Summary
Her beskriver vi en minimalt invasiv syngeneic orthotopic transplantation model af musen lunge adenocarcinom celler som tid og omkostningsreducerende model til at studere ikke-småcellet lungekræft.
Abstract
Brug af musen modeller er uundværlig for at studere Patofysiologi af forskellige sygdomme. Med hensyn til lungekræft, flere modeller er til rådighed, herunder genetisk manipuleret modeller samt transplantation modeller. Dog er gensplejsede musemodeller tidskrævende og dyrt, der henviser til, at nogle orthotopic transplantation modeller er svært at reproducere. Her, er en non-invasiv intratrakeal leveringsmetode til lunge tumorceller som en alternativ orthotopic transplantation modellen beskrevet. Brug af musen lunge adenocarcinom celler og syngeneic graft modtagere giver mulighed for at studere tumordannelse under tilstedeværelse af en fuldt aktive immunsystem. Derudover genetiske manipulationer af tumor celler før transplantation gør denne model en attraktiv tidsbesparende tilgang at undersøge effekten af genetiske faktorer på tumorvækst og tumor celle genekspression profiler fysiologiske betingelser. Ved hjælp af denne model, vi vise at lunge adenocarcinom celler programmeret udtrykkelige forhøjede niveauer af T-celle suppressor død-ligand 1 (PD-L1) når der dyrkes i deres naturlige miljø i forhold til dyrkning i vitro.
Introduction
Lungekræft er stadig langt den største cancer-relaterede dræber i både mænd og kvinder1. Faktisk, ifølge American Cancer Society, hvert år flere mennesker dør af lungekræft end af bryst-, prostata- og tyktarmskræft kræft sammen1. Indtil for nylig, blev størstedelen af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som er den mest rigelige undertype af lungekræft, behandlet med platin-baseret kemoterapi i en første-line indstilling, for det meste med tilsætning af angiogenese hæmmere2. Kun en delmængde af patienter havne muterede mutationer i epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), i Anaplastisk lymfom kinase (ALK) eller i ROS1, og kan behandles med tilgængelige målretning narkotika3,4. Med fremkomsten af immun checkpoint hæmmere, er nyt håb for patienter med lungecancer opstået, selv om indtil nu kun 20-40% af patienter reagerer på immun terapi5. Derfor, yderligere forskning er forpligtet til at forbedre resultatet af finjustering immun checkpoint terapi og undersøge combinatory behandlingsmuligheder.
For at studere lungekræft, en bred vifte af prækliniske modeller er tilgængelige, herunder spontan modeller udløses af kemikalier og kræftfremkaldende stoffer og genetisk manipulerede mus modeller (CLAUSS) hvor autokton tumorer opstår efter en betinget aktivering af onkogener og/eller inaktivering af tumor suppressor gener6,7,8. Disse modeller er af ganske særlig værdi at undersøge grundlæggende processer i lunge tumor udvikling, men de kræver også omfattende mus avl, og eksperimenter er tidskrævende. Derfor, mange undersøgelser evaluering af potentielle hæmmere drage fordel af subkutan (patient-afledt) xenograft modeller hvor menneskelige lung cancer cellelinjer subkutant injiceres i immundefekte mus9.
I disse modeller, er micromilieu af tumorer ikke repræsenteret i overensstemmelse hermed; Derfor bruger forskere også orthotopic transplantation modeller, hvor tumorceller injiceres intravenøst, intrabronchially eller direkte i den lunge parenkym10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Nogle af disse metoder er teknisk udfordrende og vanskelige at gengives, og kræver intensiv uddannelse af forskerne. 21 her vi tilpasset en non-invasiv orthotopic, intratrakeal transplantation metode hos immunkompetente mus, hvor tumorer udvikle sig inden for 3-5 uger og udviser betydelige ligheder med menneskelige tumorer, at inducere udtryk for T-celle suppressor programmeret død-ligand 1 (PD-L1) på tumorceller. 11 , 12 , 20 brug af musen tumorceller stammer fra CLAUSS modeller og syngeneic recipient mus giver mulighed for korrekt at studere i tumor mikromiljø herunder immunceller. Derudover kan gen redigeringsværktøjer som CRISPR/Cas9 teknologi22 anvendes in vitro-før transplantation, som letter undersøgelsen af virkningen af genetiske faktorer i lunge tumordannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller som skitseret nedenfor følger etiske retningslinjer og blev godkendt af den østrigske føderale Ministeriet for videnskab, forskning og økonomi.
Bemærk: Protokol her beskriver en orthotopic transplantation model af musen lunge adenocarcinom celler i syngeneic modtagere. Celler kan isoleres fra tumor-bærende lungerne af KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) mus7,18, hvis tilgængelige in-house, og transplanteret ind i musene med samme baggrund og køn. Hvis celler blev leveret fra andre forskergrupper og den præcise baggrund forbliver ukendt, anbefaler vi brug af F1-generation af en krydsning mellem C57BL/6 og 129S mus som transplant modtagere for at garantere maksimal tolerance.
1. celle forberedelse
- Frø KP celler 24 timer før transplantation på ca 50% confluency i RPMI, suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), glutamin, og 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin (herefter benævnt standard næringssubstratet). Inkuber cellekulturer ved 37° C, 5% CO2, og omkring 95% relativ luftfugtighed.
- Den næste dag, høste celler ved hjælp af 1 mL trypsin-EDTA (0,05% i fosfatbufferet saltopløsning [PBS]) for 5 min pr. 10 cm plade, og efterfølgende resuspend fritliggende celler med 9 mL af standard næringssubstratet.
- Tælle celler i en hemocytometer og overføre antallet celler behov for eksperimenter i en 50 mL konisk centrifugeglas.
Bemærk: Vi anbefaler transplantere mellem 2,5 x 105 og 1 x 106 KP celler pr. musen, men dette kan være tilpassede baseret på forskerens behov. - Derefter centrifugeres celler i 5 min på 300 x g, Aspirér supernatanten og ved hjælp af en pipette, resuspend celler med en tæthed på 2 x 107/mL (for indånding af 1 x 106 KP celler pr. mus) i serum og antibiotika-gratis RPMI , suppleret med 0,01 M ethylendiamintetra syre (EDTA).
- Hold celler på is indtil transplantation.
2. Orthotopic Transplantation via intratrakeal levering
- Adstadige en mus (8-12 uger gammel) ved en subkutan injektion af en blanding af ketamin (100 mg/kg legemsvægt) og xylazin (10 mg/kg legemsvægt).
- Mens anæstesi sætter ind, forberede intubation kateteret. Derfor, stumpe nålen af et kateter ved blot at skære enden med en saks. Bagefter, skubbe kateteret helt over ende af nålen.
- Bekræft det passende niveau for anæstesi ved pedal refleks via fast tå klemme og anvende oftalmologiske salve til øjnene.
- Ret musen på intubation platform (figur 1A) ved at koble sin øverste fortænder over en sutur og bekræfte, at brystet er lodret nedenunder sutur.
- Placer en optiske fiberkabel mellem forbenene til at belyse bryst (figur 1B).
- Forsigtigt åbne munden af musen og trække det tunge ud ved hjælp af desinficeres flad pincet. Ser for emission af hvidt lys til at finde strubehovedet og visualisere strubelåget og arytenoid brusken (figur 1 c).
- Når åbningen af luftrøret er klart synlig, blidt skub kateteret ind i luftrøret (fig. 1 d). Længden af kateter indsættes afhænger af alder og størrelsen på dyret, da det ikke bør gå under bifurcation at sikre en jævn fordeling af lungen adenocarcinom celler i lungen. Hurtigt fjerne nålen fra kateteret.
- Korrekt placering af kateter i luftrøret er angivet af den hvide lys, der skinner gennem kateteret (figur 1E). For at bekræfte placeringen af kateter i luftrøret, lægger en 1 mL sprøjte indeholdende vand at kateteret. Vandet i sprøjten vil hurtigt bevæge sig op og ned efter vejrtrækning (figur 1F).
Bemærk: Dette trin kan udelades af erfarne forskere. - Varme op cellesuspension ved at holde røret i hånden, og efterfølgende afpipetteres 50 µL af suspension med 1 x 106 celler (antallet af celler kan være variabel) ind i midten af hubben kateter. Suspenderingen vil være indsugning straks. Efterfølgende lægger en 1 mL sprøjte og dispensere 300 µL af luften for at sikre en ensartet fordeling i lungerne.
- Forsigtigt fjerne kateteret, fjerne musen fra intubation platform, og sætte det på en varme-pad, indtil den genindvinder fra anæstesi.
3. lunge forberedelse til flowcytometri
- På den ønskede eksperimentelle slutpunkt, adstadige musen ved en subkutan injektion af en blanding af ketamin (100 mg/kg legemsvægt) og xylazin (10 mg/kg legemsvægt) og aflive det af cervikal dislokation.
- Sættetid slagtekroppen i 70% ethanol og sikre musen på en dissektion bord ved hjælp af tape.
- Gøre en ventrale midterlinjen snit og vend forsigtigt huden til at udsætte thorax væggen muskler og den abdominale organer. Punktere mellemgulvet og skære ribbenene med saks til at udsætte brysthulen.
- Perfuse i lungerne 3 x med 6-8 mL iskold PBS via højre ventrikel ved hjælp af en 27 G nål efter at skære en lille åbning i venstre hjertekammer til at tillade blodet at forlade. Lungerne skal ryddes af blod, og tur helt hvid.
- Tag ud i lungerne og hakkekød lapper i små stykker ved hjælp af saks. Overføre lunge-stykker til en 2 mL microcentrifuge tube og inkuberes det i 1,5 mL af lunge fordøjelsen buffer (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL collagenase jeg, og 50 U/mL DNase jeg).
- Inkuber lungen stykker 30-60 min. ved 37 ° C og under konstant omrystning.
- Overføre cellesuspension lunge gennem en 70 µm celle si i en 50 mL tube. Fjern sien med bagsiden af en steril 10 mL sprøjte og skylle si med 15 mL PBS med 2% FCS.
- Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C og Opsug supernatanten. Resuspend celler i 1 mL af ammonium-chlorid-kalium (ACK) lysing buffer og Inkuber dem i 5 min ved stuetemperatur til lysering af resterende erytrocytter.
- Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C og resuspend celler i 1 mL PBS med 2% FCS og gå videre med den ønskede farvning protokol for flow flowcytometri23.
Bemærk: Alternativt, cellerne kan være genopslemmes i RPMI der indeholder 30% FCS og 10% DMSO og frosset ved hjælp af en frysning beholder til senere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brugte orthotopic transplantation modellen via intratrakeal tumor celle levering til at teste, om tumor mikromiljø stimulerer PD-L1 udtryk. Derfor, vi isoleret mus lunge AC celler fra på autoktont KP model (KP celler), 10 uger efter tumor induktion via Cre-recombinase-udtrykker adenovirus (Ad.Cre) levering24. Efterfølgende er vi mærket lungen AC celler ved hjælp af en grøn fluorescerende proteiner (NGL)-udtrykker lentivirus25 og orthotopically engrafted dem i immunkompetente, syngeneic mus via intratrakeal levering. For at validere modellen, vi transplanterede forskellige mængder af tumorceller og udført overlevelses analyse. Som forventet, recipient mus overlevelse var korreleret til antallet af aflægger celler, og overlevelsestid var mellem 2 uger for modtagere af 2 x 106 celler og omkring 10 uger for modtagere af 2,5 x 105 celler (figur 2A). Når lungerne var dissekeret, efter død af musene brugt for overlevelse analyse, har vi bemærket en jævn fordeling af tumor knuder i hele alle kamre af lungerne (figur 2B). Vedrørende morfologi af tumorer, vi sammenlignede transplanterede tumorer med autokton KRASG12D-drevet tumorer7 og lagde ikke mærke nogen indlysende forskel (figur 2 c).
For at studere PD-L1 udtryk af transplanterede tumorceller, vi euthanized recipient mus 3 uger efter transplantation af 1 x 106 celler og forberedt lungerne til flow cytometric analyse. Sondering for PD-L1 udtryk og gating for normal god landbrugspraksis+ celler, vi identificeret et betydeligt skift i PD-L1+ positive celler i forhold til cellerne kulturperler in vitro (figur 2D). Dermed, vi godkendt denne model som en tidsbesparende model til at teste for gen expression ændringer i tumorceller fysiologiske betingelser, som eksempelvis kan bruges til at undersøge effekten af genetiske ændringer eller farmakologiske behandlinger på PD-L1 udtryk i Lungeceller AC.
Figur 1 : Intratrakeal lunge tumor celle transplantation. (A) dette panel viser den hjemmelavede intubation platform ved hjælp af en polystyren låg, to 15 mL rør og en 6,0 silke sutur. (B) fiber optic wiren er rettet på brystet af mus og (C) efter forsigtigt at trække tungen, hvidt lys udsendes fra åbningen af luftrøret kan ses. (D og E) korrekt placering af musen er angivet med lys, der skinner gennem kateteret og kan blive verificeret (F) af up-and-down bevægelse af vand placeret i en 1 mL sprøjte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Morfologi af musen lungerne efter den syngeneic, intratrakeal transplantation af Lungeceller AC. (A) dette panel viser en Kaplan-Meier analyse af modtagerens musene efter orthotopic transplantation af forskellige mængder af tumorceller. Mængder af tumorceller til intratrakeal levering angives iforklaringen. (B) Dette er et repræsentativt billede af en lunge tumor-celle modtager musen. Vist er lungen i en mus, der fik 5 x 105 celler og afdøde 43 dage efter transplantation. (C) dette panel viser en hæmatoxylin og eosin pletter af afsnittet lunge på autoktont tumorer 10 uger efter Ad.Cre leverance (venstre panel) og 6 uger efter orthotopic transplantation af 5 x 105 tumorceller (højre panel), herunder en højere forstørrelse af de angivne områder (nederst). (D) den PD-L1 udtryk blev målt ved flowcytometri i normal god landbrugspraksis+ KP celler efter dyrkning in vitro-under standardbetingelser (før transplantation, red) og efter orthotopic transplantation og isolation fra mus lungerne 3 uger følgende engraftment (efter transplantation, blå). Rotte IgG2a PE-Cyanine7 blev brugt som en isotype kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at studere lunge fysiologiske og patologiske begivenheder i lungen, er invasive og non-invasiv intratrakeal intubation metoder til instillation af forskellige reagenser udbredte26,27,28,29 ,30,31,32. I feltet kræft forskere bruger intratrakeal (og intranasal) instillation af Cre-recombinase-udtrykke virus at indføre somatiske mutationer i lunge epitelceller. Administration af en Ad.Cre eller lentivirus tillader betinget aktivering af muterede K-ras i KRAS-LSL-G12D mus, samtidig med knockout af p53 i transduced celler, når musene er avlet med p53-floxed mus7. Mulighed for at studere lunge tumordannelse fra den tidligste fase indtil døden af dyret, samt en høj lighed mellem mus tumorer og menneskelige tumorer, gør disse modeller ekstremt populære. Men fra et praktisk synspunkt, denne model kræver omfattende mus avl at studere forskellige genotyper, og i nogle genotyper kan eksperimenter tage op til et år fra tumor induktion indtil den eksperimentelle slutpunkt. Dette kræver øget mus plads, og dermed omkostningerne for mus boliger.
Mulighed for at nemt manipulere tumorceller in vitro-ved hjælp af CRISPR-Cas9 teknologi22 gør orthotopic transplantation modeller en hurtig alternativ at studere virkningerne af valgte gener på tumorvækst og tumor udtryk profiler. Tagging af tumorcellerne kan anvendes til real-time overvågning af tumorvækst ved hjælp af levende celle kameraer eller sortere tumorceller efter deres tags. Dette giver også mulighed for en nem kvantificering af tumorceller (dvs. tumor byrde) efter deres etiketter. Når der oprettet er denne metode af tumor celle levering yderst reproducerbare. I forhold til orthotopic transplantation via hale vene levering, tumorcellerne leveres direkte til deres naturlige miljø i lungerne, der henviser til, at eksponering for blod og blodkomponenter kan ændre tumor celleegenskaber. Yderligere, virkningerne af manipulerede gener på tumor celle overlevelse i blodbanen og ekstravasation til lungerne er uklar og kan resultere i genotype-afhængige ændringer i mængden af de celler, der er leveret til lungerne.
I modellen beskrevet her, fordelt tumorer symmetrisk på hele lungen. Dette giver den særskilte høst og analyse af forskellige læsioner, for eksempel, der kan underkastes flow flowcytometri analyse til én lap, som beskrevet ovenfor, mens en anden lap kan bruges til immunhistokemisk analyse, lunge lysate forberedelse, osv. Voksende tumorer resultat i modtagerens musen død inden for 3-10 uger efter intratrakeal levering, afhængig af antallet af celler, der bruges. Dette gør det muligt for forskeren at tilpasse antallet af transplanterede celler til individuelle behov, og mindre celle tal tillade længere tumorvækst og tumor celle udsættelse for mikromiljø. På den anden side kan en højere cell antal ønske for farmakologiske undersøgelser at forkorte perioden af medicinafgivelse.
Når der oprettet er intratrakeal administration af tumorceller stærkt reproducerbare. Nogle kritiske punkter skal dog overvejes, når du udfører denne procedure. For det første bør der udvises forsigtighed at undgå vævsskader, når fortrænger tungen med pincet og, især, når kateteret er indsat. For placering af kateteret er det afgørende, at forskeren kan tydeligt se det hvide lys til at finde åbningen af luftrøret. Ikke desto mindre, ved en fejltagelse, kateteret kan nemt indsættes i sidestillede spiserøret. Derfor anbefaler vi altid kontrol til den korrekte placering af kateter i luftrør som beskrevet ovenfor. Det er også vigtigt at undgå at placere kateteret for dyb (dvs. kateter må ikke anbringes under bronchial tvedeling). Dette sikrer en jævn fordeling af Lungeceller og dermed tumorer i lungerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Safia Zahma for hendes hjælp med udarbejdelse af væv sektioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/mL Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/mL Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22 GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma--characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
