2). Under eksperimentelle forhold brukes, har AZD-8055 også vist seg for å være en potent TOR inhibitor, som raskt represses sin kinase aktivitet.

Transgene Arabidopsis linjer med en redusert uttrykk for TOR genet eller komponenter av TOR komplekse presentere en klar stivelse overflødig fenotypen28,31. Kvalitativ analyse av stivelse ved hjelp av Lugol løsning avslørte den forventede mønsteret av stivelse akkumulering og fornedrelse under men også syklus (Figur 3). Planter som ikke får en anvendelse av DMSO eller AZD-8055 viste større aldri stivelse i bladene på slutten av natten (no) og stivelse akkumulering i control planter (som fikk 0,05% DMSO) var i samsvar med litteratur 41 , 42. videre planter behandlet med AZD-8055 presentert en større mengde gjenværende stivelse på EN sammenlignet med kontrollen seedlings. Disse resultatene indikerte nytten av foreslåtte hydroponic system i voksende seedlings mimicking fysiologiske forhold. Dette systemet aktivert bekreftelse av stivelse overflødig fenotypen typisk for en undertrykkelse av TOR komplekse komponenter24,28,31.

Stivelsen innhold ble også nøyaktig målt med et sensitivt metodikk, demonstrere at AZD-8055 behandling førte til frøplanter som inneholder betydelig høyere nivåer av stivelse på begge slutten av dagen (ED) og i forhold til kontrollen DMSO-behandlet planter (Figur 4). Stivelse akkumuleres i bladene på dagtid og er remobilized over natten for å opprettholde metabolsk aktivitet, hovedsakelig åndedrett og kontinuerlig eksport av sukrose til andre plante organer41,42. Under normale forhold, bare en liten brøkdel av stivelse (mellom 5% og 10% av beløpet på ED) er EN43,44,45. Disse resultatene dokumentert at stivelse overflødig fenotypen observert under TOR undertrykkelsen oppstår over men også syklusen.

Hydroponically dyrket plantene ble sammenlignet med planter dyrkes i en hagebruk substrat under ligner klimatiske forhold vedrørende uttrykket nivå av abscisic acid svarer element-bindende faktor 3 (ABF3) genet (figur 5A ), som direkte korrelerer med interne ABA nivåer, en klasse av hormoner viden kjent som en markør på grunn av sin rolle i flere abiotiske stress svar46,47,48. Selv om planter dyrket i hydroponic system presentere en betydelig økning i nivået av ABF3, var uttrykk for asparagine syntase 1 (ASN1) ikke påvirket av DMSO eller AZD behandlinger (figur 5B). Men trehalose fosfat syntase 5 (TPS5) ble betydelig økt etter 8 timer av TOR hemming (figur 5B). ASN1 og TPS5 reagerer på lav og høy sukker nivåer49,50,51,52,53,54, henholdsvis tyder at disse plantene ikke var opplever energisk stress.

