Summary
Her beskriver vi en minimal invasiv syngeneic orthotopic transplantasjon modell av musen lunge adenocarcinoma celler som tid - og å redusere kostnaden modell å studere ikke-småcellet lungekreft.
Abstract
Bruk av musen modeller er uunnværlig for å studere i Patofysiologien ved ulike sykdommer. Når det gjelder lungekreft, flere modeller er tilgjengelige, inkludert genetisk konstruert modeller samt transplantasjon modeller. Imidlertid, genmodifisert musen modeller er tidkrevende og kostbare, mens noen orthotopic transplantasjon modeller er vanskelig å gjengi. Her, er en ikke-invasiv intratracheal leveringsmetode av lunge kreftceller som en alternativ orthotopic transplantasjon modell beskrevet. Bruk av mus lunge adenocarcinoma celler og syngeneic pode mottakere kan studere tumorigenesis under tilstedeværelsen av en fullt aktivt immunforsvar. Videre genetisk manipulasjon av svulst cellene før transplantasjon gjør denne modellen en attraktiv tidsbesparende tilnærming for å studere virkningen av genetiske faktorer på tumor vekst og svulst celle genuttrykk profiler under fysiologiske forhold. Med denne modellen, viser vi at lunge adenocarcinoma celler programmert uttrykke økte nivåer av T-celle suppressor død-ligand 1 (PD-L1) når dyrket i sitt naturlige miljø i forhold til dyrking i vitro.
Introduction
Lungekreft er fortsatt den langt største kreft relatert morderen i både menn og kvinner1. Faktisk, ifølge American Cancer Society, hvert år mer mennesker dø av lungekreft enn bryst og prostata kolon kreft sammen1. Inntil nylig ble fleste pasienter som lider av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som er den rikeste undertypen av lungekreft, behandlet med platina-baserte kjemoterapi i en første-linje, med tillegg av angiogenese hemmere2. Bare et delsett av pasienter havner kreftfremkallende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), anaplastisk lymfom kinase (ALK) eller ROS1, og kan behandles med tilgjengelig målretting narkotika3,4. Med ankomsten av immun checkpoint hemmere, har nytt håp for lunge kreftpasienter oppstått, men til nå, bare 20-40% av pasientene svare immun terapi5. Derfor, videre forskning er nødvendig å forbedre dette resultatet ved å finjustere immun checkpoint terapi og undersøker combinatory behandlingstilbud.
For å studere lungekreft, et stort utvalg av prekliniske modeller er tilgjengelige, inkludert spontan modeller utløst av kjemikalier og kreftfremkallende og genmodifiserte musen modeller (GEMM) der autochtonous svulster oppstår etter betinget aktivering av oncogenes og/eller inaktivering av tumor suppressor gener6,7,8. Disse modellene er av spesiell verdi å undersøke grunnleggende prosesser i lunge svulst utvikling, men de krever også omfattende mus avl, og eksperimenter er tidkrevende. Derfor dra mange studier vurdere potensielle hemmere nytte av subkutan (pasient-avledede) xenograft modeller hvor menneskelige lunge kreftcelle linjer er subcutaneously injiseres i immunodeficient mus9.
I disse modellene, er micromilieu av svulster ikke representert tilsvarende; derfor bruke forskere også orthotopic transplantasjon modeller, hvor kreftceller som injiseres intravenøst, intrabronchially eller direkte i lunge parenchyma10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Noen av disse metodene er teknisk utfordrende, vanskelig å reproduseres, og krever intensiv trening av forskerne. 21 her vi tilpasset en ikke-invasiv orthotopic, intratracheal transplantasjon metoden i immunkompetente mus, hvor svulster utvikle innen 3-5 uker og viser betydelige likheter til menneskelig svulster, til induserer uttrykk for T-celle Suppressor programmert død-ligand 1 (PD-L1) på kreftceller. 11 , 12 , 20 bruk av mus kreftceller avledet fra GEMM modeller og syngeneic mottaker mus gir riktig studere svulst microenvironment inkludert immunceller. Gene redigeringsverktøy som CRISPR/Cas9 teknologi22 kan dessuten brukes i vitro før transplantasjon som muliggjør etterforskningen av virkningen av genetiske faktorer i lunge tumorigenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller som beskrevet nedenfor følger etiske retningslinjer og ble godkjent av den østerrikske føderale Ministry of Science, forskning og økonomi.
