Summary
ここでは、設計し、高スループット ゼブラフィッシュ胚配列 96 ウェル プレートにそのようなテンプレートの利用に関する詳細な手順が続くテンプレートを配列複写するゼブラフィッシュ胚を作製するためのプロトコルを提案する.
Abstract
ゼブラフィッシュ、よく発達生物学、環境毒物学および人間の病気で使用される国際的に認められた淡水生物関連研究分野。大規模な産卵、胚の透明度、迅速かつ同時開発など、独自の機能によりゼブラフィッシュ胚大規模な化学物質の毒性評価にしばしば使用と薬物スクリーニング。大人のゼブラフィッシュの産卵、胚の選択、およびウェル プレートに胚を配列複写する、典型的なスクリーニング プロシージャが含まれます。そこから、胚は、露出と、化学物質の毒性にさらされてまたは薬・化合物の有効性は表現型の観察に基づいて比較的迅速に評価できます。これらのプロセスの中で配列複写する胚はスループット レベルを制限する最も時間のかかる、労働集約的な手順の 1 つです。このプロトコルは 3 D プリントの計測テンプレートの使用と相まって真空操作この面倒な手順をスピードアップする革新的なアプローチを提案する.本プロトコルでは、計測テンプレート、実験的セットアップの詳細な手順については、代表的な結果が続くの全体のデザインについて説明します。実装された場合、このアプローチはさまざまな科目をテストとして zebrafish の胚を用いた研究アプリケーションで有利証明する必要があります。
Introduction
人気のモデル生物としてゼブラフィッシュ、薬および毒物学1,2,3,4の分野で広く使用されます。体外のプラットフォームと比較して、ゼブラフィッシュを提供多くの大きい生物の複雑さ、1 つまたは 2 種類の細胞が提供できなかった。モデル、ゼブラフィッシュの大産卵、迅速かつ同時の萌芽期の開発および高い臓器全体の生物をことのほか、透光性は大規模な毒性または薬/化合物5をスクリーニングするためにこのモデルのユニークな利点を与えています。毎週 1 組大人のゼブラフィッシュのによって生成される胚の数は他の全体の動物モデルを上回るし、高スループット スクリーニングに適したになっています。
ゼブラフィッシュを用いた典型的なスクリーニング プロシージャには、大量アダルト ゼブラフィッシュ産卵、胚の選択と適切な容器の水浸漬による暴露を受ける場所に胚を配列複写するなどの手動作業にはが含まれます。胚の開発は監視され、死亡率、孵化率、異常など観測可能なエンドポイントがしばしば手動で評価され、化学物質の毒性の徴候の効果の予備的な id として使用薬や化合物。以前審査手続きをスピードアップするための自動化された画像とコンピューター支援画像解析などのアプローチの検討しています。たとえば、顕微鏡画像処理機能の高いコンテンツでは 96/384 ウェル プレート6からの様々 な発達段階でゼブラフィッシュ胚に対して自動明視野または蛍光イメージングを実行する適応されています。顕微鏡と相まってマイクロ流体デバイスは、ゼブラフィッシュ脳神経7のイメージングのための現在の操作を通じて幼虫を配置する使用されました。これらのアプローチは、伝統的な手作業と比較してイメージの獲得の効率を大きく改善できます。また、生成される画像の数が多い、画像解析ツールも開発されているデータ処理速度を上げる劉らと Tuらによって示されるように8,9。
画像処理と画像解析のスループット レベルが増加すると、検診率制限ステップは 96 または 384 ウェル プレートにそれらを配列複写を意味する通常の暴露のゼブラフィッシュ胚の準備過程であることが明らかになった。このボトルネックのステップを解決するためにビジョンを統合したロボットは、チャートらによって開発されました。十我々 ではなく洗練された11手動処理ですが楽器を交換する以前、このようなテクニックを実装するための深い学習曲線があります。そのため、簡単に使用できるアプローチ ゼブラフィッシュ スクリーニングのスループット レベルをさらに向上させる一つの重要な要因になるし、この作品の主な目的は、提供します。
この作業には、設計し、3 D 印刷テンプレートを配列複写する胚を作製しました。そのような計測テンプレートは、標準の 96 ウェル プレートに適合の井戸にゼブラフィッシュ胚をわなに掛けるに設計されました。胚を選択して個々 も一つずつにそれらを配列複写するのではなく、1 つが胚および配列すべて 96 胚多層板に一度に行います。このテンプレートは、次のプロトコルを使用して、1 つは大幅語のブーストのスクリーニング能力は少なくとも 10 倍、手動操作と比較して、多層板に胚を配列複写の効率を向上できます。下記プロトコルには、テンプレート、ゼブラフィッシュの産卵、採卵を配列複写と配列複写のための全体的なデザインが含まれています。図 1計測テンプレートの全体的なデザインを示しています。図 2は、部品 3 と 4 で説明されているテンプレートを使用してステップバイ ステップのプロトコルの概要を示しています。
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Protocol
1. デザイン ・ テンプレートを配列複写するゼブラフィッシュ胚の作製
-
8、12、96 ウェル レイアウト標準の 96 ウェル プレートに適合する計測テンプレートをデザインします。寸法は上の胚のわなに掛ける事室図 1 aに示したを使用 (「補足のファイル」も参照)。