Figure 1
Figur 1 : Arbeidsflyt for montering hydroponic systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Effekten av TOR hemming på RPS6 fosforylering i ulike vev av Arabidopsis thaliana . Immunoblotting viser overflod av den totale og fosforylert RPS6 i roten (A) og (B) skyte ekstrakter av frøplanter behandlet med 2 µM AZD-8055 eller 0,05% DMSO (kontroll). Verdiene representerer prosenter normalisert av ikke-fosforylert protein RPS6. Anti-utgangen antistoff ble brukt som en lasting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Arabidopsis thaliana frøplanter beiset med Lugol reagens. Behandlinger med 2 µM AZD-8055 eller 0,05% DMSO (kontroll) ble brukt på EN (rød pil) og sammenlignet med håne seedlings (nei-behandling). Seedlings ble høstet før behandling programmet (0 h) og 12 h (ED) og 24 h (no) etter behandling, angitt med svarte piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Effekten av TOR hemming på stivelsen innhold Arabidopsis thaliana frøplanter. Stivelse ble målt enzymatisk før (0 h) og på 12 h (ED) eller 24 h (no) etter behandling med 2 µM AZD-8055 (svart) eller 0,05% DMSO (kontroll, hvit). Verdiene som vises er de gjennomsnittlig ± standardfeilen (SE) (n = 4). Betydelige forskjeller mellom seedlings behandlet med AZD-8055 og DMSO ved hjelp av Student t-test, identifiseres med stjerner: * (P < 0,05) og *** (P < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Uttrykk nivået av stress-relaterte gener. (A) sammenligning av ABF3 utskrifter i hydroponically og underlaget dyrket Arabidopsis Col-0 planter. (B) sammenligning av ASN1 og TPS5 utskrifter i Arabidopsis frøplanter behandlet med 2 µM AZD-8055 og 0,05% DMSO. Normalisert uttrykk nivåer vises som 2^(-dCt). Verdiene som vises er de gjennomsnittlig ± SE (n = 3). Betydelige forskjeller, ved hjelp av Student t-test, identifiseres med stjerner: *** (P < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Supplerende figur 1:dette i vitro hydroponic system gjør det mulig å synkronisere spiring og få homogen frøplanter. A. thaliana (C3) og S. viridis (C4) var spirer direkte i dette systemet. (A og C) seedlings var homogen i forhold til det utviklingen scenen og behandling ble brukt etter 11 d (Arabidopsis) eller 7 d (Setaria). (B og D) røttene vokser direkte mot nutritive løsningen, tilrettelegge forskjellige stoffer og deres absorpsjon. Disse resultatene indikerer sterkt at dette systemet tilbyr et optimalt miljø for plantevekst og kan brukes til å utføre en rekke analyser. I tillegg er denne hydroponic system svært nyttig for store eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne optimaliserte hydroponic strukturen kan lykkes i vitro kultur planter. Frø germinate på solid middels på pipette tips flatt underlag, en betydelig gevinst i forhold til systemer der frø er fuktet med næringsstoffet løsning. En stor fordel av dette systemet er at under frøplante utvikling, røtter ta direkte kontakt med flytende medium uten behov for overføring. Videre kan kjemisk behandling enkelt brukes i flytende medium i en redusert volum. Fuktighet holdes høy, unngå fordampning av næringsstoffet løsning og dens påfyll. I tillegg homogen vekst og utvikling under frøplante etableringen kan lett få og lufting kreves ikke når du arbeider med små tanker og planter på denne utviklingen scene1,10,18 . For å garantere at systemet er helt fri fra forurensning, er en avgjørende skritt sterilisering av materiale som brukes og intensiv pleie sin sammensetting. På grunn av umuligheten å sterilisere noen komponenter i autoclave (f.eks, engangs plast bokser), anbefales det å først fjerne dem med 70% etanol, og deretter bruke en kort periode UV lys før bruk. I vår erfaring unngår bruk av UV-lys, etter tetting flate overflaten med teip og under media størkning, også bakterier og sopp forurensning. Videre, være forsiktig med å ta media, alltid flytte pipette stativer av lateralt.

For å sikre optimal vekst av seedlings, er det viktig å overvåke av nær kontakt mellom faste og flytende medier, sikre komplett nedsenking av røttene etter frø spiring. Solid mediet må være tilstrekkelig tett (10 g/L agar) og helt befestet ikke å løsne fra flate overflaten og flyter inn næringsstoffet løsning. Foruten Arabidopsis, kan dette systemet brukes for voksende andre plantearter, så lenge frø er liten nok å passe brønnene av leiligheten. I denne forstand var hydroponic metoden presenteres her også effektiv for voksende Setaria viridis, en liten gress som nylig har dukket opp som en roman modellsystem for å studere C4 fotosyntesen, stress biologi og andre bioenergi beskjære egenskaper 55. ligner Arabidopsis, dette systemet gjør det mulig for å produsere jevnt voksende Setaria planter med en god rotsystem og i stor skala (supplerende figur 1), fordi hver rack støtter 96 frø, sikre mange planter per biologiske replikere og dermed tilstrekkelig materiell for en myriade av nedstrøms programmer. Et høyere tall av replikat øker effektiviteten av statistiske tester, fører til mer nøyaktige og pålitelige resultater i eksperimentelle studier56. For eksempel kunne bruker en vekst kammer med et areal på bare 1,5 m2, vi vokse 6000 seedlings samtidig, noe som gjør det mulig å utføre timelige kinetics av svaret til en ønsket behandling. I tillegg høstet prøvene kan brukes for flere og komplementære 'omics' analyserer som kan kreve en stor mengde vev (f.eks, immunoblotting). Hydroponic strukturen er av spesiell interesse for grupper å analysere forskjellige plante organer (f.eks, røtter og skudd), fordi deres raskt og enkelt separasjon.

