Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Трехмерный (3D)-напечатан шаблон для высокой пропускной способности Zebrafish эмбриона одевающ

doi: 10.3791/57892 Published: June 1, 2018

Summary

Здесь мы представляем протокол для проектирования и изготовления zebrafish эмбриона, одевающ шаблон, следуют подробные процедуры на использование такой шаблон для высокой пропускной способности zebrafish эмбриона одевающ в 96-луночных плиту.

Abstract

Данио рерио является глобально признанных пресной воды организм часто используются в биологии развития, экологической токсикологии и болезней человека соответствующих исследований. Благодаря его уникальными особенностями, включая большие плодовитость, прозрачность эмбрионов, быстрое и одновременное развитие, и т.д.данио рерио эмбрионы часто используются для больших масштабах оценки токсичности химических веществ и наркотиков/соединение скрининга. Типичная скрининг процедура включает нереста взрослых рыбок данио, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в несколько хорошо пластины. От там эмбрионы подвергаются воздействия и токсичности химических, или эффективность препаратов/соединений может оцениваться относительно быстро основаны на фенотипическую наблюдений. Среди этих процессов одевающ эмбрионов является одним из самых длительных и трудоемких шагов, которые ограничивает уровень пропускной способности. В этом протоколе мы представляем новаторский подход, который делает использование шаблона выстраивающихся 3D-печать Наряду с вакуумной манипуляции, чтобы ускорить этот трудоемкий этап. Протокол в настоящем документе описывается общий дизайн выстраивающихся шаблон, подробный экспериментальной установки и шаг за шагом процедуры, после чего представитель результаты. При реализации, этот подход должен оказаться полезным в различных исследовательских приложений с помощью zebrafish эмбриона как тестирование субъектов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Как организм популярная модель данио рерио широко используется в области медицины и токсикологии1,2,3,4. По сравнению с платформами в пробирке , данио рерио предлагают гораздо большей биологической сложности, что один или два типа клеток не может предложить. Помимо того, что весь организм, модель, данио рерио большая плодовитость, быстрых и одновременных эмбрионального развития и высокий орган полупрозрачность дали уникальные преимущества этой модели использоваться для больших масштабах токсичности или наркотиков/соединение скрининг5. Сотни зародышей одна пара взрослых рыбок данио каждую неделю превосходят любой другой весь Животные модели и сделали это подходит для высокой пропускной способности скрининга.

Типичная скрининг процедура, с помощью данио рерио включает в себя значительное количество ручной работы, такие как взрослых рыбок данио нереста, отбор эмбрионов и одевающ эмбрионов в соответствующих емкостях, где они подвергаются воздействию путем погружения в воду. Мониторинг развития эмбрионов и наблюдаемых конечные точки как смертность, выводимости и аномалий часто оцениваются вручную и используется в качестве предварительных опознавательные токсичность химических веществ или признаки эффективности наркотиков или соединений. Чтобы ускорить процедуру проверки, были изучены ранее подходов, таких как автоматическое создание образов и анализа компьютерных изображений. К примеру Микроскопы с высоким содержанием изображений возможности были адаптированы для выполнения автоматизированных ярко поле или флуоресценции изображений на zebrafish эмбриона на различных этапах своего развития от 96/384 хорошо пластины6. Microfluidic приборы, в сочетании с Микроскопы были использованы для позиции данио рерио личинок через текущую манипуляцию нейронов мозга7для воображения. Эти подходы могли бы значительно повысить эффективность поглощения изображения по сравнению с традиционной ручной работы. Кроме того с большим количеством изображений создаются, инструменты анализа изображений также были разработаны для ускорения обработки данных, как это продемонстрировано Лю et al. и ту et al. 8 , 9.

Как уровень пропускной способности анализа изображений и изображения увеличивается, стало ясно, что тариф ограничивая шаг для отбора лежит в процессе подготовки zebrafish эмбриона для экспозиции, который обычно означает, одевающ их в 96 - или 384-ну пластины. Чтобы решить это узкое место, видение руководствуясь робототехника были разработаны Мандрелл et al. 10 и нас11 ранее, чтобы заменить ручной обработки, но инструменты были довольно сложные и есть глубокий кривой обучения для осуществления таких методов. Таким образом чтобы обеспечить легкий к употребление подход становится одним из важных факторов для дальнейшего улучшения уровень пропускной способности данио рерио скрининга и является главной целью этой работы.

В этой работе мы разработаны и изготовлены эмбриона, одевающ шаблон 3D печати. Такой шаблон выстраивающихся был разработан чтобы завлечь zebrafish эмбриона в скважины, которые подходят с стандартных 96-луночных пластины. Вместо выбора эмбрионов и одевающ их в отдельные хорошо один за другим, один может выполнить эмбриона изобличения и массив все 96 эмбрионов в многослойные пластины одновременно. Используя этот шаблон и следующий протокол, одно может значительно повысить эффективность одевающ эмбрионов в многослойные пластины, которые бы в срок увеличить потенциал скрининга по крайней мере в десять раз, по сравнению с ручной работы. Протокол, в описанный ниже включает в себя общий дизайн для одевающ шаблон, данио рерио нереста, коллекции эмбриона и одевающ. Рисунок 1 показывает общий дизайн выстраивающихся шаблона. Рисунок 2 показывает обзор протокола пошаговую инструкцию по использованию шаблона, описанные в частях 3 и 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Проектирование и изготовление Zebrafish эмбриона одевающ шаблон

  1. Дизайн выстраивающихся шаблон с 12 на 8, 96-луночных макет, который подходит для стандартных 96-луночных пластины. Использование измерения, перечисленных на рисунке 1A для камеры захвата верхней эмбриона (см. также дополнительный файл).
    1. Используйте измерения, показано на рисунке 1B и 1 D для захвата хорошо.
    2. Использование измерения в Рисунок 1 c для нижней вакуумной камеры.
    3. Использовать измерения, на рисунке 1B для воздуха в / выход.
  2. Использовать 3D-принтер (с точностью до 0,1 мм) для печати шаблона; Смотрите Таблицу материалов для рекомендованных смолы использоваться для печати.
    Примечание: 3D принтеры с точностью 0,1 мм, рекомендуется для изготовления выстраивающихся шаблона (см. Таблицу материалы). Предлагаемые цвета для поверхности шаблона — темно-серый или черный.

2. Zebrafish эмбриона нереста

  1. Место две пары мужчин и женщин рыбы в спаривания поле за один день до нереста. Отдельные мужчины и женщины, ясно пластиковый делитель.
  2. Взлет разделители утром смесь рыбы мужского и женского пола.
  3. Удаление рыбы мужского и женского пола и собирать zebrafish эмбриона с помощью мелкоячеистое сито. Мыть эмбрионов с яйцо 250 мл воды (см. Таблицу материалы).
  4. Передавать собранные эмбрионов Петри (90 мм в диаметре) с Holtfreter на решение (см. Таблицу материалы) и удаление мертвых и неоплодотворенных эмбрионов, с помощью стереомикроскопом.
  5. Место эмбрионы в инкубаторе 28,5 ° C. В 4 ч оплодотворение (hpf), наблюдать эмбрионы и удалите любые мертвых и нездоровой эмбрионов. Эмбрионы теперь готовы к следующему шагу.

3. Подготовка одевающ шаблон

  1. Вымойте шаблон 2 – 3 раза с 500 мл деионизированной водой и положить его в сушильной печи (45 ° C) 5 мин.
  2. Лента в нижней камере с куском уплотняющей пленки (Рисунок 2Шаг 1).
  3. Подключение вакуумного насоса через выход воздуха в нижней части шаблона.
    Примечание: Рекомендуемая макс вакуум для вакуумного насоса является 0,1 МПа. Следует помнить о силе вакуума используется. Если отрицательное давление будет слишком сильным, вырежьте крестообразное отверстие на уплотнение фильм для снижения давления.