Merk: Protokollen her beskriver en orthotopic transplantasjon modell av musen lunge adenocarcinoma celler i syngeneic mottakere. Cellene kan isoleres fra svulst rentebærende lungene til KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) mus7,18, hvis tilgjengelig internt og transplantert til mus samme bakgrunn og kjønn. Hvis celler ble gitt fra andre forskningsgrupper og det nøyaktige bakgrunnen forblir ukjent, anbefaler vi bruk av F1 generasjon krysning mellom C57BL/6 og 129S mus som transplantasjon mottakere for å garantere maksimal toleranse.
1. celle forberedelse
- Frø KP cellene 24 timer før transplantasjon på ca 50% confluency i RPMI med 10% fosterets kalv serum (FCS), glutamin, og 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin (heretter referert til som standard kultur medium). Inkuber cellekulturer på 37° C, 5% CO2og rundt 95% relativ fuktighet.
- På den neste dagen, høste celler med 1 mL av trypsin-EDTA (0,05% i fosfat-bufret saltvann [PBS]) i 5 min pr 10 cm plate og deretter resuspend frittliggende celler med 9 mL standard kultur medium.
- Teller cellene i en hemocytometer og overføre antall celler nødvendig for eksperimenter i en 50-mL konisk sentrifuge rør.
Merk: Vi anbefaler transplanting mellom 2,5 x 105 og 1 x 106 KP celler per musen, men dette kan være tilpasset basert på forskerens behov. - Deretter sentrifuge celler for 5 min på 300 x g, Sug opp nedbryting, og bruker en pipette, resuspend cellene på en tetthet av 2 x 107/mL (for innånding av 1 x 106 KP celler per mus) i serum og antibiotika uten RPMI , supplert med 0,01 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
- Holde cellene på is til transplantasjon.
2. Orthotopic transplantasjon via Intratracheal levering
- Sedate mus (8-12 ukens av alderen) av en injeksjon av en blanding av ketamin (100 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (10 mg/kg kroppsvekt).
- Mens anestesi setter, forberede kateter intubasjon. Derfor sløv nålen av et kateter ved å kutte slutten med saks. Etterpå skyve kateter helt over slutten av nålen.
- Bekreft et passende nivå for anestesi pedal refleks via fast tå klemming og ophthalmica salve gjelder øynene.
- Rett musen på intubasjon plattformen (figur 1A) ved å trekke sine øvre fortenner over en Sutur og bekrefte at brystet er loddrett under suture.
- Plass en fiberoptisk kabel mellom forbena å belyse brystet (figur 1B).
- Nøye åpne munnen av musen og trekke ut tungen bruker desinfiseres flat tang. Se etter utslipp av hvitt lys finne strupehode og visualisere epiglottis og arytenoid cartilages (figur 1 c).
- Når åpning av luftrøret er tydelig, skyv kateter inn i luftrøret (figur 1 d). Lengden på kateter settes avhenger alder og størrelsen på dyret, siden det ikke skulle gå under bifurkasjonen garantere en jevn distribusjon av lunge adenocarcinoma celler i lungene. Raskt fjerne nålen fra kateter.
- Riktig plassering av kateter i luftrøret angis med hvitt lys skinner gjennom kateter (figur 1E). For å bekrefte plasseringen av kateter i luftrøret, knytte en 1-mL sprøyte som inneholder vann til kateter. Vannet i sprøyten flyttes raskt opp og ned i henhold til pust (figur 1F).
Merk: Dette trinnet kan utelates av erfarne forskere. - Varme opp cellen suspensjon av holder røret i hånden, og deretter Pipetter 50 µL av suspensjon som inneholder 1 x 106 celler (antall celler kan være variabel) i midten av kateter huben. Suspensjon vil være aspirated umiddelbart. Deretter fest 1 mL sprøyte og dispensere 300 µL av luft å sikre en konsekvent distribusjon i lungene.
- Forsiktig fjerne kateter, fjerne musen fra intubasjon plattformen og sette den på en heten pute til gjenoppretter av bedøvelsen.
3. lunge forberedelse til flowcytometri
- På ønsket eksperimentelle sluttpunktet, sedate musen ved en subcutaneous injeksjon av en blanding av ketamin (100 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) og euthanize det av cervical forvridning.
- Suge carcass i 70% etanol og sikre musen på en disseksjon bord med tape.
- Gjør en ventrale midtlinjen snitt og forsiktig Inverter huden for å avsløre thorax veggen muskler og abdominal organer. Punktering membranen og kuttet ribbeina med saks å avsløre bryst hulrom.
