एक 3 आयामी (3 डी)-उच्च प्रवाह Zebrafish भ्रूण सरणी के लिए टेंपलेट मुद्रित
Summary
यहां, हम एक को डिजाइन प्रोटोकॉल वर्तमान और एक zebrafish भ्रूण सरणी टेंपलेट, उच्च प्रवाह zebrafish एक ९६-अच्छी तरह से थाली में सरणी भ्रूण के लिए टेंपलेट के उपयोग पर एक विस्तृत प्रक्रिया के बाद बनाना ।
Abstract
zebrafish एक विश्व स्तर पर मांयता प्राप्त ताजा पानी अक्सर विकास जीव विज्ञान, पर्यावरण विषविज्ञान, और मानव रोग से संबंधित अनुसंधान क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जीव है । बड़ी fecundity, भ्रूण translucency, तेजी से और एक साथ विकास, आदिसहित अपनी अनूठी विशेषताओं के लिए धन्यवाद, zebrafish भ्रूण अक्सर रसायनों और दवा के बड़े पैमाने पर विषाक्तता आकलन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं/कंपाउंड स्क्रीनिंग । एक ठेठ स्क्रीनिंग प्रक्रिया वयस्क zebrafish अंडे शामिल है, भ्रूण चयन, और बहु में भ्रूण सरणी अच्छी तरह से प्लेटें । वहां से, भ्रूण प्रदर्शन और रासायनिक की विषाक्तता के अधीन हैं, या दवाओं की प्रभावशीलता/यौगिकों अपेक्षाकृत जल्दी phenotypic टिप्पणियों के आधार पर मूल्यांकन किया जा सकता है । इन प्रक्रियाओं के अलावा, सरणी भ्रूण एक सबसे अधिक समय लेने वाली और श्रम गहन कदम है कि प्रवाह स्तर सीमा में से एक है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक अभिनव दृष्टिकोण है कि एक 3 डी मुद्रित सरणी वैक्यूम हेरफेर के साथ मिलकर इस श्रमसाध्य कदम को गति टेंपलेट का उपयोग करता है वर्तमान । इस के साथ साथ प्रोटोकॉल सरणी टेम्पलेट, एक विस्तृत प्रायोगिक सेटअप और कदम दर कदम प्रक्रिया, प्रतिनिधि परिणामों के बाद के समग्र डिजाइन का वर्णन करता है । जब कार्यांवित, यह दृष्टिकोण अनुसंधान अनुप्रयोगों के परीक्षण विषयों के रूप में zebrafish भ्रूण का उपयोग कर की एक किस्म में फायदेमंद साबित करना चाहिए ।
Introduction
एक लोकप्रिय मॉडल जीव के रूप में, zebrafish चिकित्सा और विषविज्ञान1,2,3,4के खेतों में व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । इन विट्रो प्लेटफार्मों में की तुलना में, zebrafish एक या दो सेल प्रकार की पेशकश नहीं कर सकता है कि बहुत अधिक जैविक जटिलताओं की पेशकश करते हैं । एक पूरे जीव मॉडल जा रहा है इसके अलावा, zebrafish के बड़े fecundity, तेजी से और एक साथ भ्रूण विकास, और उच्च अंग translucency बड़े पैमाने पर विषाक्तता या दवाओं के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए इस मॉडल अद्वितीय लाभ दिया है/ वयस्क zebrafish की एक जोड़ी द्वारा उत्पादित भ्रूण के सैकड़ों प्रत्येक सप्ताह किसी भी अन्य पूरे जानवर मॉडल को पार और यह उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त बना दिया है ।
एक ठेठ स्क्रीनिंग प्रक्रिया zebrafish का उपयोग कर ऐसे वयस्क zebrafish के रूप में मैनुअल काम, के एक महत्वपूर्ण राशि शामिल है, भ्रूण चयन, और उपयुक्त कंटेनरों में सरणी भ्रूण जहां वे जल विसर्जन के माध्यम से जोखिम के अधीन हैं । भ्रूण के विकास पर नजर रखी है और ऐसी मृत्यु, सेने और विषमता के रूप में अवलोकन अंतिमबिंदु अक्सर मैंयुअल रूप से मूल्यांकन कर रहे है और रसायनों या की प्रभावशीलता के संकेत के विषाक्तता के प्रारंभिक पहचान के रूप में इस्तेमाल किया दवाओं या यौगिकों । स्क्रीनिंग प्रक्रिया को गति देने के लिए, इस तरह के स्वचालित इमेजिंग और कंप्यूटर की सहायता से छवि विश्लेषण के रूप में दृष्टिकोण पहले से पता लगाया गया है । उदाहरण के लिए, उच्च सामग्री इमेजिंग क्षमताओं के साथ सूक्ष्मदर्शी को स्वचालित उज्ज्वल क्षेत्र या zebrafish भ्रूण पर प्रतिदीप्ति इमेजिंग 96/384 अच्छी तरह से6प्लेटों से विभिंन विकासात्मक चरणों में प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया गया है । Microfluidic माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर उपकरणों मस्तिष्क न्यूरॉन्स की इमेजिंग के लिए वर्तमान हेरफेर के माध्यम से zebrafish लार्वा की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया गया7. इन तरीकों काफी पारंपरिक मैनुअल आपरेशन की तुलना में छवि अधिग्रहण की दक्षता में सुधार सकता है । इसके अलावा, छवियों की बड़ी संख्या के साथ उत्पंन किया जा रहा है, छवि विश्लेषण उपकरण भी करने के लिए डेटा प्रोसेसिंग की गति विकसित किया गया है, के रूप में लियू एट अल. और टू एट अल । 8 , 9.
इमेजिंग और छवि विश्लेषण बढ़ जाती है के प्रवाह स्तर के रूप में, यह स्पष्ट है कि दर को परखने के लिए कदम सीमित जोखिम है, जो आम तौर पर उंहें ९६ में सरणी का मतलब है के लिए zebrafish भ्रूण तैयार करने की प्रक्रिया में निहित है-या ३८४-अच्छी तरह से प्लेटें । इस अड़चन कदम को हल करने के लिए विजन-गाइडेड रोबोटिक Mandrell एट अल द्वारा विकसित किया गया । 10 और अमेरिका11 पहले मैनुअल हैंडलिंग की जगह लेकिन उपकरणों बल्कि परिष्कृत थे और वहां एक गहरी सीखने की अवस्था ऐसी तकनीकों को लागू करने के लिए है । इसलिए, एक आसान करने के लिए उपयोग दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए आगे zebrafish स्क्रीनिंग का प्रवाह स्तर में सुधार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है और इस काम का मुख्य उद्देश्य है ।
इस काम में, हम डिजाइन और 3 डी मुद्रण द्वारा टेंपलेट एक भ्रूण सरणी गढ़े । इस तरह के एक सरणी टेंपलेट कुओं में zebrafish भ्रूण entrap कि एक मानक ९६-अच्छी तरह से थाली के साथ फिट डिजाइन किया गया था । इसके बजाय भ्रूण का चयन और उंहें एक एक करके व्यक्तिगत रूप से एक में सरणी, एक भ्रूण फंसाने और एक बहु परत थाली में सभी ९६ भ्रूण सरणी एक बार में प्रदर्शन कर सकता है । इस टेम्पलेट और निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक काफी बहु परत प्लेटों, जो अवधि में स्क्रीनिंग की क्षमता को बढ़ावा देने में होगा, मैन्युअल ऑपरेशन की तुलना में भ्रूण सरणी की दक्षता में वृद्धि हो सकती है. नीचे वर्णित प्रोटोकॉल सरणी टेंपलेट के लिए एक समग्र डिजाइन, zebrafish अंडे, भ्रूण संग्रह, और सरणी शामिल है । चित्र 1 सरणी टेंपलेट के समग्र डिज़ाइन को दिखाता है । आरेख 2 भागों 3 और 4 में वर्णित टेंपलेट के उपयोग पर चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का ओवरव्यू दिखाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम है कि 3 डी के एक सफल कार्यांवयन के लिए करीब ध्यान की आवश्यकता है-zebrafish भ्रूण सरणी के लिए टेंपलेट मुद्रित ।
सरणी टेंपलेट के डिजाइन पर सबसे महत्वपूर्ण कारक फंसा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम “1000plan युवा” कार्यक्रम, Tongji विश्वविद्यालय से स्टार्टअप धन, और NSFC अनुदान # २१६०७११५ और २१७७७११६ (लिन) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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