Digital PCR for kvantifisering sirkulerer MicroRNAs i akutt hjerteinfarkt og hjerte-og karsykdommer

Summary

Sirkulerende microRNAs har vist lovende som biomarkers for kardiovaskulære sykdommer og akutt myokardisk infarkt. I denne studien beskriver vi en protokoll for miRNA utvinning, omvendt transkripsjon og digital PCR for den absolutte kvantifiseringen av miRNAs i serum av pasienter med hjerte-og karsykdommer.

Abstract

Sirkulerende serum microRNAs (miRNAs) har vist lovende som biomarkers for hjerte-og karsykdommer og hjerteinfarkt (AMI), blitt løslatt fra hjerte cellene i sirkulasjonen. Sirkulerende miRNAs er svært stabile og kan kvantifiseres. Kvantitativ uttrykk for bestemte miRNAs kan kobles til patologi, og noen miRNAs viser høy vev og sykdom spesifisitet. Finne romanen biomarkers for kardiovaskulære sykdommer er av betydning for medisinsk forskning. Ganske nylig, digitale polymerasekjedereaksjons (dPCR) har oppfunnet. dPCR, kombinert med fluorescerende hydrolyse sonder, kan bestemt direkte absolutt kvantifisering. dPCR utstillinger overlegne tekniske egenskaper, inkludert lav variasjon, høy linearitet og høy sensitivitet sammenliknet med de kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR). Dermed er dPCR en mer nøyaktig og reproduserbar metode for direkte kvantifisere miRNAs, spesielt for bruk i store multi-senter hjerte kliniske forsøk. I denne publikasjonen beskriver vi hvordan å utføre digitale PCR for å vurdere hvor absolutt kopi i serumprøver.

Introduction

Sirkulerende miRNAs har blitt identifisert som lovende markører for en rekke sykdommer, inkludert hjerte sykdom¹. MiRNAs er små, ikke-koding single-strandet RNA molekyler (ca 22 nukleotider lang) er involvert i den post-transcriptional forordning via endring av budbringer RNA oversettelsen og påvirker gene expression², og inn i blodsirkulasjonen i både fysiologiske og patologiske tilstander. Kvantitativ uttrykk for bestemte miRNAs kan kobles til patologi, og noen miRNAs viser høy vev og sykdom spesifisitet¹. I kardiovaskulære sykdommer, har miRNAs blitt attraktive kandidater som romanen biomarkers fordi de er bemerkelsesverdig stabil i serum og enkelt kan kvantifiseres ved hjelp av PCR metode³. Den potensielle verdien av miRNAs som biomarkers for hjerteinfarkt er evaluert i små studier, men en validering i store kohorter mangler². For eksempel miR-499 finnes svært uttrykt i hjerteinfarkt muskler, og det har vist seg å være betydelig økt i en AMI^4,5,6. Videre, den regulerer programmert celledød (apoptose) og differensiering av cardiomyocytes og er dermed involvert i flere mekanismer etter en AMI⁷. Bortsett fra noen små studier rapporterer en overlegenhet og inkrementell verdi av miRNAs for diagnostisering av AMI, har det overlegenhet eller likhet til høy følsomhet cardiac troponins ennå ikke påvist i store studier^{2,5 ,6,8}. Flere prospektive studier i store kohorter er derfor nødvendig å vurdere potensielle diagnostiske verdien av miRNAs. Dessuten metodene for miRNA kvantifisering må optimaliseres og standardisert bruker sammenlignbare protokoller⁹. Standardisert analyser kan redusere inkonsekvente resultater og kan hjelpe miRNAs å bli potensielle biomarkers for rutinemessige klinisk program, som biomarkers må kvantifiseres i en reproduserbar måte å sikre sine klinisk anvendelse.