- Perfuse lungene 3 x med 6-8 mL iskald PBS gjennom høyre ventrikkel bruker en 27 G nål etter klipping en liten åpning inne det igjen hjertekammer tillate blod å forlate. Lungene bør fjernes av blod og slå helt hvit.
- Ta ut lungene og hakke lobes i små biter med saks. Overføre lunge bitene til en 2 mL microcentrifuge rør og ruge det i 1,5 mL lunge fordøyelsen bufferen (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL collagenase jeg, og 50 U/mL DNase jeg).
- Inkuber lungene stykker 30-60 minutter på 37 ° C og med konstant risting.
- Overføre lunge celle suspensjon gjennom en 70 µm celle sil i en 50 mL tube. Fjern silen med baksiden av en steril 10 mL sprøyte og skyll silen med 15 mL PBS med 2% FCS.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C og Sug opp nedbryting. Resuspend cellene i 1 mL av ammonium klor kalium (ACK) lysing buffer og ruge dem i 5 minutter ved romtemperatur for lysis av gjenværende erytrocytter.
- Sentrifuge cellene på 300 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend cellene i 1 mL av PBS med 2% FCS og fortsette med de ønskede fargeprotokoll for flyt cytometri23.
Merk: Eventuelt cellene kan være resuspended i RPMI med 30% FCS og 10% DMSO og frosset bruker en frysing beholder for senere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte orthotopic transplantasjon modellen via intratracheal svulst celle levering til å teste om svulsten microenvironment stimulerer PD-L1 uttrykk. Derfor isolerte vi musen lunge AC celler fra autochtonous KP modellen (KP celler), 10 ukene etter svulst induksjon via grobunn-recombinase-uttrykke adenovirus (Ad.Cre) levering24. Senere vi merket lungene AC celler ved hjelp av en grønn fluorescerende protein (GFP)-uttrykke lentivirus25 og orthotopically engrafted dem til immunkompetente, syngeneic mus via intratracheal delivery. For å validere modellen, vi transplantert ulike mengder kreftceller og utført overlevelse analyse. Som forventet, overlevelse av mottakeren mus var korrelert til antall engrafted celler, og den overlevelse tid var mellom 2 uker for mottakerne av 2 x 106 celler og rundt 10 uker for mottakere på 2,5 x 105 celler (figur 2A). Når lungene ble dissekert etter død mus brukes for overlevelse analyse, la vi merke til en jevn distribusjon av svulst knuter gjennom alle lobes av lungene (figur 2B). Om morfologi av tumorer, vi sammenlignet transplantert svulster med autochtonous KRASG12D-drevet svulster7 og gjorde ikke merke noen åpenbare forskjellen (figur 2C).
For å studere PD-L1 uttrykket av transplantert kreftceller, vi euthanized mottaker mus 3 uker etter transplantasjon av 1 x 106 celler og forberedt lungene flyt cytometric analyse. Leter etter PD-L1 uttrykk og gating for GFP+ celler, vi identifisert en betydelig endring i PD-L1+ positive celler i forhold til celler kultivert i vitro (figur 2D). Derfor validert vi denne modellen som en tidsbesparende modell å teste gene expression endringer i tumorceller under fysiologiske forhold, som for eksempel kan brukes til å undersøke virkningene av genetisk forandringer eller farmakologiske behandlinger på PD-L1 uttrykk i lunge AC celler.
