Summary
Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.
Abstract
Uma vasta gama de estudos em biologia vegetal são executadas utilizando culturas hidropônicas. Neste trabalho, é apresentado um sistema hidropônico crescimento em vitro concebido para avaliar as respostas de fábrica de produtos químicos e outras substâncias de interesse. Este sistema é altamente eficiente na obtenção de mudas saudáveis e homogêneas do C3 e C4 modelo espécies Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, respectivamente. O cultivo estéril evita algas e contaminação de microorganismos, que são conhecidos fatores limitantes para o crescimento normal da planta e desenvolvimento em hidroponia. Além disso, este sistema é escalável, permitindo a colheita de material vegetal em grande escala com pequenos danos mecânicos, bem como a colheita de peças individuais de uma planta, se desejado. Um protocolo detalhado, demonstrando que este sistema tem uma montagem fácil e de baixo custo, como ele usa a pipeta cremalheiras como a plataforma principal para o cultivo de plantas, é fornecido. A viabilidade deste sistema foi validada utilizando mudas de Arabidopsis para avaliar o efeito da droga AZD-8055, um inibidor químico do alvo da rapamicina (TOR) quinase. Inibição de TOR eficientemente foi detectada logo em 30 min depois de um tratamento de AZD-8055 em raízes e brotos. Além disso, plantas de AZD-8055-tratados exibido o fenótipo de amido-excesso esperado. Propusemos este sistema hidropónico como um método ideal para pesquisadores de planta com o objetivo de monitorar a ação da planta indutores ou inibidores, bem como avaliar fluxos metabólicos usando isótopos-rotulagem compostos que, em geral, requer o uso de caro reagentes.
Introduction
As vantagens de crescer plantas usando hidroponia tem sido amplamente reconhecidas na produção de plantas grandes e uniformes, possibilitando experiências reprodutíveis1,2,3. Neste sistema, a composição da solução nutritiva pode ser adequadamente controlada e reciclada ao longo de todas as fases de desenvolvimento e crescimento das plantas. Além disso, as raízes não estão sujeitos ao estresse abiótico, como pode acontecer em plantas de solo cultivado, como nutriente fome e água deficiência4. Como as plantas crescidas hydroponically presentes morfológicas e fisiológicas características bastante semelhantes da cultivadas no solo, este sistema tem sido amplamente empregado em pesquisa porque permite o acompanhamento do crescimento da raiz/fotografar e sua colheita sem lesões de2,5.
Devido à possibilidade de alterar a composição e a concentração da solução nutritiva, a maioria da pesquisa usando condições hidropônicas tem sido realizado para caracterizar as funções de micro e macronutrientes1,3 ,6,7,8. No entanto, este sistema provou para ser muito útil para uma ampla gama de aplicações em biologia vegetal, tal como para elucidar as funções dos hormônios e substâncias químicas em plantas. Por exemplo, a descoberta de estrigolactonas como uma nova classe de hormônios9 e o fenótipo de crescimento acelerado, desencadeada por brassinosteroid aplicação10 foram realizadas em condições hidropônicas. Além disso, este sistema permite experimentos com isótopos rotulados (por exemplo, 14N /15N e 13CO2)11,12 , para avaliar sua incorporação de proteínas e metabólitos por espectrometria de massa.
Considerando a importância deste sistema na pesquisa da planta, foi projetado um elevado número de culturas hidropônicas nos últimos anos, incluindo sistemas que usam a (i) a transferência de mudas de placas para recipientes hidropônico3, 13; (ii) rockwool que limita o acesso aos estágios iniciais de desenvolvimento do raiz2,14,15; (iii) polietileno granulado como o corpo flutuante, o que torna a aplicação homogênea de pequenas moléculas/tratamentos difíceis16; ou (iv) um reduzido número de plantas9,17. O volume dos tanques hidropônicos descrito em muitos desses protocolos são geralmente grandes (pequenos volumes que variam de 1 a 5 L, até 32 L)18, que faz a aplicação de produtos químicos extremamente caro. Embora alguns estudos descrevem um cultivo hidropônico sob condições assépticas8,19, a montagem do sistema é geralmente bastante trabalhoso, consistindo o ajuste perfeito de malhas de nylon em plástico ou vidro recipientes de5,8,17,20.
Devido à importância de Arabidopsis thaliana como uma planta modelo, a maioria dos sistemas de hidroponia foram projetada para esta espécie1,2,8,14,18, 19 , 20. no entanto, existem poucos estudos relatando as características de crescimento hidropônico de outras espécies de plantas com um pré-tratamento de sementes para melhorar sua germinação e taxas de sincronização em vitro8,16 . Para trabalhar em grande escala, desenvolvemos um protocolo para a criação de um sistema hidropónico manutenção simples e de baixo custo que permite condições estéreis para o cultivo de plantas, incluindo a. thaliana e outras espécies, como a grama Setaria viridis. O método descrito aqui é apropriado para experiências diferentes, como o crescimento do seedling pode ser maximizado, sincronizado e facilmente controlado. Além disso, este sistema tem muitas vantagens como: (i) a sua montagem é simples e seus componentes podem ser reutilizados; (ii) permite a fácil aplicação de produtos químicos diferentes para o meio líquido; (iii) as mudas germinam e crescem diretamente no meio de cultura sem a necessidade de transferência para o sistema de hidroponia; (iv) o desenvolvimento/crescimento atirar e raiz pode ser estreitamente vigiado e as mudas são colhidas sem danos; e (v) torna possível trabalhar em grande escala, mantendo condições fisiológicas.
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Protocol
1. preparação de meios de cultura líquidos e sólidos
- Preparar um meio líquido, usando o meio de Murashige e Skoog (MS) de meia-força com vitaminas [0,0125 mg/L de cloreto de cobalt(II) penta-hidratado, 0,0125 mg/L de sulfato de cobre (II) penta-hidratado, 18,35 mg/L de sódio férrico de tetrassódio, 3,10 mg/L de ácido bórico, 0,415 mg/L de iodeto de potássio, 8,45 mg/L de manganês sulfato monohidrato, 0,125 mg/L de molibdato de sódio di-hidratado, 4,30 mg/L de sulfato de zinco hepta-hidratado, 166,01 mg/L de cloreto de cálcio, 85 mg/L de dihidrogenofosfato de potássio, 950 mg/L de nitrato de potássio, 90,27 mg/L de sulfato de magnésio, 825 mg/L de nitrato de amónio, 1 mg/L de glicina, 50 mg/L de mio-inositol, 0,25 mg/L de ácido nicotínico, 0,25 mg/L de cloridrato de piridoxina e 0,05 mg/L de cloridrato de tiamina] suplementado com 0,25 g/L de MES e ajustar o pH a 5.8 com 10 M de KOH.
- Adicione 10 g/L de agar para fazer um meio de MS-sólido de meia-força. Autoclavar o meio a 121 ° C durante 20 min antes de usar.
2. hidropônico sistema de montagem
Nota: Estas etapas devem ser seguidas meticulosamente para construir o sistema hidropônico.
-
Esterilização de material
- Embale no saco de autoclave a ponta da pipeta racks (sem capas) que serão usados como minitanks. Autoclave os racks a 121 ° C por 20 min, 15 libras por polegada quadrada.
Nota: O rack de ponta de pipeta polipropileno usamos tinha as seguintes dimensões: 120 mm (comprimento) x 89 mm (largura) x 55 mm (altura). A superfície plana de ponta de pipeta deve ter uma área para a adição de meio de cultura. Outras cremalheiras de ponta podem ser usadas (ver Tabela de materiais).
Nota: Durante todo o procedimento de montagem do sistema hidropônico, é necessário usar uma capa de fluxo laminar, que deve ser limpos e desinfectada com prévio de 70% de etanol para usar. O experimentador deve vestir um jaleco, lavam as mãos e qualquer expostas da pele e desinfete-os com etanol a 70%. As luvas são opcionais, exceto para a aplicação da droga. - Limpe todos os acessórios descritos acima (caixas de plástico descartáveis, fita adesiva, pipetas, tesoura e pinça) com etanol a 70% antes de entrar o capuz de fluxo laminar. Se o capô permite, acenda a luz de UV para 10 min antes da montagem do sistema hidropônico para manter a área de trabalho descontaminada.