DPCR har nylig blitt introdusert som en end-point analyse. Det partisjoner prøven i ca 20.000 personlige reaksjoner¹⁰. DPCR systemet så benytter en matematisk statistisk Poisson-analyse av fluorescerende signaler (positive og negative reaksjoner), slik at en absolutt kvantifisering uten en standardkurve¹⁰. Når kombinere dPCR med fluorescerende hydrolyse sonder, er den svært spesifikke direkte absolutt kvantifiseringen av miRNAs gjort mulig. Digital polymerasekjedereaksjons har vist å overlegne tekniske egenskaper (inkludert en redusert variasjon, en økt daglige reproduserbarhet, en høy grad av linearitet og en høy følsomhet) for kvantifisering miRNA nivåer i den sirkulasjon sammenlignet med kvantitative sanntid PCR^10,11. Disse overlegne tekniske egenskaper kan bidra til å redusere gjeldende begrensninger på bruk av sirkulerende miRNAs som biomarkers og kan føre til etableringen av miRNAs som biomarkers i store multi-senter hjerte kliniske forsøk og som en diagnostisk metode i generelt. I en tidligere studie, vi nylig brukt dPCR for den absolutte kvantifiseringen av sirkulerende miRNAs hos pasienter med en AMI og kunne vise førsteklasses diagnostiske muligheter sammenlignet kvantifisering av miRNAs av qPCR¹².

I denne publikasjonen ønsker vi å vise at bruker dPCR er en nøyaktig og reproduserbar metode for direkte kvantifisere sirkulerende hjerte miRNAs. Absolutt kvantifiseringen miRNA nivåer i serum, bruke digitale PCR, viser potensial for bruk i store multi-senter hjerte kliniske studier. I denne beskrive vi i detalj hvordan å utføre digitale PCR og oppdage hvor absolutt miRNA kopi i serum.

Protocol

1. utvinning av miRNA fra Plasma/Serum Merk: For å kvantifisere miRNAs riktig, riktig microRNA isolasjon fra plasma/serum er et viktig skritt. En viktig ting å huske på, spesielt fordi forskjellige protokoller finnes, er å følge den samme arbeidsflyten mens prøvene. I denne protokollen, er miRNA Hentet fra 50 µL av serum. Ikke bruk mer enn 200 µL som denne grensen riktig utpakkingen. Forberede serum eller tine frosne prøvene. Legge til 250 µL (5 volumer) kommersie…

Representative Results

Digital PCR kombinert med fluorescerende hydrolyse sonder kan forskere å kvantifisere direkte absolutt mengder bestemte miRNAs i Kopier/µL. Som eksemplet i dPCR er partisjonert i ca 20.000 personlige PCR reaksjoner, dPCR krever ikke teknisk replikerer10. DPCR systemet benytter en matematisk Poisson statistisk analyse av fluorescerende signaler (skiller mellom positive og negative reaksjoner) muliggjør en absolutt kvantifisering uten behovet for en standard kurve…

Discussion

Digital PCR er en relativt ny end-point PCR som tillater direkte absolutt kvantifisering av nukleinsyrer i et utvalg. Metoden har spesielle fordeler, inkludert en redusert variasjon, en økt daglige reproduserbarhet og en overlegen følsomhet^11,12. Videre, på grunn av partisjonering av utvalget i ca 20.000 enkelt reaksjoner og sluttpunktet analyser, dPCR er mer robust til forstyrrende stoffer i PCR sammenlignet med kvantitative RT PCR¹⁶. …

Materials

RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript)  and RPE (called number two in manuscript).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	Kit for microRNA reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in reverse transcription
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 000200
PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96 well plate for reverse transcription
Microseal ‘B’ seal Seals	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	Foil to ensure proper storage
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler used for reverse transcription
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	Supermix used in droplet generation
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe)
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 001352, commercial primers
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Number 000200, commercial primers
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Holds cartridges in droplet generation
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	Oil used in droplet generation
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96 well plate for ddPCR
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	Pierceable foil, compatible with droplet reader
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	Oil used in droplet reading
QX100 or QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	Seals the plate before PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler used for ddPCR
QX100 or QX200 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	Program for droplet reading
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		Program for statistical analysis