Figur 1 : Intratracheal lungetransplantasjon svulst celle. (A) dette panelet viser den hjemmelagde intubasjon plattform polystyren lokk, to 15 mL rør og en 6.0 silke Sutur. (B) fiber optisk ledningen er rettet til brystet av musen og (C) etter forsiktig ut tungen, hvitt lys som slippes ut fra åpningen av luftrøret kan sees. (D og E) riktig plassering av musen er angitt av lys skinner gjennom kateter og kan bli bekreftet (F) av den opp bevegelsen av vann plassert i en 1 mL sprøyte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Morfologi av musen lungene etter den syngeneic, intratracheal transplantasjon av lunge AC celler. (A) dette panelet viser en Kaplan Meier analyse av mottakeren mus etter orthotopic transplantasjon av ulike mengder av kreftceller. Beløpene av kreftceller brukes for intratracheal levering angis iforklaringen. (B) Dette er et representativt bilde av en lunge svulst celle mottaker museklikk. Vist er lungene av en mus som fikk 5 x 105 celler og avdøde 43 dager etter transplantasjon. (C) dette panelet viser en hematoxylin og eosin flekker av lunge delen av autochtonous svulster 10 uker etter Ad.Cre levering (venstre panel) og 6 uker etter orthotopic transplantasjon av 5 x 105 kreftceller (høyre panel), inkludert en høyere forstørrelse av de angitte områdene (nederst). (D) The PD-L1 uttrykket ble målt ved flowcytometri i GFP+ KP celler etter dyrking i vitro under standard betingelser (før transplantasjon, rød) og etter orthotopic transplantasjon og isolert fra mus lungene 3 uker følgende engraftment (etter transplantasjon, blå). Rotte IgG2a PE-Cyanine7 ble brukt som en isotype kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å studere lunge fysiologiske og patologisk hendelser i lungene, er invasive og ikke-invasive intratracheal intubasjon metoder for instillasjon ulike reagenser brukte26,27,28,29 ,30,31,32. I feltet kreft forskere bruker intratracheal (og intranasal) instillasjon grobunn-recombinase-uttrykke virus å innføre somatiske mutasjoner i lunge epitelceller. Administrasjon av en Ad.Cre eller lentivirus kan betinget aktivering av kreftfremkallende K-ras i KRAS-LSL-G12D mus, samtidig med fortrengingen i p53 i transduced celler, når mus er avlet med p53-floxed mus7. Muligheten til å studere lunge tumorigenesis fra tidligste scenen til døden av dyret, samt en høy likhet mellom musen svulster og menneskelige svulster, gjør disse modellene ekstremt populære. Men fra et praktisk synspunkt, denne modellen krever omfattende musen avl å studere ulike genotyper, og i noen genotyper, eksperimenter kan ta opptil ett år fra svulst induksjon til eksperimentelle sluttpunktet. Dette krever økt musen plass, og dermed kostnadene for mus bolig.
Muligheten til å enkelt manipulere kreftceller i vitro ved hjelp av CRISPR-Cas9 teknologi22 gjør orthotopic transplantasjon modeller et hurtig alternativ å studere virkningen av valgte gener tumor vekst og svulst uttrykket profiler. Merking av kreftceller kan brukes for sanntids overvåking av tumor vekst med levende celle imagers eller sortere kreftceller etter merkene. Dette gir også en enkel kvantifisering av kreftceller (dvs. svulst byrden) i henhold til etikettene. Når etablert, er denne leveringsmåten svulst celle svært reproduserbare. Sammenlignet med orthotopic transplantasjon via hale vene levering, kreftceller sendes direkte til naturen i lungene, mens eksponering for blod og komponentene kan endre svulst celleegenskaper. Videre effekten av manipulert gener på svulst celle overlevelse i blodbanen og bloduttredelse til lungene er uklare og kan medføre genotype-avhengige endringer i mengden av cellene levert til lungene.
I modellen beskrevet her, spre svulster symmetrisk gjennom lungene. Dette gjør at egen fangst og analyse av ulike lesjoner, for eksempel en lobe kan utsettes for flyt cytometri analyse som beskrevet ovenfor, mens en annen flik kan brukes for immunohistochemical analyse, lunge lysate forberedelser, etc. Voksende svulster resultatet i døden av mottakeren musen innenfor 3-10 uker etter intratracheal levering, avhengig av antall celler brukes. Dette gjør forskeren å tilpasse antall transplantert celler til individuelle behov, og mindre cellen tallene tillate lengre tumor vekst og svulst celle eksponering for microenvironment. På den annen side, kan mange cellen være ønsket for farmakologisk studier for å forkorte perioden med narkotika-leveranser.
Når etablert, er intratracheal administrasjonen av kreftceller svært reproduserbare. Men må noen kritiske punkter vurderes når du utfører denne fremgangsmåten. Først bør være forsiktig å unngå skade på vev når fortrenge tungen med tang og, spesielt når kateter settes. For plasseringen av kateter er det viktig at forskeren kan tydelig se hvitt lys å finne åpningen av trachea. Likevel, ved en feil, kateter kan lett settes inn i juxtaposed spiserøret. Derfor anbefaler vi alltid ser etter den riktige plasseringen av kateter i luftrøret som beskrevet ovenfor. Det er også viktig å unngå å plassere kateter til dypt (dvs. kateter må ikke plasseres under bronchial bifurkasjonen). Dette garanterer en jevn distribusjon av lungekreft cellene og dermed svulster i lungene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Safia Zahma for hennes hjelp med utarbeidelse av vev.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma--characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
