Summary

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Published: August 21, 2018
doi:

Summary

Proteine, die bestimmte RNA-Sequenzen binden spielen wichtige Rollen in der Genexpression. Ausführliche Charakterisierung von diese Bindungsstellen ist entscheidend für unser Verständnis der Genregulation. Hier wird ein Einzelschritt-Ansatz für Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS beschrieben. Dieser Ansatz ist relevant für alle Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Abstract

Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung. Zahlreiche DNA und RNA-bindende Proteine binden ihre Ziel-Sequenzen mit hoher Spezifität zur Genexpression kontrollieren. Diese regulatorischen Proteinen Steuern Genexpression auf der Ebene der DNA (Transkription) oder auf der Ebene der RNA (Pre-mRNA Spleißen, Polyadenylation mRNA Transport, Verfall und Übersetzung). Identifizierung von regulatorischen Sequenzen hilft zu verstehen, nicht nur wie ein Gen ein- oder ausgeschaltet ist, sondern auch welche nachgeschalteten Gene durch ein bestimmtes regulatorischen Protein reguliert werden. Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.

Introduction

Genregulation spielt eine wichtige Rolle in der Biologie. Gene reguliert werden können, auf der Ebene der Transkription, Pre-mRNA Spleißen, 3′ Ende Bildung, RNA-Export, Übersetzung, mRNA Lokalisierung, Verfall, Post-translationale Modifikation/Stabilität, etc. , die beide DNA und RNA-bindende Proteine Schlüsselrollen in gen spielen Verordnung. Während Molekulare genetische Analysen zahlreiche regulatorische Proteine identifiziert haben, nur eine kleine Teilmenge davon wurden charakterisiert voll und ganz für ihre Zellfunktionen oder verbindliche Sites in Vivo. Phylogenetische Sequenzanalyse und Mutagenese bieten sich ergänzende Ansätze zur Charakterisierung von DNA oder RNA-Protein-Interaktionen.

RNA-bindende Proteine sind wichtig für Entwicklungsprozesse, einschließlich der sexuellen Differenzierung. Der Drosophila -Protein Sex-lethal (SXL) oder die Geschlecht-Hauptschalter Protein fehlt in Männchen, sondern Gegenwart bei Frauen. Es erkennt Uridin-reichen Sequenzen oder Pyrimidine-Traktate neben spezifischen Spleißstellen in nachgeschalteten Pre-mRNA-Ziele (Transformator, Sex-tödlicheund männlich-spezifische lethal2) in somatischen Zellen1,2 ,3,4. Darüber hinaus regelt es polyadenylierungsstelle Wechsel durch die Bindung an Uridin-reiche Polyadenylation Enhancer Sequenzen in die Verstärker der rudimentären (e(r)) Transkript5,6. SXL wahrscheinlich regelt zusätzliche Ziele in der weiblichen Keimbahn, die noch werden identifiziert,1,7,8,9,10,11, 12 , 13.

Charakterisierung von einer Bindungsstelle umfasst Mutagenese, in der Regel, z. B. durch Löschung oder Ersatz von einzelnen oder mehreren Nukleotiden. Jede mutierte Bindungsstelle gegenüber dem Wildtyp RNA-Sequenz wird dann analysiert, mit einer Reihe von proteinkonzentrationen seine Bindungsaffinität zu bestimmen (Kd oder Gleichgewicht Dissoziation Konstante) für das Protein des Interesses; K-d ist die Konzentration des Proteins erforderlich um 50 % RNA-bindende zu erhalten. Dieser arbeitsintensive Prozess detaillierte Mutagenese beinhaltet, Erzeugung und Analyse von zahlreichen Mutanten – drei Wild-Typ Nukleotiden für jede Position in die Bindungsstelle. So gibt es eine Notwendigkeit für einen alternativen Ansatz für schnellere, einfachere und preiswerte Sättigung Mutagenese der Protein-Bindungsstellen in der RNS.

Hier beschreiben wir einen One-Step-Ansatz, der Sättigung Mutagenese von einem Protein-Bindungsstelle in RNA ermöglicht. Es geht um doping DNA Schablone mit Wildtyp-Nukleotide in die Bindungsstelle, Synthese von separaten RNAs mit jeder Phosphorothioat Nukleotid und Isolierung von der gebundenen Anteil nach Inkubation mit Protein. Störungen durch Wildtyp-Nukleotiden führt zu ihren bevorzugten Ausschluss aus der Fraktion proteingebundener. Dies wird durch Gelelektrophorese nach selektiven chemischen Spaltung mit Jod Phosphodiester-Anleihen mit phosphorthioate (Phosphorothioat Mutagenese oder PTM) überwacht. Dieser einstufigen Sättigung Mutagenese Ansatz ist anwendbar auf die Charakterisierung der Protein-Bindungsstelle in RNA.

Protocol

Hinweis: Abbildung 1 gibt einen Überblick über Phosphorothioat Mutagenese und fasst die wichtigsten Schritte im Prozess. 1. Generation aus einer Bibliothek von Mutanten-Doping DNA Schablone mit Wild-Typ Nukleotide Synthetisieren T7 Primer (5′-GTAATACGACTCACTATAG-3 “) durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer. Durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer, die Protein-Bindungsstelle entspricht einem dotierten Oligonukleotid (komp…

Representative Results

Das Prinzip der Sättigung Mutagenese mit doping: Verwenden Sie für eine entsprechende Molverhältnis von Wildtyp und andere Nukleotide eine gleiche Mischung von allen vier Nukleotide, wenn nur eine Position soll analysiert werden. Jedoch, wenn mehrere Positionen gleichzeitig analysiert werden, das Verhältnis zwischen wilden Typ Wildtyp Nukleotide muss angepasst werden, d. h. reduziert. Ansonsten neben einzelnen Ersetzun…

Discussion

Mutagenese ist lang verwendet, um Protein-Bindungsstellen zu charakterisieren. Erstens kann eine Reihe von Mutanten konstruiert und einzeln getestet in verbindlichen Assays, ihre Auswirkungen auf verbindliche Affinität zu analysieren. Während ein standard Mutagenese-Ansatz bietet eine Möglichkeit, mehrere Sequenzen zu analysieren, mehrere Schritte der Standardansatz, wie Mutanten Bau und Durchführung einer Reihe verbindlicher Reaktionen für jeden Mutant beteiligt, ist mühsam und zeitaufwendig und kann nicht Sättig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Der Autor dankt der National Institutes of Health für die letzten Finanzierung und Dank Michael R. Green für die Synthese von Oligonukleotiden.

Materials

Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

References

  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).

Play Video

Cite This Article
Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

View Video