- Embale no saco de autoclave a ponta da pipeta racks (sem capas) que serão usados como minitanks. Autoclave os racks a 121 ° C por 20 min, 15 libras por polegada quadrada.
-
Minitank montagem
- Sele a superfície superior da ponta da pipeta, plana, com fita adesiva (figura 1B). Se possível, deixá-lo sob UV luz por 10 min.
- Adicione 180 µ l de derretido meio de cultura MS sólido (morno) a cada poço usando uma pipeta multicanal (Figura 1).
Nota: Ao preparar muitos tanques, use uma placa de aquecimento para impedir a solidificar o meio MS. - Permita a médio e a solidificar completamente (por cerca de 30 min).
Nota: Durante o período de solidificação, a luz UV pode ser girada sobre. - Encher o rack de ponta de pipeta completamente com meio de cultura líquido MS (Figura 1) e garantir que não há contato entre o sólido e o meio líquido.
- Retire as fitas adesivas da superfície superior da ponta da pipeta plana e enquadrá-la na grelha com cuidado. O sistema hidropônico está agora pronto para receber as sementes esterilizadas.
3. semente esterilização
- Coloque 500 sementes de Arabidopsis em um microtubo de 1,5 mL. Uso como muitos microtubos conforme necessário de acordo com o número de plantas necessário para o experimento.
- Lave as sementes com etanol a 70% por 2 min com uma agitação suave. Deixe as sementes acalmem-se, em seguida, remover o etanol com cuidado.
- Adicione 1 mL de uma solução de hipoclorito de sódio 10% contendo 2 µ l de um detergente de polissorbato 20. Agite a solução durante 5 min. remover a solução cuidadosamente.
- Enxague as sementes com água destilada estéril até que todo o resíduo de água sanitária é completamente removido (cerca de 5x).
Nota: Após a esterilização de superfície, as sementes foram imersas em água destilada estéril e estratificadas a 4 ° C, no escuro para a 5D sincronizar a germinação.
Nota: As sementes de Setaria viridis (adesão A10.1) foram pré-incubada em ácido sulfúrico concentrado por 15 min (quebrar a dormência física), lavadas em água destilada estéril e então desinfestadas com solução de hipoclorito de sódio a 5% contendo 0,1% polissorbato 20 por 5 min com uma agitação suave21. As etapas restantes de esterilização foram idênticas às descritas para as sementes de Arabidopsis .
4. semente aplicação
- Corte um pouco a extremidade de uma dica de 200 µ l, com o auxílio de um bisturi estéril.
- Pipete as sementes de Arabidopsis para o meio de cultura sólido na superfície superior da ponta da pipeta plana. Cuidar para que o meio não se solta do apartamento; caso contrário, as sementes serão sombreadas e as mudas não crescerá corretamente (Figura 1E).
Nota: Utilize uma pinça estéril para sementes de Setaria (com o embrião posicionado para cima). - Loja minitanks tantos quanto possível dentro de uma caixa de plástico descartável para manter uma alta umidade e manter o ambiente livre de microorganismos (Figura 1F).
- Sele a caixa plástica descartável completamente usando fita adesiva para evitar a contaminação.
- Coloque os sistemas hidropônicos em uma câmara de crescimento com as condições adequadas de crescimento para a planta de interesse.
Nota: Neste trabalho, as seguintes condições foram utilizadas: 75% de umidade e 150 µmol m-2 s-1 de irradiância e equinoctial condições de luz de 12 h (21 ° C) / 12h escuro (19 ° C) de Arabidopsis, ou 300 µmol m-2 s-1 de irradiância e 12 h luz (28 ° C) / 12h escuro (25 ° C) para Setaria (Figura 1 e 1 H).
5. validar o uso deste sistema hidropônico para inibir o alvo de rapamicina quinase
Nota: Este sistema hidropônico foi inicialmente desenvolvido para facilitar a gestão dos produtos químicos às plantas, que, em geral, são muito caros ser aplicado em experimentos em grande escala. Como uma prova de conceito, o inibidor competitivo ATP AZD-8055, que é conhecido para alvejar especificamente o sítio de ligação do ATP do TOR proteína quinase22, foi contratado para seguir a repressão da atividade TOR em mudas da . thaliana Columbia-0 ( O centro de estoque de Arabidopsis Nottingham, NASC ID: N22681). Aqui, o protocolo usado é brevemente descrito.
- Cresce sementes hydroponically até palco 1,04 de acordo com o BBCH escala23 (para cerca de 11 d) sob as condições climáticas acima descritas. Substituir a solução nutriente, seja com fresco médio contendo 0.05% DMSO (controle), 2 µM AZD-8055 (inibidor de TOR) diluído em DMSO, ou sem tratamento (simulação), no final da noite (pt).
- Colher algumas mudas em pontos diferentes de tempo após o tratamento e separá-los em raízes e brotos. Congelar as amostras em nitrogênio líquido, triturá-los a um pó fino em um moedor de robótico (ver Tabela de materiais) e armazenar o pó a-80 ° C até o uso.
- Immunoblot contra fosforiladas e não-fosforilada formas de 40S proteína ribosomal S6 (RPS6) de acordo com Dobrenel et al . 24.
- Bleach mudas intactas para despigmentação de amostra, lavar em água destilada, mergulhe-os em uma solução de iodo por 5 min25e fotografar as mudas em um estereomicroscópio (0,63 X objetivo, a aproximação de x 20 e a magnitude de x 7,5) para um avaliação qualitativa do teor de amido.
- Quantificar o amido após a degradação enzimática e a medição da glicose liberada por espectrometria por acoplamento-lo para a redução do NADP+ a NADPH26,27.
- Realizar uma extração de RNA total, uma síntese do cDNA, e ensaios de RT-PCR quantitativo, conforme descrito por Caldana et al 28 para avaliar o nível de expressão de genes relacionados com os diferentes tipos de tensões.
- Opcionalmente, cultivar mudas em um substrato hortícola em potes de plástico com uma capacidade de 0,1 L sob condições climáticas similares [60% de umidade, 150 µmol m-2 s-1 de irradiância e equinoctial condições de luz de 12 h (21 ° C) / 12h escuro (19 ° C )] para compará-los com mudas crescidas hydroponically.
Nota: Os genes alvo utilizados para os ensaios de expressão do gene foram ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), e TPS5 (At4g17770) e seus níveis de expressão foram normalizados empregando o método delta-Ct29 usando ACT2 (At3g18780) ou PDF2 (At4g04890) como os genes de referência interna, assumindo 100% de eficiência de amplificação do PCR em todas as amostras. Os pares do oligonucleotide usados para o PCR quantitativo foram: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) e PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).
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Representative Results
A quinase TOR é um regulador importante que integra os nutrientes e energia sinalização para promover a proliferação celular e crescimento em todos os eucariontes. Esforços para elucidar as funções TOR em plantas incluem a geração de Arabidopsis linhas transgénicas contendo repressão condicional do TOR através da interferência do RNA ou artificial microRNA28,30,31, dado o fenótipo de embrião letal de TOR nocaute plantas32,33,34,35. A maioria das linhas transgénicas condicionais está sob o controle de estradiol-, dexametasona-, ou etanol-inducible promotores, que também poderiam fazer usam deste sistema hidropônico.
Um dos alvos da atividade de TOR em Arabidopsis bem conhecidos é a direta fosforilação da proteína ribosomal S6 quinase (S6K)34,36,37,38. Após fosforilação, S6K mais fosforila a proteína ribossomal 40S S6 (RPS6), afetando as proteínas ribossomais tradução24,39,40. Recentemente, foi demonstrado que a fosforilação de um site de RPS6 Ser240 é um bom marcador de TOR atividade24. Ensaios de immunoblotting confirmaram que, logo após 30 min de administração de drogas, uma diminuição significativa da fosforilação de Ser240 foi observada em raízes e brotos (Figura 2). Nas condições experimentais utilizadas, AZD-8055 também demonstrou ser um potente inibidor da TOR, que rapidamente reprime sua atividade quinase.
Linhas de Arabidopsis transgênicas com uma expressão reduzida do gene TOR ou componentes da TOR complexo apresentam um fenótipo excesso de amido clara28,31. Análise qualitativa do amido usando solução de Lugol revelou o padrão esperado de acúmulo de amido e degradação durante o ciclo de diel (Figura 3). Mudas que não receberam uma aplicação de DMSO ou AZD-8055 mostraram sem maior acúmulo de amido em suas folhas no final da noite (pt), e o acúmulo de amido nas plantas controle (que recebeu 0.05% DMSO) era consistente com a literatura 41 , 42. Além disso, as plantas tratadas com AZD-8055 apresentaram uma quantidade maior de amido restante no pt quando comparado com as mudas de controle. Estes resultados indicaram a utilidade do sistema hidropônico proposto no cultivo de mudas, simulando as condições fisiológicas. Este sistema também permitiu a confirmação do fenótipo de excesso de amido típico de uma repressão de24,de componentes complexos o TOR28,31.
Teor de amido também com precisão foi medido usando uma metodologia sensível, demonstrando que o tratamento de AZD-8055 levou a mudas contendo níveis significativamente mais elevados do amido ambos ao final do dia (ED.) e EN em comparação com o controle de DMSO-tratados plantas (Figura 4). Amido se acumula nas folhas durante o dia e é remobilized durante a noite para sustentar a atividade metabólica, principalmente a respiração e a exportação contínua de sacarose a outros órgãos de planta41,42. Em condições normais, apenas uma pequena fração do amido (entre 5% e 10% do montante para o ED) permanece na EN43,44,45. Estes resultados atestaram que o amido excesso fenótipo observado sob a repressão TOR ocorre tudo ao longo do ciclo de diel.
As plantas hydroponically crescidas foram comparadas com mudas cultivadas em um substrato hortícola sob condições climáticas muito semelhantes relativas a expressão nível do fator de vinculação elemento ácido abscísico-responsivo 3 gene (ABF3) (Figura 5A ), que diretamente correlaciona-se com interno ABA níveis, uma classe de hormônios, amplamente conhecido como um marcador devido ao seu papel no estresse abiótico múltiplas respostas46,47,48. Apesar de mudas cultivadas no sistema hidropônico apresentava um aumento significativo do nível de ABF3, a expressão de asparagina sintetase 1 (ASN1) não foi afetada pelos DMSO ou AZD tratamentos (Figura 5B). No entanto, a trealose fosfato sintase 5 (TPS5) aumentou significativamente após 8 h de inibição TOR (Figura 5B). Asn1 e TPS5 respondem a açúcar de alto e baixo níveis49,50,,51,52,53,54, respectivamente, sugerindo que estas plantas não experimentavam estresse energético.
Figura 1 : Fluxo de trabalho para montar o sistema hidropónico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Efeito da inibição da fosforilação de RPS6 em diferentes tecidos do TOR Arabidopsis thaliana . Immunoblotting mostra a abundância da RPS6 total e fosforilada na raiz (A) e (B) tiro extratos de mudas tratadocom com 2 µM AZD-8055 ou 0,05% DMSO (controle). Valores representam os rácios normalizados pela proteína não-fosforilada RPS6. Anticorpos anti actina foi usado como um controle de carregamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Arabidopsis thaliana mudas manchado com reagente de Lugol. Tratamentos com 2 µM AZD-8055 ou 0,05% DMSO (controle) foram aplicados no pt (seta vermelha) e comparados para zombar de mudas (não-tratamento). Mudas foram colhidas antes da aplicação do tratamento (0 h) e às 12 h (ED) e 24 h (pt) após o tratamento, indicadas por setas pretas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Efeito de inibição do TOR no teor de amido Arabidopsis thaliana mudas. Amido foi medido enzimaticamente antes (0 h) e às 12 h (ED) ou 24 h (pt) após o tratamento com 2 µM AZD-8055 (preto) ou 0,05% DMSO (controle, branco). Os valores mostrados são a média ± erro padrão (SE) (n = 4). Diferenças significativas entre mudas tratadocom com AZD-8055 e DMSO, usando o Student t-teste, são indicadas por asteriscos: * (P < 0,05) e * * * (P < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Nível de expressão de genes relacionados ao estresse. (A) comparação de ABF3 transcritos em hydroponically e substrato-cultivadas mudas de Col-0 de Arabidopsis . (B) comparação de ASN1 e TPS5 transcritos em plântulas de Arabidopsis tratados com 2 µM AZD-8055 e 0,05% DMSO. Os níveis de expressão normalizado são mostrados como 2^(-dCt). Os valores mostrados são a média ± SE (n = 3). Diferenças significativas, usando o Student t-teste, são indicadas por asteriscos: * * * (P < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar a Figura 1:este em vitro sistema hidropónico torna possível sincronizar germinação e obter mudas homogêneas. Sementes de a. thaliana (C3) e S. viridis (C4) foram germinadas directamente no sistema. (A e C) as mudas foram homogêneas em relação à fase de desenvolvimento e o tratamento foi aplicado após 11D (Arabidopsis) ou 7D (Setaria). (B e D) as raizes crescem diretamente em direção a solução nutritiva, facilitando a adição de substâncias diferentes e sua absorção. Estes resultados indicam fortemente que este sistema oferece um ambiente ideal para o crescimento das plantas e pode ser usado para executar com eficiência uma ampla gama de ensaios. Além disso, este sistema hidropônico é muito útil para experimentos em grande escala.
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Discussion
Essa estrutura hidropônica otimizada permite a cultura de sucesso em vitro de plantas. As sementes germinam bem sobre o meio sólido na superfície plana de ponta de pipeta, um ganho considerável em comparação com sistemas onde as sementes estão encharcadas com a solução nutriente. Uma grande vantagem deste sistema é que durante o desenvolvimento das mudas, raízes diretamente em contato com o meio líquido sem a necessidade de transferência. Além disso, tratamento químico pode ser facilmente aplicado em meio líquido em um volume reduzido. Umidade é mantida alta, evitando a evaporação da solução nutritiva e a sua reposição. Além disso, crescimento homogêneo e desenvolvimento durante o estabelecimento de plântulas podem ser facilmente obtidos e aeração não é necessária quando se trabalha com tanques pequenos e mudas a este estágio desenvolvente1,10,18 . Para garantir que o sistema será totalmente livre de contaminantes, um passo fundamental é a esterilização de todo o material utilizado e cuidados intensivos durante a sua montagem. Devido à impossibilidade de esterilizar alguns componentes na autoclave (por exemplo, caixas de plástico descartáveis), é altamente recomendável para primeiramente, limpe-os com etanol a 70% e em seguida, aplicar um curto período de UV luz antes do uso. Em nossa experiência, o uso da luz UV, após a selagem da superfície plana com fita adesiva e durante a solidificação de mídia, também evita a contaminação bacteriana e fúngica. Além disso, tenha cuidado para não tocar a mídia, sempre em movimento as cremalheiras da pipeta no seu lado lateral.
Para garantir o crescimento ideal das mudas, é importante controlar o contato próximo entre meios sólidos e líquidos, garantindo a completa imersão das raízes após a germinação das sementes. O meio sólido deve ser suficientemente denso (ágar de 10 g/L) e totalmente solidificada, então não se solta da superfície plana e flutuar em solução nutritiva. Além de Arabidopsis, este sistema pode ser usado para o cultivo de outras espécies de plantas, enquanto as sementes são suficientemente pequenas para caber os poços do apartamento. Neste sentido, o método hidropônico aqui apresentado também foi eficiente para o cultivo de Setaria viridis, uma pequena grama que surgiu recentemente como um sistema de modelo de romance para estudar C4 fotossíntese, biologia de stress e outros traços de cultura de bioenergia 55. semelhante a Arabidopsis, este sistema permite a produção de mudas de Setaria uniformemente crescentes com um bom sistema de raiz e em grande escala (complementar a Figura 1), porque cada prateleira suporta 96 sementes, garantindo muitas mudas por replicar biológica e, consequentemente, material suficiente para uma infinidade de aplicações a jusante. Um maior número de repetições aumenta a eficiência dos testes estatísticos, conduz a resultados mais precisos e confiáveis em estudos experimentais56. Por exemplo, utilizando uma câmara de crescimento com uma área de apenas 1,5 m2, fomos capazes de crescer 6.000 mudas simultaneamente, tornando-se possível realizar cinética temporal da resposta a um tratamento desejado. Além disso, as amostras colhidas podem ser usadas em múltiplas e complementares 'omics' analisa que pode exigir uma grande quantidade de tecido (por exemplo, immunoblotting). Essa estrutura hidropônica é de especial interesse para os grupos com o objetivo de analisar os órgãos vegetais distintas (por exemplo, raízes e brotos), porque ele permite que sua separação fácil e rápida.
Um pequeno número de estudos descreveu o uso de caixas de ponta da pipeta durante o desenvolvimento inicial da planta antes de uma transferência para maiores tanques hidropônico11,20, e mais recentemente, um sistema muito similar foi utilizado para avaliar o amino absorção de ácido e translocação em 5 semanas Arabidopsis plantas57. O protocolo descrito aqui fornece benefícios adicionais em termos de cultivar as plantas em condições estéreis.
Embora este sistema foi desenvolvido inicialmente para o cultivo de mudas, também poderia ser adequado para plantas maiores. Nesse cenário, vale mencionar que deve ter cuidado para colocar as sementes mais distantes uns dos outros para evitar tanto sombreamento quanto possível durante o crescimento. Além disso, a aeração pode ser introduzida em prateleiras para evitar hipóxia através de um poço de ponta da pipeta plana, um problema comum em submersas raízes de Arabidopsis crescendo por períodos mais longos. Devido à sua natureza séssil, plantas são sujeitas a vários tipos de estresses bióticos e abióticos, dependendo do seu ambiente circundante. Portanto, tendo em conta o objectivo do estudo e fase de desenvolvimento, pode ser importante monitorar se as plantas a crescer neste sistema estão sofrendo de algum tipo de stress.
Os resultados aqui apresentados têm mostrado que este sistema hidropônico é muito útil para a aplicação de produtos químicos para a solução nutritiva, particularmente quando se trabalha com substâncias caras, devido ao pequeno volume de cremalheiras de ponta da pipeta. Nós temos conseguido usando este sistema para reprimir eficazmente a atividade da quinase TOR por AZD-8055 e confirmou que o estado de fosforilação de seu alvo a jusante RPS6 já é afetado após 30 min de aplicação de tratamento. Além disso, a inibição TOR leva a mudas contendo níveis mais elevados de amido durante o dia e a noite em comparação com as mudas de controle. Tais ensaios podem ser facilmente empregados para estender as observações já obtidas com linhas transgénicas, permitindo uma repressão inducible dos componentes da TOR gene-codificação complexa, ou qualquer outro caminho de interesse. Em resumo, o sistema hidropônico proposto possui muitas vantagens, porque é muito fácil e simples de montar, tem um baixo custo (os componentes principais são baratos e podem ser reutilizados extensivamente), é versátil (permite o estudo de plântulas intactas ou tecidos distintos em específico ou ao longo de estádios de desenvolvimento de planta) e é altamente escalável (permite o cultivo de um grande número de mudas em uma área muito pequena).
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa de São Paulo (FAPESP; Conceder 12/19561-0) e a sociedade Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) é grato para as bolsas. Os autores agradecer Christian Meyer do Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, França) generosamente fornecendo anticorpos contra RPS6. Os autores agradecer RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza, pelo apoio técnico durante o áudio de gravação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Duchefa Biochemie | M1503 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7921 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 484016 | |
| Laminar flow hood | Telstar | BH-100 | |
| Hotplate | AREC | F20510011 | |
| Growth chamber | Weiss Technik | HGC 1514 | |
| Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) | Uniglass | 189.006 | |
| 200 μL pipette tip racks | Kasvi | K8-200-5 * | |
| 300 μL multichannel pipette | Eppendorf | 3122000060 | |
| 300 μL pipette tips | Eppendorf | 30073088 | |
| 200 μL pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| 200 μL pipette tips | Eppendorf | 30000870 | |
| Scissors | Tramontina | 25912/108 | |
| Tweezer | ABC Instrumentos | 702915 | |
| Scalpel blade | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Adhesive transparent tape (45mm x 50m) | Scotch 3M | 5803 | |
| Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) | Maxipac | 32771 |
References
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