4. одевающ Zebrafish эмбриона в плиту 96-луночных

  1. Использование пипетки пластиковые передачи, место приблизительно 150 эмбрионов в шаблон, как показано в рисунке 2, шаг 2.
  2. Подсоедините вакуумный насос для выпуска воздуха и используется для создания отрицательного давления в камере, герметичные уплотнения фильм на шаге 3.3.
  3. Встряхните весь шаблон по горизонтали до тех пор, пока каждый хорошо имеет одного эмбриона захваченного (рис. 2, шаг 3).
    Примечание: Если Holtfreter раствор высыхает, прежде чем эмбрионы оказались в ловушке в каждой скважине, добавить дополнительные Holtfreter решение в камере изобличения и повторите этот шаг.
  4. Отменить решение дополнительных Holtfreter и эмбрионов, которые не попадают в скважинах (рис. 2, шаг 4).
  5. Выключите и отсоедините вакуумного насоса.
  6. Переверните стандартных 96-луночных пластины против шаблон (рис. 2, шаг 5) и поверните оба в то же время (рис. 2, шаг 6).
  7. Нажмите в нижней части шаблона или подключить воздух розетки для сжатого газа пыли может передать всех захваченных эмбрионов из шаблона 96-луночных пластины (рис. 2, шаг 6).
  8. Повторите шаг 4.1 до 4,8 подготовить дополнительные несколькими хорошо пластины.
  9. Снимите уплотнение пленку и вымыть шаблон 3 раза сверху вниз с 500 мл деионизированной воды для использования в будущем.
    Примечание: Не используйте любые органические растворители, как этанол, чтобы очистить шаблон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рисунок 3 показывает типичный шаблон выстраивающихся 3D-печати. Этот шаблон использует фоточувствительный смолы в качестве сырья и был сделан на 3D принтере; слой черной краской был применен для обеспечения лучшей контрастности цвета эмбрионов. Положение 96 скважин (12, 8) был разработан для стандартных 96-луночных плитой. Аналогичным образом шаблон хорошо 384 (24 х 16) также могут быть разработаны и изготовлены с использованием того же метода. Положительная сторона камеры был немного больше, чем стандартных 96-луночных пластины для предоставления более уместно. Канавки, также были разработаны одевающ провести дополнительные эмбрионы.

Умеренными темпами 20 пластин может быть подготовлен с использованием 3D-печати выстраивающихся шаблона в течение 30 мин, в то время как только два-три пластины могут быть подготовлены вручную. Таблица 1 показывает сравнение между шаблон вручную, роботов и выстраивающихся операций. Рисунок 4 показывает сравнение между двумя пластинами, одетые в шаблоне выстраивающихся 3D-печати, подготовлен вручную. Используя выстраивающихся шаблон, существует незначительное количество жидкости, переданных с эмбрионов, которые также сделал это удобно для дальнейшего воздействия экспериментов.

Рисунок 5 показывает, что существует не существенное воздействие на общее состояние здоровья эмбрионов после будучи гальваническим методом ручной и выстраивающихся шаблон. Чтобы убедиться, что эмбрионы не были затронуты такой процесс выстраивающихся, мы следовали развития эмбриона после их одевающ в 96-луночных пластины для 3 дней. Ставка штриховкой, выживаемости и уродство ставка zebrafish эмбриона на 24, 48 и 72 hpf были все сопоставимые с эмбрионами, выстроил вручную.

Figure 1
Рисунок 1: дизайн zebrafish эмбриона, одевающ шаблон. (A и C) 3-d Max рисунок показаны обзор шаблон. (B) сечение вид шаблона. (D) A частичный вид шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: типичные шаги при использовании шаблона выстраивающихся. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: фотографии 3D-печати выстраивающихся шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: микроскопические изображения эмбрионов после 96-луночных пластина. (A) частичное изображение 96-луночных пластины, одетые в шаблоне. (B) частичное изображение 96-луночных пластины, выстроил вручную. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: общее состояние здоровья эмбрионов после будучи гальваническим методом ручной и выстраивающихся шаблон. На основе штриховкой, ненормальное и выживаемости эмбрионов после того, как покрытие с помощью ручной или выстраивающихся шаблон методов, не существенное воздействие на общее состояние здоровья эмбрионы были замечены в любом случае. Планки погрешностей, стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Вручную Роботизированная платформа Одевающ шаблон
Покрытие время 10 – 30 мин/плиты 5 – 10 мин/плиты 1 – 2 мин/плиты
Стоимость Низкая Высокая Низкая
Обучение Минимум Высокая Минимальное значение
Рабочая зона Маленький Большие Маленький
Влияние на эмбрионов Практически никто не Практически никто не Практически никто не
Количество жидкости, добавил на колодец Случайный 5 – 10 МКЛ Минимум

Таблица 1: Сравнение операций вручную, роботов и выстраивающихся шаблон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Есть два критических шагов в настоящем Протоколе, которые требуют пристального внимания для успешной реализации 3D-печати шаблон для одевающ zebrafish эмбриона.

Наиболее важным фактором в разработке выстраивающихся шаблон является хорошо захвата. Делает уверен Есть только один эмбрион, захваченных в каждой скважине, следует обратить пристальное внимание на диаметр и глубина скважины захвата и диаметр через отверстия. Рекомендуемый диаметр находится в 1,5-2 раза диаметра типичной эмбриона (включая хориона). Глубина захвата хорошо должна быть в 2 раза диаметра типичной эмбриона (включая Хорион) чтобы избежать укладки эмбрионов в том же хорошо. Диаметр отверстия через должно быть примерно половину диаметра типичной эмбриона (включая Хорион) чтобы избежать эмбрионов, вытесняют через отверстие отрицательное давление. Из-за сложности конструкции технологии 3D печати рекомендуется для изготовления выстраивающихся шаблона.

Суть выстраивающихся шаблон состоит в том, чтобы завлечь отдельных эмбрионов в установленных местах, т.е. позиции, которые подходят с 96 - или 384-ну плиты. Для создания надлежащего отрицательное давление для хранения отдельных эмбрионов на месте без их повреждения, один необходимо скорректировать отрицательное давление, создаваемое вакуумного устройства. Слишком большое давление может уничтожить эмбрионов, в то время как слишком мало давление не может поймать их в скважинах. Поэтому настоятельно рекомендуется соблюдать эмбрионов, захваченного в шаблоне под стереомикроскопом перед передачей их в multiwell пластины. Кроме того во время захвата, эмбрионы могут подвергаться воздействию воздуха во время этого процесса. Если это произойдет, добавить дополнительные Holtfreter средних в зале захвата согласно шаг 4.3. Кроме того из-за возможности эмбрионов, подвергаются воздействию воздуха, текущий протокол не работает на dechorionated zebrafish эмбриона.

Выстраивающихся шаблон, представленные в этой работе обеспечивает новаторский подход для создания платформы лоу кост и высокопроизводительного скрининга с помощью zebrafish эмбриона. По сравнению с ранее установленным роботизированной платформы или инструмента на основе цитометрии коммерчески доступных потока, этот метод является простым в использовании и не требует сложной подготовки. Принимая преимущества технологии 3D печати, одно может легко изменить формат выстраивающихся шаблон для различных целей.

Шаблон и протокол в его нынешнем виде все еще требуют некоторые ручной работы. Упорядочение процедуры могли бы далее улучшить уровень пропускной способности и увеличить количество multiwell пластин, подготовленные в течение короткого периода времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы были заполнены патент на шаблоне описано 3D-печати.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана программа «1000plan молодежи», запуска средства от Университета Тунцзи и NSFC Грант # 21607115 и 21777116 (Лин).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish Facility Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. Z-A-S5
Mating box Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml Sangon Biotech F505001-0001
Sodium chloride Vetec V900058-500G
Potassium Chloride Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10016318
Calcium chloride Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 20011160
Sodium bicarbonate  Vetec v900182-500G
Methylene Blue Hydrate TCI M0501
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10011008
Sea Salts Instant Ocean SS15-10
Pipetter Fisherbrand 13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet Fisherbrand 13-678-30
Microscope OLYMPUS SZ61
Biochemical incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. LRH-250
3D printer UnionTech Lite600
Photosensitive resin UnionTech UTR9000
Vacuum pump Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals Solarbio YA0245
96 well plate Costar 3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl Eppendorf 3122000.051
Compressed Gas Duster Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. ST1005
DI Water Thermo GenPure Pro UV/UF
Drying oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. BPG-9106A
System water Water out of the facility’s water system
Egg water Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, (7446), 498-503 (2013).
  2. Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357, (6353), 745-745 (2017).
  3. Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9, (2), 2038-2048 (2015).
  4. Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8, (5), 4450-4464 (2014).
  5. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
  6. Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5, (9), 7284-7295 (2011).
  7. Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  8. Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7, (4), (2012).
  9. Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
  10. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17, (1), 66-74 (2012).
  11. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, (9-10), 1608-1618 (2013).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, T., Jiang, Y., Lin, S. A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying. J. Vis. Exp. (136), e57892, doi:10.3791/57892 (2018).More

Yu, T., Jiang, Y., Lin, S. A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying. J. Vis. Exp. (136), e57892, doi:10.3791/57892 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter