Summary
Här beskriver vi en minimalinvasiv syngena ortotop transplantation modell mus lunga adenokarcinom celler som tid - och kostnadsbesparande modell att studera icke-småcellig lungcancer.
Abstract
Användningen av musmodeller är oumbärlig för att studera patofysiologin av olika sjukdomar. När det gäller lungcancer, flera modeller finns tillgängliga, inklusive genetiskt modifierade modeller samt transplantation modeller. Genetiskt modifierade musmodeller är dock tidskrävande och dyrt, medan vissa ortotop transplantation modeller är svårt att reproducera. Här är en icke-invasiv intratrakeal leveransmetod lung tumörceller som en alternativ ortotop transplantation modell beskrivs. Användningen av musen lunga adenokarcinom celler och syngena transplantat mottagare kan studera uppkomst under närvaro av en fullt aktiv immunförsvar. Dessutom genetiska manipulationer av tumör celler före transplantation gör denna modell en attraktiv tidsbesparande metod att studera inverkan av genetiska faktorer på tumörtillväxt och tumör cell genuttryck profiler under fysiologiska betingelser. Med denna modell, vi visar det lungan adenocarcinom celler programmerad express ökade nivåer av den T-cell UNDERTRYCKARE död-ligand 1 (PD-L1) när den odlas i deras naturliga miljö jämfört med odling in vitro.
Introduction
Lungcancer är fortfarande den överlägset den största cancerrelaterade dödsorsaken i både män och kvinnor1. Faktiskt, enligt American Cancer Society, varje år fler människor dör av lungcancer än bröst-, prostata och kolon cancer grupp1. Tills nyligen har behandlades flesta patienter som lider av icke-småcellig lungcancer (NSCLC), som är den vanligast förekommande subtypen av lungcancer, med platinabaserad kemoterapi i en första linjens miljö, mestadels med tillägg av angiogenes hämmare2. Endast en delmängd av patienter hamnar onkogena mutationer i den epidermal tillväxtfaktor (EGFR), anaplastiskt lymfomkinas (ALK) eller ROS1, och kan behandlas med tillgängliga inriktning narkotika3,4. Med tillkomsten av immun checkpoint-hämmare, har nytt hopp för lungcancerpatienter uppstått, även om förrän nu, bara 20 – 40% av patienterna svarar på immun terapi5. Därmed ytterligare krävs forskning för att förbättra detta resultat genom finjustering immun checkpoint terapi och undersöker combinatory behandlingsalternativ.
För att studera lungcancer, en mängd olika prekliniska modeller finns tillgängliga, inklusive spontana modeller utlöses av kemikalier och cancerframkallande ämnen och genmodifierade mus modeller (GEMM) där autoktont tumörer uppstår efter villkorlig aktivering av onkogener och/eller inaktivering av tumör suppressor gener6,7,8. Dessa modeller är särskilt värdefullt att undersöka grundläggande processer i lungan tumörutveckling, men de kräver också omfattande möss avel och experiment är tidskrävande. Därför, många studier utvärdera potentiella inhibitorer utnyttja subkutan (patientderiverade) xenograft-modeller där mänskliga lung cancer cell linjer subkutant injiceras i nedsatt immunförsvar möss9.
Dessa modeller, är micromilieu av tumörer inte representerad med detta; Därför använder forskare också ortotop transplantation modeller, där tumörceller injiceras intravenöst, intrabronchially eller direkt i lungan parenkymet10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Några av dessa metoder är tekniskt utmanande, svårt att reproduceras och kräver intensiv träning av forskarna. 21 här vi anpassat en icke-invasiv ortotop, intratrakeal transplantation metod hos immunkompetenta möss, där tumörer utvecklas inom 3-5 veckor och uppvisar betydande likheter med mänskliga tumörer, att framkalla uttryck för T-cellen suppressor programmerad död-ligand 1 (PD-L1) på tumörceller. 11 , 12 , 20 användning av musen tumörceller härrör från GEMM modeller och syngena mottagarens möss tillåter ordentlig studera den tumör mikromiljö inklusive immunceller. Gen redigeringsverktyg som CRISPR/Cas9-teknik22 kan dessutom användas in vitro före transplantation som underlättar utredningen av inverkan av genetiska faktorer i lungan uppkomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella protokoll som beskrivs nedan följa etiska riktlinjer och godkändes av den österrikiska federala ministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi.
Obs: Protokollet här beskriver en ortotop transplantation modell mus lunga adenokarcinom celler in syngena mottagare. Celler kan isoleras från tumör-bärande lungorna av KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) möss7,18, om tillgängliga interna och transplanterade in möss av samma bakgrund och kön. Om celler tillhandahölls från andra forskargrupper och exakta bakgrunden förblir okänd, rekommenderar vi användning av F1-generationen av en korsning mellan C57BL/6 och 129S möss som mottagare för att garantera maximal tolerans.
1. cell förberedelse
- Utsäde KP celler 24 h före transplantation på cirka 50% konfluens i RPMI kompletteras med 10% fetalt kalvserum (FCS), glutamin, och 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin (hädanefter benämnd standard odlingsmedium). Inkubera cellkulturer vid 37° C, 5% CO2och cirka 95% relativ luftfuktighet.
- Nästa dag, skörda celler med 1 mL av trypsin-EDTA (0,05% fosfatbuffrad saltlösning [PBS]) för 5 min per 10 cm platta och därefter blandas friliggande celler med 9 mL standard odlingsmedium.
- Räkna cellerna i en hemocytometer och överföra antalet celler behövs för experiment i en 50 mL konisk centrifugrör.
Obs: Vi rekommenderar att transplantera mellan 2,5 x 105 och 1 x 106 KP celler per mus, men detta kan anpassas utifrån forskarens behov. - Därefter, Centrifugera cellerna för 5 min vid 300 x gAspirera supernatanten och, med pipett Omsuspendera cellerna på en densitet på 2 x 107/ml (för inandning av 1 x 106 KP celler per mus) i serum och antibiotika-fri RPMI , kompletterat med 0,01 M etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).
- Håll cellerna på is till transplantation.
2. ortotop Transplantation via intratrakeal leverans
- Lugna en mus (8-12 veckors ålder) som en subkutan injektion av en blandning av ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (10 mg/kg kroppsvikt).
- Medan anestesi sätter in, förbereda katetern för intubation. Därför, trubbig nål en kateter genom att helt enkelt skära slutet med sax. Efteråt, Skjut katetern helt över avsluta av nålen.
- Bekräfta den lämpliga nivån på anestesi av pedal reflex via nyper fast tå och tillämpa oftalmologiska salva till ögonen.
- Fixa musen på intubation plattformen (figur 1A) som ansluter dess övre framtänderna över en sutur och bekräfta att bröstet är vertikala under suturen.
- Placera en fiberoptisk kabel mellan frambenen att belysa bröstet (figur 1B).
- Försiktigt öppna munnen i musen och dra ut tungan använder desinfekterade platt peang. Leta efter utsläpp av vitt ljus att lokalisera struphuvudet och visualisera de struplocket och arytenoid brosk (figur 1 c).
- När öppnandet av luftstrupen är klart synliga, Skjut försiktigt katetern i luftstrupen (figur 1 d). Längden på katetern sätts beror på ålder och storlek på djuret, eftersom det inte bör gå nedanför bifurkation att garantera en jämn fördelning av lungan adenocarcinom celler i lungan. Snabbt ta bort nålen från katetern.
- Korrekt placering av katetern i luftstrupen indikeras av det vita ljuset som skiner igenom katetern (figur 1E). För att bekräfta placeringen av katetern i luftstrupen, bifoga en 1 mL spruta innehåller vatten till katetern. Vatten i sprutan kommer snabbt flytta uppåt och nedåt i enlighet med andningen (figur 1F).
Obs: Detta steg kan utelämnas av erfarna forskare. - Värma upp cellsuspensionen genom att hålla tuben i hand och därefter överför med pipett 50 μl av upphängning som innehåller 1 x 106 celler (antalet celler kan vara variabel) in i centrera av navet katetern. Avstängningen kommer att vara aspirerade omedelbart. Därefter bifoga en 1 mL spruta och dispensera 300 µL av luft att säkerställa en konsekvent fördelning i lungorna.
- Försiktigt bort katetern, ta bort musen från intubation plattformen och lägga den på en hetta madrassera tills det återhämtar sig från anestesi.
3. lung förberedelse för flödescytometri
- Vid önskad experimentella slutpunkten, lugna musen som en subkutan injektion av en blandning av ketamin (100 mg/kg kroppsvikt) och xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) och avliva det av cervikal dislokation.
- Blötlägg kadavret i 70% etanol och säkra med musen på en dissekering styrelsen med tejp.
- Gör en ventrala mittlinjen snitt och vänd försiktigt huden för att exponera bröstkorgens vägg musklerna och bukorganen. Punktering membranet och skär revbenen med sax för att exponera brösthålan.
- BEGJUTA lungorna 3 x med 6-8 mL iskallt PBS via höger kammare med hjälp en 27 G nål efter styckning en liten öppning i vänster kammare som tillåter blodet att lämna. Lungorna bör tömmas på blod och vända helt vit.
- Ta ut lungorna och finhacka loberna i små bitar med sax. Överföra lung bitar till en 2 mL mikrocentrifug rör och inkubera det i 1,5 mL lung matsmältningen buffert (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL kollagenas jag och 50 U/mL DNAS jag).
- Inkubera lungan stycken 30-60 minuter vid 37 ° C och under ständig skakning.
- Över lung cellsuspensionen genom en 70 µm cell SIL till en 50 mL tub. Rensa silen med baksidan av en steril 10-mL-spruta och skölj silen med 15 mL PBS med 2% FCS.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C och Aspirera supernatanten. Att resuspendera cellerna i 1 mL av ammonium-klorid-kalium (ACK) lyseringslösning buffert och inkubera dem för 5 min i rumstemperatur i lys av kvarvarande erytrocyter.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter vid 4 ° C och resuspendera cellerna i 1 mL PBS med 2% FCS och fortsätta med det önskade färgning protokollet för flöde flödescytometri23.
Obs: Alternativt, cellerna kan vara resuspended i RPMI innehållande 30% FCS och 10% DMSO och frusen med en frysning behållare för senare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde ortotop transplantation modellen via intratrakeal tumör cell leverans för att testa om den tumör mikromiljö stimulerar PD-L1-uttryck. Därför isolerade vi mus-lungceller AC från autoktont KP modellen (KP celler), 10 veckor efter tumör induktion via Cre-recombinase-uttryckande adenovirus (Ad.Cre) leverans24. Därefter har vi märkt lungan AC celler med ett grönt fluorescerande protein (GFP)-uttrycker lentivirus25 och orthotopically rekonstituerades dem till immunkompetenta, syngena möss via intratrakeal leverans. För att validera modellen, vi transplanterade olika mängder av tumörceller och utfört överlevnadsanalys. Som förväntat, överlevnaden av mottagarens möss var korrelerad till antalet rekonstituerades celler och överlevnadstiden var mellan 2 veckor för mottagare 2 x 106 celler och ca 10 veckor för mottagare av 2,5 x 105 celler (figur 2A). När lungorna var dissekeras efter döden av möss används för överlevnadsanalys, märkte vi en jämn fördelning av tumör knölar hela alla loberna i lungorna (figur 2B). Angående morfologi av tumörer, Vi jämförde transplanterade tumörer med autokton KRASG12D-driven tumörer7 och märkte inte någon uppenbar skillnad (figur 2 c).
För att studera de PD-L1-uttrycket av transplanterade tumörceller, vi euthanized mottagarens möss 3 veckor efter transplantation av 1 x 106 celler och förberett lungorna för flöde flödescytometrisk analys. Sondera för PD-L1-uttryck och gating för GFP+ celler, vi identifierat en betydande förändring i PD-L1+ positiva celler jämfört med celler odlade in vitro-(figur 2D). Därför validerat vi denna modell som en tidsbesparande modell att testa för gen uttryck förändringar i tumörceller under fysiologiska tillstånd, som exempelvis kan användas för att undersöka effekterna av genetiska förändringar eller farmakologiska behandlingar av PD-L1 uttryck i lungceller AC.
Figur 1 : Intratrakeal lung tumör celltransplantation. (A) denna panel visar den hemgjorda intubation platform med polystyren lock, två 15 mL rör och en 6,0 silk sutur. (B), fiber optiska kabeln är riktad till bröstet av musen och (C) efter att försiktigt dra ut tungan, vitt ljus som avges från öppnandet av luftstrupen kan ses. (D och E) lämplig placering av musen indikeras av ljus som skiner igenom katetern och kan placeras verifierade (F) av up-and-down förflyttning av vatten i en 1 mL spruta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Morfologi av mus lungorna efter det syngena, intratrakeal transplantation av lungceller AC. (A) denna panel visar en Kaplan Meier-analys av mottagarens möss efter ortotop transplantation av olika mängder av tumörceller. Beloppen av tumörceller som används för intratrakeal leverans anges ilegenden. (B) Detta är en representativ bild av en lung tumör-cell mottagarens musklick. Visas är lungan av en mus som fick 5 x 105 celler och död 43 dagar efter transplantationen. (C), denna panel visar en hematoxylin och eosin färgning av avsnittet lung av autoktona tumörer 10 veckor efter Ad.Cre leverans (till vänster) och 6 veckor efter ortotop transplantation av 5 x 105 tumörceller (höger panel), inklusive en högre förstoring av de angivna områdena (nederst). (D) The PD-L1-uttryck mättes genom flödescytometri i GFP+ KP celler efter odling in vitro-under standart villkorar (före transplantation, röd) och efter ortotop transplantation och isolering från mus lungorna 3 veckor följande engraftment (efter transplantation, blå). Rat IgG2a PE-Cyanine7 användes som en isotyp-kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att studera lungcancer fysiologiska och patologiska händelser i lungan, är invasiv och noninvasiv intratrakeal intubation metoder för instillationen av olika reagenser utbredda26,27,28,29 ,30,31,32. I fältet cancer forskare använder intratrakeal (och intranasalt) instillation av Cre-recombinase-uttryckande virus för att införa somatiska mutationer i lungan epitelceller. Administrering av en Ad.Cre eller lentivirus tillåter villkorlig aktivering av onkogena K-ras i KRAS-LSL-G12D möss, samtidigt med knockout av p53 i sensorik celler, när möss föds med p53-floxed möss7. Möjlighet att studera lungcancer uppkomst från tidigt tills döden av djuret, samt en hög likhet mellan mus tumörer och tumörer, gör dessa modeller extremt populär. Ur en praktisk synvinkel, denna modell kräver omfattande mus avel att studera olika genotyper, vilket i vissa genotyper kan experiment ta upp till ett år från tumör induktion tills slutpunkten experimentella. Detta kräver ökad mus utrymme, och därmed kostnader för mus bostäder.
Möjligheten att enkelt manipulera tumörceller in vitro-med hjälp av CRISPR-Cas9-teknik22 gör ortotop transplantation modeller ett snabbt alternativ att studera effekterna av valda gener på tumörtillväxt och tumör uttrycket profiler. Märkning av tumörcellerna kan användas för realtid övervakning av tumörtillväxt med hjälp av levande cell imagers eller sortera tumörceller enligt sina taggar. Detta möjliggör också en enkel kvantifiering av tumörceller (d.v.s. tumör börda) enligt deras etiketter. När etablerad är detta leveranssätt tumör cell mycket reproducerbara. Jämfört med ortotop transplantation via svans ven leverans, tumörcellerna levereras direkt till deras naturliga miljö i lungorna, medan exponering för blod och blodkomponenter kan förändra tumör Cellegenskaper. Ytterligare, effekterna av manipulerade gener på tumör cellöverlevnad i blodomloppet och extravasering till lungorna är oklara och kan resultera i genotyp beroende förändringar av mängden cellerna levereras till lungorna.
I modellen beskrivs här, spridda tumörer symmetriskt lungan. Detta tillåter den separata skörd och analys av olika lesioner, exempelvis en LOB kan utsättas för flödescytometri Flödesanalys enligt ovan, medan en annan LOB kan användas för immunhistokemisk analys, lung lysate beredning, etc. Växande tumörer resultatet i mottagarens musen död inom 3-10 veckor efter intratrakeal leverans, beroende på antalet celler används. Detta kan forskaren att anpassa antalet transplanterade celler till individuella behov, och mindre cell nummer tillåter längre tumörtillväxt och tumör cell exponering i närmiljön. Däremot, kan en högre mobilnummer är önskvärda för farmakologiska studier att förkorta perioden av drogen leverans.
När upprättats är intratrakeal administrationen av tumörceller mycket reproducerbara. Dock måste några kritiska punkter beaktas när du utför den här proceduren. Först, försiktighet bör iakttas för att undvika vävnadsskada när undantränger tungan med tången och, i synnerhet när katetern sätts in. För placeringen av katetern är det viktigt att forskaren kan tydligt se det vita ljuset att lokalisera öppnandet av luftstrupen. Dock av misstag, kan katetern enkelt infogas i bredvid matstrupen. Vi rekommenderar därför alltid kontrollera för korrekt placering av katetern i luftstrupen som beskrivs ovan. Det är också viktigt att undvika att placera katetern till djupt (dvs katetern får inte placeras nedanför bronkial bifurkation). Detta garanterar en jämn fördelning av lungceller och därmed tumörer i lungorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Safia Zahma för hennes hjälp med förberedelserna av vävnadssnitt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma--characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