Et lite antall studier beskrevet bruk av pipette tips boksene under første anlegget utvikling før en overføring til større hydroponic tanker11,20, og nylig en svært likt systemet var ansatt å evaluere den aminosyre Acid opptak og translokasjon i 5-uke-gamle Arabidopsis planter57. Protokollen beskrevet her gir ekstra fordeler i form av dyrke planter under sterile forhold.

Selv om dette systemet ble opprinnelig utviklet for å vokse planter, kan det også være egnet for større planter. I dette scenariet er det verdt å nevne at det må være forsiktig plassere frø fjernere fra hverandre for å unngå så mye skygge som mulig under vekst. Videre kan lufting bli introdusert i stativer å hindre hypoksi igjennom en frisk pipette tips flatt, et vanlig problem i neddykket Arabidopsis røtter vokser i lengre perioder. Deres fastsittende naturen er planter utsatt for flere typer abiotiske og biotiske påkjenninger, avhengig av deres omgivelsene. Derfor vurderer sikte på studien og det utviklingen scenen, kan det være viktig å overvåke hvis plantene vokser i systemet lider av noen form for stress.

Resultatene presenteres her har vist at denne hydroponic system er svært nyttig for bruk av kjemikalier nutritive løsningen, spesielt når du arbeider med dyre stoffer, på grunn av lite antall pipette tips stativer. Vi har lyktes i å bruke dette systemet å effektivt undertrykke aktiviteten til TOR kinase av AZD-8055 og bekreftet at fosforylering status nedstrøms målet RPS6 påvirkes allerede etter 30 min behandling programmet. Videre fører TOR hemming til frøplanter som inneholder høyere stivelse nivåer under dag og natt i forhold til kontrollen seedlings. Slike analyser kan lett brukes til å utvide observasjoner allerede oppnådd med transgene linjer, slik at en induserbart undertrykkelse av gen-koding komponentene i TOR komplekse, eller noen andre veien rundt. Oppsummert det foreslåtte hydroponic systemet har mange fordeler fordi det er veldig lett og enkelt å montere, har en lav kostnad (hovedkomponentene er billig og kan gjenbrukes mye), er allsidig (muliggjør studiet av intakt frøplanter eller forskjellige vev i bestemte eller plante utviklingsstadier), og er skalerbar (lar dyrking av et stort antall planter i et svært lite område).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av São Paulo Research Foundation (FAPESP; Gi 12/19561-0) og Max Planck Society. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), og Viviane C. H. da Silva (KAPPER/CNPEM 24/2013) er takknemlig for stipendene. Forfatterne takker Christian Meyer fra Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Frankrike) for generøst å gi antistoffer mot RPS6. Forfatterne takker RTV UNICAMP og Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel deres kundestøtte under lyden innspilling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
  2. Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
  3. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  4. Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
  5. Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
  6. Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
  7. Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
  8. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  9. Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
  10. Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
  11. Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
  12. Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
  13. Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. Asao, T. , InTechOpen. 135-152 (2012).
  14. Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
  15. Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
  16. Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
  17. Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
  18. Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
  19. Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
  20. Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
  21. Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
  22. Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
  23. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
  24. Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
  25. Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
  26. Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
  27. Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. Fleischer, S., Fleischer, B. 174, Academic Press. Amsterdam, The Netherlands. 518-552 (1989).
  28. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
  29. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  30. Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR? Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
  31. Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
  32. Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
  33. Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
  34. Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
  35. Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
  36. Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
  37. Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
  38. Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
  39. Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
  40. Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
  41. Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
  42. Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
  43. Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
  44. Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
  45. Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
  46. Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
  47. Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
  48. Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
  49. Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  50. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
  51. Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
  52. Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
  53. Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
  54. Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
  55. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  56. Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
  57. Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).

Tags

Miljøfag problemet 138 Hydroponic system i vitro kultur små molekyler Arabidopsis thaliana Setaria viridis Pipetter tips rack målet på rapamycin inhibitor AZD-8055
En fleksibel lavpris Hydroponic System for å vurdere anlegget Svar å små molekyler i Sterile forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F.,… More

Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C. M., Mafra, V., da Silva, V. C. H., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter