Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

पीडी-L1 एक्सप्रेशन का अध्ययन करने के लिए Syngeneic लंग ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं का Orthotopic ट्रांसप्लांटेशन

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58101
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 1,2
1Department of Physiology, Center of Physiology and Pharmacology & Comprehensive Cancer Center (CCC), Medical University of Vienna, 2Ludwig Boltzmann Institute for Cancer Research (LBI-CR)

Summary

यहाँ हम एक समय के रूप में माउस फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं की एक न्यूनतम इनवेसिव syngeneic orthotopic ट्रांसप्लांटेशन मॉडल का वर्णन और लागत को कम करने के लिए गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर का अध्ययन मॉडल.

Abstract

माउस मॉडलों का उपयोग विभिन्न रोगों के pathophysiology के अध्ययन के लिए अपरिहार्य है । फेफड़ों के कैंसर के संबंध में, कई मॉडल आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्यारोपण मॉडल सहित उपलब्ध हैं । हालांकि, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल समय लेने वाली और महंगी हैं, जबकि कुछ orthotopic ट्रांसप्लांटेशन मॉडल को पुन: पेश करने के लिए मुश्किल हैं । यहां, एक वैकल्पिक orthotopic प्रत्यारोपण मॉडल के रूप में फेफड़ों के ट्यूमर कोशिकाओं के एक गैर इनवेसिव intratracheal वितरण पद्धति का वर्णन किया गया है । माउस फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं और syngeneic भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं का उपयोग एक पूरी तरह से सक्रिय प्रतिरक्षा प्रणाली की उपस्थिति के तहत tumorigenesis का अध्ययन करने की अनुमति देता है । इसके अलावा, प्रत्यारोपण से पहले ट्यूमर कोशिकाओं के आनुवंशिक जोड़तोड़ इस मॉडल बनाता है एक आकर्षक समय की बचत दृष्टिकोण शारीरिक स्थितियों के तहत ट्यूमर विकास और ट्यूमर सेल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर आनुवंशिक कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए । इस मॉडल का प्रयोग, हम बताते है कि फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं टी सेल दमन क्रमादेशित मौत के स्तर में वृद्धि-ligand 1 (पीडी-L1) जब उनके प्राकृतिक पर्यावरण में हो के रूप में खेती की तुलना में इन विट्रो ।

Introduction

फेफड़ों के कैंसर अब तक का सबसे बड़ा कैंसर दोनों पुरुषों और महिलाओं में1से संबंधित हत्यारा है । दरअसल, अमेरिकन कैंसर सोसायटी के अनुसार, हर साल अधिक लोग स्तन, प्रोस्टेट की तुलना में फेफड़ों के कैंसर से मर जाते हैं, और एक साथ पेट के कैंसर1। हाल ही में जब तक, गैर से पीड़ित रोगियों के बहुमत छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC), जो फेफड़ों के कैंसर का सबसे प्रचुर मात्रा में उपप्रकार है, प्लेटिनम के साथ इलाज किया गया एक पहली लाइन की स्थापना में कीमोथेरेपी आधारित, ज्यादातर angiogenesis के अलावा के साथ अवरोधों2. रोगियों का केवल एक सबसेट एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर में oncogenic उत्परिवर्तनों बंदरगाह (EGFR), anaplastic लिंफोमा कळेनासे में (ALK), या ROS1 में, और उपलब्ध लक्ष्यीकरण दवाओं के साथ इलाज किया जा सकता3,4. प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों के आगमन के साथ, फेफड़ों के कैंसर के रोगियों के लिए नई आशा पैदा हुई है, हालांकि अब तक, केवल 20-रोगियों के 40% प्रतिरक्षा चिकित्सा का जवाब5. इसलिए, आगे अनुसंधान ठीक ट्यूनिंग प्रतिरक्षा चौकी थेरेपी और combinatory उपचार के विकल्प की जांच द्वारा इस परिणाम में सुधार करने के लिए आवश्यक है ।

फेफड़ों के कैंसर का अध्ययन करने के लिए, नैदानिक मॉडल की एक विशाल सरणी सहज रसायनों और कैंसर और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMM) द्वारा ट्रिगर मॉडल सहित उपलब्ध हैं, जहां autochthonous ट्यूमर के सशर्त सक्रियण के बाद पैदा oncogenes और/या ट्यूमर शमन करनेवाला जीन6,7,8की निष्क्रियता । ये मॉडल फेफड़ों के ट्यूमर के विकास में मौलिक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए विशेष मूल्य के हैं, लेकिन वे भी व्यापक चूहों प्रजनन की आवश्यकता होती है, और प्रयोगों समय लेने वाले हैं. इसलिए, कई संभावित अवरोधकों का मूल्यांकन अध्ययन के चमड़े के नीचे (रोगी व्युत्पंन) xenograft मॉडल का लाभ ले जहां मानव फेफड़ों के कैंसर कोशिका लाइनों के चमड़े के नीचे immunodeficient9चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं ।

इन मॉडलों में, ट्यूमर के micromilieu के अनुसार प्रतिनिधित्व नहीं है; इसलिए, शोधकर्ताओं ने भी orthotopic ट्रांसप्लांटेशन मॉडल का उपयोग करें, जहां ट्यूमर कोशिकाओं नसों में इंजेक्ट कर रहे हैं, intrabronchially, या सीधे फेफड़ों में पैरेन्काइमा10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. इन तरीकों में से कुछ तकनीकी रूप से, चुनौतीपूर्ण मुश्किल reproduced हो रहे हैं, और शोधकर्ताओं के गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता है । 21 यहां हम एक गैर इनवेसिव orthotopic, असुरक्षित चूहों, जहां ट्यूमर 3-5 सप्ताह के भीतर विकसित करने और मानव ट्यूमर के लिए महत्वपूर्ण समानताएं प्रदर्शित करने में intratracheal ट्रांसप्लांटेशन विधि अनुकूलित, टी सेल की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित दमन क्रमादेशित मौत-ligand 1 (पीडी-L1) ट्यूमर कोशिकाओं पर । 11 , 12 , 20 माउस ट्यूमर कोशिकाओं GEMM मॉडल और syngeneic प्राप्तकर्ता चूहों से व्युत्पंन का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित ट्यूमर microenvironment के समुचित अध्ययन की अनुमति देता है । इसके अलावा, CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी22 की तरह जीन संपादन उपकरण प्रत्यारोपण से पहले इन विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है जो फेफड़ों tumorigenesis में आनुवंशिक कारकों के प्रभाव की जांच की सुविधा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के रूप में नीचे उल्लिखित नैतिक दिशा निर्देशों का पालन करें और ऑस्ट्रिया के संघीय विज्ञान, अनुसंधान और अर्थव्यवस्था के मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

नोट: यहां प्रोटोकॉल syngeneic प्राप्तकर्ताओं में माउस फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं के एक orthotopic ट्रांसप्लांटेशन मॉडल का वर्णन है । कोशिकाओं Kras LSL के ट्यूमर असर फेफड़ों से अलग किया जा सकता है-G12D:p ५३fl/fl (केपी) चूहों7,18, अगर घर में उपलब्ध है, और एक ही पृष्ठभूमि और सेक्स के चूहों में प्रत्यारोपित. यदि कोशिकाओं को अंय अनुसंधान समूहों से प्रदान की गई और सटीक पृष्ठभूमि अज्ञात रहता है, हम C57BL/6 और 129S चूहों के बीच एक क्रॉस की F1 पीढ़ी के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के रूप में अधिक से अधिक सहिष्णुता की गारंटी के उपयोग की सिफारिश ।

1. सेल की तैयारी

  1. बीज केपी कोशिकाओं को प्रत्यारोपण से पहले 24 ज RPMI में लगभग ५०% प्रवाह में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), glutamine, और १०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० μg/एमएल streptomycin के साथ पूरक (इसके बाद मानक संस्कृति माध्यम के रूप में संदर्भित) । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2, और लगभग ९५% सापेक्षिक आर्द्रता पर सेल संस्कृतियों की मशीन ।
  2. अगले दिन, फसल कोशिकाओं 10 सेमी प्लेट प्रति 5 मिनट के लिए trypsin-EDTA (फास्फेट में ०.०५%-बफर खारा [पंजाब]) के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर, बाद में, मानक संस्कृति मध्यम के 9 मिलीलीटर के साथ अलग कोशिकाओं को पुनः निलंबित ।
  3. एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणना और एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में प्रयोगों के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या हस्तांतरण ।
    नोट: हम प्रति माउस २.५ x 105 और 1 x 106 केपी कोशिकाओं के बीच प्रत्यारोपण की सिफारिश, लेकिन यह शोधकर्ता की जरूरत के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है ।
  4. बाद में, ३०० x gपर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant, और, एक पिपेट का उपयोग कर, कोशिकाओं के 2 x 107/mL की एक घनत्व पर resuspend (1 एक्स 106 केपी कोशिकाओं के प्रति माउस की साँस लेना के लिए) सीरम और एंटीबायोटिक में मुक्त RPMI , ०.०१ मीटर ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ पूरक ।
  5. प्रत्यारोपण तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।

2. Intratracheal डिलिवरी के जरिए Orthotopic ट्रांसप्लांटेशन

  1. एक चूहा (उंर के 8-12 सप्ताह) ketamine के एक मिश्रण के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा बेहोश (१०० मिलीग्राम/शरीर के वजन का किलोग्राम) और xylazine (10 मिलीग्राम/
  2. संज्ञाहरण में सेट करते हैं, इंटुबैषेण के लिए कैथेटर तैयार करते हैं । इसलिए, बस कैंची के साथ अंत काटने के द्वारा एक कैथेटर की सुई कुंद । इसके बाद, सुई के अंत में पूरी तरह से कैथेटर धक्का ।
  3. फर्म पैर की अंगुली चुटकी के माध्यम से पलटा पेडल द्वारा संज्ञाहरण के उचित स्तर की पुष्टि करें और आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं ।
  4. इंटुबैषेण प्लेटफार्म पर माउस को ठीक करें (1a आंकड़ा) एक सीवन पर अपने ऊपरी कृन्तक hooking द्वारा और पुष्टि करें कि छाती सीवन के नीचे खड़ी है ।
  5. छाती (आंकड़ा 1b) रोशन करने के लिए सामने पैरों के बीच में एक फाइबर ऑप्टिक केबल रखें ।
  6. ध्यान से माउस के मुंह खोलने के लिए और बाहर संक्रमित सपाट संदंश का उपयोग कर जीभ खींचो । गला का पता लगाने और उपकंठ और arytenoid उपास्थि (चित्रा 1C) कल्पना करने के लिए सफेद प्रकाश के उत्सर्जन के लिए देखो ।
  7. एक बार श्वासनली के उद्घाटन स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है, धीरे श्वासनली (चित्रा 1 डी) में कैथेटर स्लाइड । डाला जा करने के लिए कैथेटर की लंबाई जानवर की उम्र और आकार पर निर्भर करता है, क्योंकि यह फेफड़ों के भीतर फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं की एक भी वितरण गारंटी करने के लिए विभाजन नीचे जाना नहीं चाहिए । जल्दी से कैथेटर से सुई निकालें ।
  8. श्वासनली में कैथेटर की उचित नियुक्ति कैथेटर (चित्रा 1E) के माध्यम से सफेद प्रकाश चमक द्वारा संकेत दिया है । आदेश में श्वासनली में कैथेटर की नियुक्ति की पुष्टि करने के लिए, एक 1-एमएल कैथेटर के लिए पानी युक्त सिरिंज संलग्न । सिरिंज में पानी तेजी से ऊपर और नीचे की ओर श्वास (फिगर 1F) के हिसाब से आगे बढ़ेगा ।
    नोट: यह कदम अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा छोड़ा जा सकता है ।
  9. हाथ में ट्यूब पकड़ कर सेल निलंबन गर्म और बाद में, पिपेट ५० µ एल निलंबन के 1 x 106 कोशिकाओं (कोशिकाओं की संख्या चर हो सकता है) कैथेटर हब के केंद्र में शामिल है । निलंबन की aspirated तुरंत की जाएगी । बाद में, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज संलग्न और हवा के ३०० µ एल तिरस्कृत करने के लिए फेफड़ों के भीतर एक सुसंगत वितरण आश्वासन देता हूं ।
  10. धीरे कैथेटर निकालें, इंटुबैषेण मंच से माउस को हटाने, और यह संज्ञाहरण से ठीक हो जाती है जब तक एक गर्मी पैड पर डाल दिया ।

3. प्रवाह Cytometry के लिए फेफड़ों की तैयारी

  1. वांछित प्रायोगिक समापन बिंदु पर, ketamine का एक मिश्रण के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा माउस को बेहोश (१०० मिलीग्राम/शरीर के वजन का किलोग्राम) और xylazine (10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और euthanize यह ग्रीवा विस्थापन द्वारा ।
  2. ७०% इथेनॉल में लोथ सोख और एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस सुरक्षित टेप का उपयोग कर ।
  3. एक ventral midline चीरा बनाओ और धीरे से वक्ष दीवार की मांसपेशियों और उदर अंगों को बेनकाब करने के लिए त्वचा पलटना । डायाफ्राम पंचर और वक्ष गुहा को बेनकाब करने के लिए कैंची के साथ पसलियों में कटौती ।
  4. सही निलय के माध्यम से बर्फ ठंडे पंजाबियों के 6-8 मिलीलीटर के साथ Perfuse फेफड़ों 3x छोड़ निलय में एक छोटे से खोलने के काटने के बाद एक 27 जी सुई का उपयोग करने के लिए रक्त छोड़ने के लिए अनुमति देते हैं । फेफड़ों के खून की मंजूरी दे दी है और पूरी तरह से सफेद बारी चाहिए ।
  5. फेफड़ों बाहर ले लो और कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में पालियों कीमा । एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए फेफड़ों के टुकड़े हस्तांतरण और फेफड़ों पाचन बफर की १.५ मिलीलीटर में यह मशीन (RPMI, 5% FCS, १५० u/एमएल collagenase मैं, और ५० यू/एमएल DNase मैं) ।
  6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर और लगातार मिलाते के साथ फेफड़ों के टुकड़े 30-60 मिनट मशीन ।
  7. एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में फेफड़ों के सेल निलंबन स्थानांतरण । एक बाँझ 10 मिलीलीटर सिरिंज के पीछे के साथ छलनी साफ और 2% FCS के साथ पंजाब के 15 मिलीलीटर के साथ छलनी कुल्ला ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant । अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम (ले) lysing बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनः निलंबित और अवशिष्ट एरिथ्रोसाइट्स के lysis के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए उन्हें गर्मी ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और 2% FCS के साथ पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और प्रवाह cytometry23के लिए वांछित दाग प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को 30% FCS और 10% DMSO और जमे हुए बाद में विश्लेषण के लिए एक ठंड कंटेनर का उपयोग कर RPMI युक्त में resuspend किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हम ट्यूमर microenvironment पीडी-L1 अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है कि क्या परीक्षण करने के लिए intratracheal ट्यूमर सेल डिलीवरी के माध्यम से orthotopic प्रत्यारोपण मॉडल का इस्तेमाल किया । इसलिए, हम autochthonous केपी मॉडल (केपी सेल), 10 सप्ताह Cre-recombinase-व्यक्त एडीनोवायरस (Ad. Cre) डिलिवरी24के माध्यम से ट्यूमर प्रेरण निंनलिखित से माउस फेफड़ों एसी कोशिकाओं अलग । बाद में, हम एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर फेफड़े एसी कोशिकाओं लेबल (GFP)-lentivirus25 और orthotopically engrafted असुरक्षित, syngeneic वितरण के माध्यम से चूहों में उंहें, व्यक्त करने का प्रयोग । मॉडल को मांय करने के लिए, हम ट्यूमर कोशिकाओं के विभिंन मात्रा में प्रत्यारोपित और अस्तित्व विश्लेषण प्रदर्शन किया । उम्मीद के अनुसार, प्राप्तकर्ता चूहों के अस्तित्व engrafted कोशिकाओं की संख्या के लिए संबंधित था, और अस्तित्व के समय 2 x 106 कोशिकाओं के प्राप्तकर्ताओं के लिए 2 सप्ताह के बीच और २.५ x 105 कोशिकाओं (चित्रा 2a) के प्राप्तकर्ताओं के लिए लगभग 10 सप्ताह के बीच था. जब फेफड़ों अस्तित्व विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया चूहों की मौत के बाद विच्छेदित किया गया, हम फेफड़ों के सभी पालियों में ट्यूमर पिंड का एक भी वितरण देखा (चित्रा बी b). ट्यूमर की आकृति विज्ञान के बारे में, हम autochthonous KRASG12D-चालित ट्यूमर7 के साथ ट्यूमर प्रत्यारोपण की तुलना में और किसी भी स्पष्ट अंतर (चित्रा 2c) ध्यान नहीं दिया ।

प्रत्यारोपण ट्यूमर कोशिकाओं की पीडी-L1 अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, हम euthanized प्राप्तकर्ता चूहों 3 सप्ताह के प्रत्यारोपण के बाद 1 एक्स 106 कोशिकाओं और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए फेफड़ों तैयार. GFP+ कोशिकाओं के लिए पीडी-L1 अभिव्यक्ति और गेटिंग के लिए जांच, हम में एक महत्वपूर्ण बदलाव की पहचान पीडी-L1+ सकारात्मक कोशिकाओं के रूप में इन विट्रो में प्रसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में (चित्रा 2d). इसलिए, हम एक समय के रूप में इस मॉडल की पुष्टि मॉडल को शारीरिक स्थितियों के तहत ट्यूमर कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के लिए परीक्षण करने के लिए, जो, उदाहरण के लिए, पीडी पर आनुवंशिक परिवर्तन या औषधीय उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-L1 फेफड़ों एसी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति ।

Figure 1
चित्रा 1 : Intratracheal फेफड़ों के ट्यूमर कोशिका प्रत्यारोपण । (क) यह पैनल घर निर्मित इंटुबैषेण एक polystyrene ढक्कन, २ १५ मिलीलीटर ट्यूबों, और एक ६.० रेशम सीवन का उपयोग कर मंच से पता चलता है । (ख) फाइबर ऑप्टिक वायर माउस की छाती को निर्देशित किया है और (ग) धीरे जीभ बाहर खींच के बाद, सफेद श्वासनली के उद्घाटन से उत्सर्जित प्रकाश देखा जा सकता है । (डी और ई) माउस की उचित नियुक्ति कैथेटर के माध्यम से प्रकाश चमक द्वारा संकेत दिया है और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में रखा ऊपर और नीचे पानी की आवाजाही से (एफ) सत्यापित किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : syngeneic, फेफड़ों एसी कोशिकाओं के intratracheal प्रत्यारोपण के बाद माउस फेफड़ों की आकृति विज्ञान । (क) यह पैनल ट्यूमर कोशिकाओं के विभिन्न मात्रा के orthotopic प्रत्यारोपण के बाद प्राप्तकर्ता चूहों के एक कापलान Meier विश्लेषण से पता चलता है. intratracheal वितरण के लिए उपयोग की जाने वाली ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा लेजेंड में दर्शाई गई है। (ख) यह एक ट्यूमर-सेल प्राप्तकर्ता माउस के एक फेफड़ों के एक प्रतिनिधि चित्र है । दिखाया एक चूहा है कि 5 x 105 कोशिकाओं और मृतक ४३ दिन प्रत्यारोपण के बाद प्राप्त की फेफड़ों है । (ग) इस पैनल के एक hematoxylin और autochthonous ट्यूमर के फेफड़े अनुभाग के eosin दाग 10 सप्ताह निंनलिखित विज्ञापन से पता चलता है । Cre वितरण (बाएं पैनल) और 6 5 x 105 ट्यूमर कोशिकाओं के orthotopic प्रत्यारोपण के बाद सप्ताह (दायां पैनल), जिसमें इंगित क्षेत्रों (नीचे) का उच्चतर आवर्धन शामिल है । (घ) पीडी-L1 अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry द्वारा GFP+ केपी कोशिकाओं में मापा गया था खेती निम्नलिखित मानक शर्तों के तहत इन विट्रो में (प्रत्यारोपण से पहले, लाल) और orthotopic प्रत्यारोपण और माउस फेफड़ों से अलगाव के बाद 3 सप्ताह निंनलिखित engraftment (प्रत्यारोपण के बाद, नीला) । मूषक IgG2a PE-Cyanine7 का प्रयोग isotype नियंत्रण के रूप में किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