- まあ、わなに掛ける事の図 1 bと1 Dに表示されるディメンションを使用します。
- 図 1の下の真空チャンバーの寸法を使用します。
- 図 1 bの中の空気の寸法を使用/コンセント。
- (0.1 mm 精度) と 3 D プリンターを使用して、テンプレートを印刷するには印刷に使用する推奨される樹脂材料表を参照してください。
注: 0.1 mm 精度の 3 D プリンターに適している計測テンプレートの作製 (材料の表を参照してください)。テンプレートの表面の推奨色はダークグレーや黒です。
2. ゼブラフィッシュ胚産卵
- 交尾ボックス産卵前に 1 日あたり男性と女性の魚の 2 つのペアを配置します。別の男性と透明なプラスチックの分周器で女性。
- 男性と女性の魚を混ぜて朝仕切りを取る。
- 男性と女性の魚を外し、細かいメッシュのストレーナを用いたゼブラフィッシュ胚を収集します。ウォッシュ 250 mL 卵と胚水 (材料の表を参照してください)。
- シャーレ (直径 90 mm) Holtfreter のソリューションで収集した胚を転送 (材料の表を参照) を外し、顕微鏡を使用して死んだと未受精卵の胚。
- 28.5 ° C のインキュベーターで胚を配置します。4 h でポスト受精 (hpf)、胚を観察し、死者と不健康な胚を削除します。胚は、次のステップの準備が整いました。
3. テンプレートを配列複写の準備
- 500 mL の脱イオン水で 2-3 回テンプレートを洗浄し、乾燥炉 (45 ° C) 5 分のためにそれを置きます。
- (図 2、ステップ 1) フィルム シールの部分と下部室をテープします。
- テンプレートの下部にエアアウトレットを真空ポンプに接続します。
注: 真空ポンプ用推奨最大真空は 0.1 Mpa です。使用真空の強度に注意してください。負圧が強すぎる場合は、圧力を下げるシールのフィルムに、十字形の穴をカットします。
4. 96 ウェル プレートにゼブラフィッシュ胚を配列複写します。
- 図 2,手順 2 で示したようテンプレートに約 150 胚を置くプラスチック転送ピペットを使用して。
- 手順 3.3 でシール フィルムでシールした商工会議所で負圧を生成する空気アウトレットに真空ポンプを接続します。
- までそれぞれよく 1 つの胚に陥れた (図 2,ステップ 3) テンプレート全体を水平方向に振る。
注: Holtfreter のソリューションは、胚は、各井戸に閉じ込められている前に干上がって、わなに掛ける事の商工会議所で追加の Holtfreter のソリューションを追加し、この手順を繰り返します。 - 余分な Holtfreter のソリューションとウェルズ (図 2,ステップ 4) にはめがない胚は廃棄します。
- 切り、真空ポンプを外します。
- テンプレート (図 2,ステップ 5) に対して標準の 96 ウェル プレートを逆さまに配置、両方同時に (図 2,ステップ 6) を回転させます。
- テンプレートの下部をタップまたは接続空気圧縮ガス散布するコンセントがテンプレートから 96 ウェル プレート (図 2,ステップ 6) に閉じ込められたすべての胚を転送することができます。
- 4.1 に 4.8 追加ウェルプレートを準備する手順を繰り返します。
- シールのフィルムを外し、下へ将来の使用のための 500 mL の脱イオン水と 3 回上からテンプレートを洗います。
注: テンプレートをきれいにするのに、エタノールのような有機溶剤を使用しないでください。
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Representative Results
図 3は、一般的な 3 D 印刷の計測テンプレートを示しています。このテンプレート原料として感光性樹脂を使用し、3 D プリンターによって作られました。黒いペンキの層は、胚の色にコントラストを提供するために適用されました。96 ウエル (8 に 12) の位置は、標準の 96 ウェル プレートに合うように設計されました。同様に、384 (16 で 24) もテンプレートも設計することができます、同じメソッドを使用して作製しました。上下の部屋はより良いフィットを提供するために標準的な 96 ウェル プレートよりやや大きかった。溝も、配列中に余分な胚を保持するために設計されました。
緩やかな速度で 2 ~ 3 版のみを手動で準備が 30 分以内で 3 D プリントされた計測テンプレートを使用して 20 のプレートを準備でした。手動、ロボット、および計測テンプレート操作の比較を表 1に示します。図 4は、2 つのプレート、3 D プリントされた計測テンプレートによってアレイ 1 つ、1 つの手動で準備の間の比較を示します。ごくわずかな液体また更に屋外暴露実験に便利に作られた胚の転送があった計測テンプレートを使用します。
図 5は、マニュアルと計測テンプレート メソッドによってめっきされて後胚の全体的な健康状態に重大な影響がなかったことを示します。胚がこのような計測プロセスの影響を受けないように、3 日間の 96 ウェル プレートにそれらを配列複写後胚発生を追った孵化率、生存率、奇形率 24、48、72、ゼブラフィッシュ胚の hpf すべて手動でアレイ胚と同等であった.
図 1: デザイン テンプレートを配列複写するゼブラフィッシュ胚の。(A 、 C) 3 d 最大図面テンプレートの概要を示します。(B) 断面をテンプレートの表示します。(D) A テンプレートの部分的なビューです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 計測テンプレートを使用するときの一般的な手順です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 3 D プリントの計測テンプレートの写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 96 ウェル プレートに転送後の胚の顕微鏡画像。(A) テンプレートによって配列 96 ウェル プレートの部分的な画像です。(B) 手動でアレイ 96 ウェル プレートの部分的な画像です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: マニュアルと計測テンプレート メソッドによってめっきされて後胚の全体的な健康状態。後孵化、異常、および胚の生存率に基づくメッキ マニュアルまたは計測テンプレート メソッドを使用して、胚の全体的な健康に重大な影響が認められなかったどちらの場合。誤差の標準偏差があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 手動 | ロボットプラット フォーム | テンプレートを配列複写します。 | |
| めっき時間 | 10-30 分/プレート | 5-10 分/プレート | 1-2 分/プレート |
| コスト | 低 | 高 | 低 |
| 必要なトレーニング | 最小値 | 高 | 最小値 |
| 作業エリア | 小さな | 大規模です | 小さな |
| 胚に及ぼす影響 | ほとんどなし | ほとんどなし | ほとんどなし |
| ウェルあたり追加液体の量 | ランダム | 5-10 Μ L | 最小値 |
表 1:の手動、ロボット、および計測テンプレート操作の比較。
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Discussion
ゼブラフィッシュ胚を配列複写する 3 D 印刷テンプレートの実装を成功させるために細心の注意を必要とするこのプロトコルの 2 つの重要なステップがあります。
計測テンプレートのデザインの最も重要な要因は、わなに掛ける事も。各ウェルに閉じ込められて 1 つだけ胚があることを確認して、1 つは直径およびわなに掛ける事の井戸の深さ、スルーホールの直径に細心の注意を払う必要があります。推奨直径は典型的な胚 (卵膜を含む) の直径の 1.5 倍から 2 倍以内です。よくたまり深さべき内 2 回 (絨毛膜を含む) 典型的な胚の直径の同じ胚の重なりを避けるために。スルーホールの直径に約典型的な胚 (卵膜を含む) の直径の半分穴から負圧で圧迫されて胚を避けるため。デザインの複雑さのため、3 D 印刷技術は計測テンプレートの作製に適しています。
計測テンプレートの本質は 96 または 384 ウェル プレートと合う位置すなわち指定された場所に個々 の胚をわなに掛けることです。代わりにそれらを損傷することがなく個々 の胚を保持する適切な負圧を作成するには、真空装置によって発生する負圧を調整する必要が 1 つ。あまりにも多くの圧力があまり圧力が井戸にトラップされない間、胚を破壊します。したがって、顕微鏡の下でテンプレートに multiwell プレートに転送する前に捕捉された胚を観察することを強くお勧めします。さらに、わなに掛ける事、中に胚が空気にさらされるこのプロセス中に。この場合、追加 Holtfreter を追加 4.3 のステップにしたがっておとり捜査室の中。また、胚が空気にさらされている可能性があるため現在のプロトコルに取り組みません dechorionated ゼブラフィッシュ胚。
この作品で提示計測テンプレートは、ゼブラフィッシュの胚を使用して低コストで高スループット スクリーニング プラットフォームを構築する革新的なアプローチを提供します。以前に確立されたロボットのプラットフォームまたは市販の流れ cytometry ベースの計測器と比較して、このメソッドは使いやすく、高度な訓練を必要としません。3 D 印刷技術の利点を取る、1 つは簡単にさまざまな目的に合わせて計測テンプレートの形式を変更可能性があります。
テンプレートおよびプロトコルの現在の形態でまだ手動作業が必要。手順を効率化さらに改善できるスループット レベルと時間の短い期間内で調製した multiwell プレートの量を増やします。
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Disclosures
著者は記述されていた 3 D 印刷テンプレートに特許を満ちています。
Acknowledgments
この作品は「青春 1000plan」プログラム、同済大学と NSFC グラント # 21607115 からスタートアップ資金、21777116 (Lin) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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