फेफड़ों में शारीरिक और रोग की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न रिएजेंट के जगाकर के लिए आक्रामक और गैर इनवेसिव intratracheal इंटुबैषेण तरीकों व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं26,27,28,29 ,30,31,३२. कैंसर के क्षेत्र में, शोधकर्ताओं intratracheal (और intranasal) Cre-recombinase-एक्सप्रेस वायरस के जगाकर फेफड़ों उपकला कोशिकाओं में दैहिक उत्परिवर्तनों परिचय का उपयोग करें । एक विज्ञापन के प्रशासन. Cre या lentivirus oncogenic K के सशर्त सक्रियण KRAS-LSL-G12D चूहों में रास की अनुमति देता है, concomitantly कोशिकाओं में p53 के नॉकआउट के साथ transduced, जब चूहों p53-floxed चूहों के साथ पैदा कर रहे हैं7. संभावना पशु की मौत तक जल्द से जल्दी मंच से फेफड़े tumorigenesis अध्ययन करने के लिए, साथ ही माउस ट्यूमर और मानव ट्यूमर के बीच एक उच्च समानता, इन मॉडलों को बेहद लोकप्रिय बनाता है । हालांकि, देखने की एक व्यावहारिक दृष्टि से, इस मॉडल व्यापक माउस को विभिंन पादी अध्ययन प्रजनन की आवश्यकता है, और कुछ पादी में, प्रयोगों के ट्यूमर प्रेरण से एक साल तक प्रायोगिक समापन बिंदु तक लग सकता है । यह माउस के स्थान में वृद्धि की आवश्यकता है, इसलिए, माउस आवास के लिए लागत ।

इस संभावना को आसानी से इन विट्रो में ट्यूमर कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके22 orthotopic ट्रांसप्लांटेशन मॉडल ट्यूमर विकास और ट्यूमर अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर चयनित जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक त्वरित विकल्प बनाता है । ट्यूमर कोशिकाओं की टैगिंग लाइव सेल imagers का उपयोग ट्यूमर के विकास की वास्तविक समय की निगरानी के लिए या उनके टैग के अनुसार ट्यूमर कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह भी ट्यूमर कोशिकाओं के एक आसान ठहराव के लिए अनुमति देता है (यानी, ट्यूमर बोझ) उनके लेबल के अनुसार । एक बार स्थापित, ट्यूमर सेल प्रसव के इस विधि अत्यधिक reproducible है । पूंछ नस वितरण के माध्यम से orthotopic ट्रांसप्लांटेशन की तुलना में, ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे फेफड़ों में उनके प्राकृतिक वातावरण के लिए दिया जाता है, जबकि रक्त और उसके घटकों के लिए जोखिम ट्यूमर कोशिका संपत्तियों को बदल सकता है । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिका के अस्तित्व पर खून और फेफड़ों के लिए extravasation में हेरफेर जीन के प्रभाव स्पष्ट नहीं है और फेफड़ों को दिया कोशिकाओं की मात्रा में जीनोटाइप निर्भर परिवर्तन में परिणाम हो सकता है ।

यहां वर्णित मॉडल में, ट्यूमर फेफड़ों भर में सममित फैल गया । यह विभिन्न घावों के अलग संचयन और विश्लेषण की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, एक पालि में ऊपर वर्णित cytometry विश्लेषण प्रवाहित किया जा सकता है, जबकि एक अन्य पालि में immunohistochemical विश्लेषण, फेफड़े lysate तैयारी आदि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बढ़ ट्यूमर 3-10 सप्ताह के भीतर प्राप्तकर्ता माउस की मृत्यु में परिणाम intratracheal वितरण के बाद, इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर है । यह शोधकर्ता व्यक्तिगत जरूरतों के लिए प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या को अनुकूलित करने के लिए अनुमति देता है, और छोटे सेल संख्या microenvironment के लिए अब ट्यूमर विकास और ट्यूमर सेल जोखिम की अनुमति देते हैं । दूसरी ओर, एक उच्च कोशिका संख्या औषधीय अध्ययन के लिए वांछित हो सकता है दवा वितरण की अवधि को कम ।

एक बार स्थापित, ट्यूमर कोशिकाओं के intratracheal प्रशासन अत्यधिक reproducible है । हालांकि, इस कार्यविधि को निष्पादित करते समय कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार किया जा करने के लिए है । सबसे पहले, सावधानी ऊतक क्षति से बचने के लिए जब संदंश के साथ जीभ को रखने और, विशेष रूप से, जब कैथेटर डाला है लिया जाना चाहिए । कैथेटर की नियुक्ति के लिए, यह शोधकर्ता श्वासनली के उद्घाटन का पता लगाने के लिए सफेद प्रकाश स्पष्ट रूप से देख सकते हैं कि आवश्यक है । फिर भी, गलती से, कैथेटर झकझोरता घेघा में आसानी से डाला जा सकता है । इसलिए, हम हमेशा श्वासनली में कैथेटर के सही स्थान के लिए जांच की सिफारिश के रूप में ऊपर वर्णित है । यह भी गहरी कैथेटर रखने से बचने के लिए आवश्यक है (यानी, कैथेटर विभाजन के नीचे नहीं रखा जाना चाहिए) । यह फेफड़ों की कोशिकाओं के एक भी वितरण की गारंटी देता है और, इसलिए, फेफड़ों भर में ट्यूमर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ऊतक वर्गों की तैयारी के साथ उसकी मदद के लिए साफिया Zahma शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line isolated in house
C57Bl/6 mice F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium Life Technologies 11544446
Fetal Calf Serum Life Technologies 11573397
Penicillin/Streptomycin Solution Life Technologies 11548876
L-Glutamine Life Technologies 11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA Life Technologies 11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine) Ogris Pharma 8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine) Ogris Pharma 8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN) BD 381223
Blunt forceps Roboz RS8260
Leica CLS150 LED Leica 30250004 Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors Fine Science Tools 91460-11
DNase I (RNase-Free) New England Biolabs M0303S
Collagenase Type I Life Technologies 17100017
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 eBioscience 25-4321-82

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
  3. Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
  4. Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
  5. Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
  6. Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
  7. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  8. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
  9. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  10. Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
  11. Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
  12. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
  13. Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
  14. Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
  15. Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma--characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
  16. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  17. Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
  18. Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
  19. Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
  20. Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
  21. Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
  22. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  23. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
  24. Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
  25. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
  26. Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
  27. Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
  28. Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
  29. Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
  30. Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
  31. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  32. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक १४३ गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर orthotopic ट्रांसप्लांटेशन मिनिमली इनवेसिव syngeneic पीडी-L1 intratracheal वितरण
पीडी-L1 एक्सप्रेशन का अध्ययन करने के लिए Syngeneic लंग ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं का Orthotopic ट्रांसप्लांटेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moll, H. P., Mohrherr, J.,… More

Moll, H. P., Mohrherr, J., Breitenecker, K., Haber, M., Voronin, V., Casanova, E. Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression. J. Vis. Exp. (143), e58101, doi:10.3791/58101 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter