Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

Summary

L'elettroporazione è un approccio efficace per trasportare geni degli interessi nelle cellule. Applicando questo approccio in vivo sui neuroni del ganglio di topo adulto radice dorsale (DRG), descriviamo un modello per lo studio di rigenerazione dell'assone in vivo.

Abstract

L'elettroporazione è un approccio di transfezione genica non-virale essenziale per introdurre DNA plasmidi o piccole molecole di RNA nelle cellule. Un neurone sensoriale nel ganglio di radice dorsale (DRG) si estende un singolo assone con due rami. Un ramo va alla periferica e l'altro ramo del nervo (ramo periferico) entra nel midollo spinale attraverso la radice dorsale (sede centrale). Dopo la ferita neurale, il ramo periferico rigenera robustamente considerando che il ramo centrale non si rigenerano. A causa della alta capacità rigenerativa, rigenerazione degli assoni sensoriali è stato ampiamente utilizzata come sistema modello per studiare la rigenerazione assonale dei mammiferi in sia il sistema nervoso periferico (PNS) e sistema nervoso centrale (SNC). Qui, descriviamo un protocollo di approccio precedentemente stabilito per modificare l'espressione genica nei neuroni sensoriali maturi in vivo tramite elettroporazione. L'approccio basato su transfezione con plasmidi o piccoli RNA oligos (siRNA o microRNA), consente entrambi gli esperimenti di perdita e guadagno di funzione di studiare il ruolo di geni di interesse o microRNA nella regolazione dell'assone rigenerazione in vivo. Inoltre, la manipolazione dell'espressione genica in vivo può essere controllata sia spazialmente e temporalmente all'interno di un corso di tempo relativamente breve. Questo sistema modello fornisce uno strumento unico per studiare i meccanismi molecolari con cui rigenerazione dell'assone dei mammiferi è regolamentato in vivo.

Introduction

Lesioni nel sistema nervoso causati da traumi neurali o varie malattie neurodegenerative di solito provocano difetti nelle funzioni motorie, sensoriali e cognitive. Recentemente, molto sforzo è stato dedicato al ristabilimento di potenza rigenerativa in neuroni adulti per ripristinare la fisiologica PCM feriti neuroni^1,2,3. Neuroni sensoriali nel DRG sono un gruppo di cellule nervose che trasmettono gli stimoli sensoriali differenti, come dolore, temperatura, tocco o la postura del corpo, al cervello. Ciascuno di questi neuroni è pseudo-unipolare e contiene un singolo assone che moltiplica con un ramo che si estende verso la periferia e l'altro ramo andando verso il midollo spinale⁴. I neuroni sensoriali adulti in DRGs sono tra i pochi neuroni maturi dei mammiferi, noti per rigenerare i loro assoni attivamente dopo la ferita. Quindi, lesioni di assoni sensoriali sono state ampiamente impiegate come un modello fondamentale per studiare i meccanismi di rigenerazione assonale in vivo.

In vivo tecniche transfezione genica, che sono solitamente meno laborioso da configurare e più flessibile rispetto all'utilizzo di animali transgenici, hanno giocato ruoli essenziali nello studio le funzioni dei geni e vie nel sistema nervoso di segnalazione. Le tecniche principali possono essere classificate in due approcci: basati su virus e strumento⁵. Basato su virale in vivo gene consegna in neuroni adulti può fornire spatiotemporal precisa manipolazione del gene espressione⁶. Tuttavia, processi di lavoro ad alta intensità sono coinvolti in metodi basati su virali, quali la produzione e purificazione di particelle virali che contiene il gene desiderato. Inoltre, molti vettori virali potrebbero attivare il sistema immunitario dell'ospite, che può interferire con l'acquisizione di dati, analisi dei dati ed eventualmente indurre in errore l'interpretazione dei risultati sperimentali. Elettroporazione, un approccio tipico strumento-basato transfezione, utilizza un impulso elettrico per aumentare la permeabilità delle cellule e delle membrane nucleari transitoriamente, che favorisce l'afflusso di gene vettori o piccoli RNA oligos dallo spazio di fuori delle cellule⁷ . In vitro l'elettroporazione è ampiamente riconosciuto come una strategia transitoria ma altamente efficiente per la manipolazione genica mirata in molti tipi cellulari. Sebbene in vivo elettroporazione porta solo all'espressione genica transitoria a bassa efficienza di trasfezione rispetto ai vettori virali, ha diversi vantaggi rispetto ad approcci virali. Per esempio, può essere applicato a quasi tutti i tessuti e le cellule^7,8,9. Inoltre, entrambi plasmidi codifica geni di interesse o piccoli RNA oligos (ad es., siRNA, microRNA) contro alcune trascrizioni possono essere iniettati direttamente nel tessuto dell'obiettivo e quindi elettricamente pulsate, che rendono la procedura meno manodopera - e tempo che consumano. Inoltre, la trasfezione più plasmidi e RNA oligos simultaneamente con elettroporazione singolo è possibile.

Abbiamo istituito un approccio in vivo elettroporazione per manipolare l'espressione genica nei neuroni sensoriali topo adulto e applicato con successo e convalidato tale approccio in numerosi studi pioneer^{1,2,3 ,8,10}. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per facilitare l'utilizzo di questo approccio per gli studi futuri di rigenerazione degli assoni dei mammiferi.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità del protocollo animale approvato dal comitato di uso e Johns Hopkins istituzionale Animal Care.

1. materiali e reagenti

1. Animali
   1. Utilizzare topi femmina CF1-sei-settimana-vecchio peso di 30 – 35 g per gli esperimenti.
      Nota: I topi sono stati stabulati in gruppo (5 topi per gabbia) in gabbie individualmente ventilate sterilizzate con 1/4" mais pannocchia biancheria da letto e 2" Piazza nestlets per la nidificazione. Le gabbie sono state mantenute in un ciclo di chiaro-scuro 12-h controllato e la temperatura della camera era tra 19,4 ° C e 25 ° C. I topi sono stati alimentati con dieta roditore globale e sistema di fornitura dell'acqua automatico.
2. Strumenti
   1. Utilizzare i seguenti strumenti chirurgici per condurre in modo efficiente l'intervento chirurgico: siringhe monouso (27 G, 1,0 mL) per iniezione intraperitoneale, pelliccia di clipper, dissezione stereo microscopio, forcipe micro-chirurgia, micro-chirurgia forbici e Pinze ossivore piccolo osso e sterilizzati spugne di tessuto non tessuto.
      Nota: Tutti gli strumenti e i materiali sono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico o pre-sterilizzati da parte dei produttori. Durante la chirurgia, gli strumenti vengono spruzzati con 75% di alcol per mantenere la sterilizzazione.
3. Soluzioni anestetiche
   1. Utilizzare soluzione anestetica #1 per indurre l'anestesia e utilizzare l'anestesia soluzione #2 prima dell'iniezione di DRG per mantenere l'anestesia.
      1. Per rendere la soluzione anestetica #1, diluire ketamina e xilazina in soluzione salina sterile ad una concentrazione finale di 10 mg/mL e 1,2 mg/mL.
      2. Per rendere la soluzione anestetica #2, diluire avertin in soluzione salina sterile ad una concentrazione finale di 20 mg/mL.
4. Plasmide del DNA e RNA Oligos
   1. Preparare i plasmidi utilizzando il kit commerciale seguendo protocolli del produttore di conseguenza. Diluire il plasmide DNAs in acqua deionizzata sterile alla concentrazione di 2,0 µ g / µ l.
   2. Aggiungere la soluzione di colorante Fast Green per raggiungere una concentrazione finale di 0,005-0.01% (v/v) per una migliore visualizzazione del contorno DRG durante l'iniezione.
   3. Sciogliere i oligos siRNA o microRNA nel buffer corrispondenti forniti dai produttori di raggiungere una concentrazione finale a 50 µM.
5. Micro-iniezione pipetta
   1. Tirare il vetro capillare utilizzando la levetta della micropipetta e tagliare la punta della pipetta vetro capillare tirato con le forbici di microchirurgia per generare un'apertura con un diametro esterno di circa 50 µm. Quindi sterilizzare la pipetta di vetro sotto la luce UV su un banco pulito per 20 – 30 min circa.
   2. Sistema di erogazione di Monte la pipetta di vetro sterilizzati sul supporto pipetta collegata ad una microiniezione intracellulare. Impostare i parametri del sistema di microiniezione a 30 psi di pressione e 8 ms di durata.
6. Sistema di elettroporazione
   1. Collegare gli elettrodi per il sistema di elettroporazione di onda quadra e impostare i seguenti parametri: ms 15 impulsi a 35 V con intervalli di 950 ms per elettroporazione in vivo .
7. Perfusione e la soluzione di fissaggio
   1. Sciogliere la polvere di paraformaldeide (PFA) in PBS 1X a una concentrazione del 4% (p/v). Conservare la soluzione PFA a 4 ° C.

2. sperimentale procedure

1. Esposizione chirurgica della L4 e L5 DRGs
   1. Anestetizzare il mouse usando un'iniezione intraperitoneale della soluzione anestetica #1 preparato in precedenza (con ketamina 100 mg/kg di peso corporeo e xilazina 12 mg/kg di peso corporeo).
   2. Radere l'area chirurgica con la tosatrice di pelliccia.
      Nota: Poiché ci sarà un altro intervento chirurgico per schiacciamento del nervo sciatic di sinistra, la pelliccia della coscia posteriore sinistra può essere rasata simultaneamente.
   3. Posizionare il mouse sulla coperta riscaldata (35,0 ° C) e monitorare la temperatura rettale con una sonda di temperatura.
   4. Per testare l'anestesia, pizzicare le dita dei piedi e la coda del mouse e osservare le risposte comportamentali.
   5. Nastro quattro membra del mouse sulla bacheca.
   6. Pulire l'area chirurgica con soluzione di iodophor e poi con 75% di alcool per rimuovere il iodophor prima di tagliare la pelle.
   7. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
   8. Prima incisione, contrassegnare entrambi i lati delle creste iliache con un pennarello per bene. Disegnare una linea che collega due punti delle creste iliache per facilitare identificare le posizioni di L5 DRGs.
   9. Fare un'incisione di 3 cm lungo la linea mediana di lombo con micro-forbici. Inoltre, staccare i muscoli paraspinali, come il multifidus di musculus e il musculus longissimus lumborum, da L3 a S1 processi spinosi ed esporre le faccette articolari di L4-5 e L5-6.
   10. Utilizzare una micro-Pinza ossivora per rimuovere le faccette articolari di L4-5 e L5-6. Inoltre, rimuovere l'arco neurale sinistro di L4 e L5 per esporre il lato dorsale del DRG.
2. Iniezione di DRG
   1. Iniettare la soluzione anestetica #2 (con avertin 200 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale per mantenere l'anestesia prima dell'iniezione di DRG.
   2. Caricare i plasmidi di DNA o RNA oligos (1 µ l a DRG) nella pipetta capillare di vetro.
   3. Inserire attentamente la punta della pipetta capillare di vetro il DRG.
   4. Iniettare gradualmente 1,0 µ l di soluzione di plasmidi di DNA o RNA oligos in DRG utilizzando la microiniezione intracellulare dispensare sistemi (30psi, 8 ms).
      Nota: La durata dell'iniezione dovrebbe durare non meno di 5 minuti.
3. Elettroporazione
   1. Goccia PBS sulle punte degli elettrodi.
   2. Ripulire l'emorragia con una garza sterile e quadrato in cotone.
   3. Pizzicare la destinazione DRG con gli elettrodi delicatamente e applicare 5 impulsi quadrato elettrici con il sistema di elettroporazione.
   4. Chiudere gli strati della pelle e del muscolo rispettivamente con suture in nylon 5-0.
   5. Posizionare il mouse su una coperta riscaldata (35,0 ° C) sotto molta attenzione fino a quando completamente ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Tornare il mouse dalla gabbia dopo esso ha recuperato pienamente dall'anestesia.
      Nota: Ci vogliono circa 60 min per il mouse per recuperare completamente dall'anestesia della coperta di 37 ° C. Sciogliere un ibuprofene pillola (200 mg) in 1.000 ml di acqua (0,2 mg/ml) per il nutrimento giornaliero per alleviare il dolore post-chirurgico.
4. Schiacciamento del nervo sciatico
   1. Due o tre giorni (secondo il disegno sperimentale) dopo l'elettroporazione DRG, anestetizzare il mouse intraperitonealmente con soluzione anestetica #2 (con avertin 400 mg/kg di peso corporeo).
   2. Nastro quattro membra del mouse sulla bacheca.
   3. Fare un'incisione di 1 cm 0,5 cm al lato sinistro lungo la linea mediana. Tagliare i muscoli, quali il muscolo di maximus del gluteus e muscolo piriforme, longitudinalmente. Esporre il segmento del nervo sciatico tra l'orifizio sciatic maggiore e la tacca sciatic.
   4. Schiacciamento del nervo con il forcipe di microchirurgia per 12 s e mark il sito schiacci con una sutura di epineural in nylon 10 / 0. Fare un nodo sulla membrana dural per contrassegnare il sito schiacci.
   5. Chiudere gli strati della pelle e del muscolo con sutura in nylon 5-0.
   6. Posizionare il mouse su una coperta riscaldata (35,0 ° C) con molta attenzione fino a quando completamente ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Tornare il mouse dalla gabbia dopo esso ha recuperato pienamente dall'anestesia.
      Nota: Ci vogliono circa 60 min per il mouse per recuperare completamente dall'anestesia della coperta di 37 ° C. Sciogliere un ibuprofene pillola (200 mg) in 1.000 ml di acqua (0,2 mg/ml) per il nutrimento giornaliero per alleviare il dolore post-chirurgico.
5. Mouse di aspersione, DRG e nervo sciatico Harvest
   1. Due o tre giorni dopo lo schiacciamento del nervo sciatico (secondo il disegno sperimentale), anestetizzare il mouse intraperitonealmente con soluzione anestetica #2.
   2. Irrorare il mouse via con PBS (pH 7.4) seguita da ghiacciata paraformaldeide al 4% (PFA) (pH 7,5) in PBS.
   3. Dopo aspersione, separare attentamente il DRGs insieme alle radici nervose e del nervo sciatico prima il ginocchio con micro-forbici e micro-forcipe sotto il microscopio di dissezione. Posizionare il nervo sciatico direttamente nel 4% PFA durante la notte a 4 ° C.
6. Imaging e misurare la fluorescenza-Labeled assoni sensoriali
   1. Spogliano il tessuto allegato e la membrana sul nervo sciatico fisso con micro-forbici e micro-forcipe attentamente sotto il microscopio di dissezione. Poi, il 4% lo scambio PFA con PBS e lavare il nervo tre volte.
   2. Inserire il nervo sciatico in una diapositiva e mantenerlo dritto. Aggiungere 80 µ l di soluzione antifade intorno al nervo, quindi porre un coprivetrino su esso. Appiattire il tessuto tutto montato con pressione.
   3. Posizionare i tessuti peccabile sul microscopio invertito epifluorescent equipaggiato con un accessorio per mosaico acquisizione ed elaborazione di immagine.
      Nota: Le lunghezze di eccitazione e di emissione sono 488 nm e 509 nm. È anche possibile prendere più immagini sovrapposte manualmente e unire le immagini insieme usando ImageJ con il mosaico plug-in.
   4. Quando si misura la lunghezza degli assoni rigenerati, tracciare tutti i identifiable fluorescently-labeled assoni nel nervo sciatico dal sito schiacci (contrassegnato con la sutura epineural 10-0) per le estremità distali dell'assone.

Representative Results

Per quantificare la citotossicità dell'attuale protocollo e per convalidare che il tasso di transfezione di in vivo DRG elettroporazione è abbastanza alto, abbiamo iniettato e individulamente fluorescente contrassegnati microRNA o siRNA in L4 e L5 DRGs. Il DRG indipendente sono stati elaborati attraverso cryo-sezionamento e immunohistochemistry (Figura 1A-B). Quando si stima il tasso di sopravvivenza delle cellule dopo l'iniezione e l'elettroporazione, la DRGs intatto da L4 e L5 sono stati raccolti e lavorati attraverso cryo-sezionamento e immunohistochemistry. Le densità di neurone, riflettute con Tuj1 la colorazione non hanno mostrato una differenza significativa rispetto alle densità del neurone di intatto DRGs, che indica che l'elettroporazione non ha indotto la morte delle cellule neuronali (Figura 1C). Il tasso di transfezione è stato calcolato come il rapporto tra il numero dei neuroni di oligo RNA con tag e il numero dei neuroni Tuj1-positivi. Il tasso medio di transfezione di miRNA è 80,7 ± 4,3% e il siRNA 94,2 ± 0,3% (Figura 1D). Quando si applica il metodo corrente in vivo elettroporazione per studiare la rigenerazione assonale, il nervo sciatico era appiattito ed imaged. Ogni assone rigenerata con traiettoria distintivo e riconoscibile dell'assone distale alla fine può essere rintracciato dal sito schiacci indicato dal nodo di sutura (Figura 2). Inoltre, abbiamo individulamente DRGs con plasmidi EGFP e raccolto il midollo spinale da T7 a L2 con radici dorsali di L4 e L5 dopo 7 giorni. Abbiamo usato un tessuto consolidato protocollo di compensazione — uDISCO per cancellare il midollo spinale¹¹. Gli assoni di EGFP-con l'etichetta di colonna dorsale del midollo spinale erano imaged con un microscopio confocale e quindi identificati nel longitudinale e la proiezione di immagini sagittali (Figura 3). In alternativa, le immagini confocali possono essere elaborate con software di visualizzazione di microscopia di ricostruire un'immagine 3D (film 1).

Figura 1 : Immunohistochemistry di DRG cryo-sezione dopo l'elettroporazione di etichetta fluorescente non specifici microRNA o siRNA in vivo. (A) rappresentante cryo-sezione del DRG tessuto iniettato ed elettroporate con etichetta fluorescente (Dy547) non bersaglio microRNA. Immagine a sinistra: l'immagine del segnale fluorescente (colore rosso) dell'etichetta fluorescente (Dy547) non bersaglio microRNA. Immagine centrale: immuno-colorazione (colore verde) di Tuj1 con un fluoroforo Alexa488 dell'anticorpo secondario. Immagine a destra: l'immagine risultante dalla fusione dei precedenti due canali. Barra della scala = 100 µm.(B) rappresentante cryo-sezione del DRG tessuto iniettato ed elettroporate con etichetta fluorescente (Cy3) non bersaglio siRNA. Immagine a sinistra: l'immagine del segnale fluorescente (colore rosso) dell'etichetta fluorescente (Cy3) non bersaglio siRNA. Immagine centrale: immuno-colorazione (colore verde) di Tuj1 con un fluoroforo Alexa488 dell'anticorpo secondario. Immagine a destra: l'immagine risultante dalla fusione dei precedenti due canali. La barra rappresenta 100 µm. (C) la densità del neurone di un intatto DRG cryo-sezione della scala è 809,6 ± 14.2 cellule/mm² (N = 6) e un iniettato DRG cryo-sezione è 801.6 ± 27,4 cellule/mm² (N = 6), media ± SEM, dello studente t-prova, NS: nessuna significato. Tre topi sono stati eseguiti in vivo DRG elettroporazione sulla sinistra L4 e L5 DRGs con siRNA taggato. Sia sinistra e destra L4 e L5 DRGs sono raccolte dopo 48 h e trattati tramite cryo-sezione e immunohistochemistry. Ciascun DRG è stato sezionato in 60 fette approssimativi e lo spessore della fetta è di 10 μm. Tre fette di ciascun DRG sono selezionati 200 μm e una media. (D) il tasso di transfezione del quieto taggato è 80,7 ± 4,3% (N = 4) e il siRNA taggato è 94,2 ± 0,3% (N = 6), media ± SEM Tre topi sono stati eseguiti in vivo DRG elettroporazione sulla sinistra L4 e L5 DRGs con siRNA taggato e due topi con miRNA taggato. Il DRG sono raccolti dopo 48 h e lavorati tramite cryo-sezione e immunohistochemistry. Ciascun DRG è stato sezionato in 60 fette approssimativi e lo spessore della fetta è di 10 μm. Tre fette di ciascun DRG sono selezionati 200 μm e una media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Ectopically espresso EGFP display rigenerato un neurone assoni nel nervo sciatico dopo lo schiacciamento lesioni. Gli assoni in un nervo sciatico appiattito ha sofferto da lesione da schiacciamento sono etichettati con EGFP (fluorescenza verde) trasportati dal somas in assoni. La linea rossa indica la posizione di frantumazione sito di lesione, che originariamente è stato chirurgicamente segnato da un nodo di sutura. La punta di freccia bianca, freccia e stelle indicano tre estremità dell'assone distintivo, che estendere dal sito schiacci. Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Proiezione immagini degli assoni che esprimono EGFP nel midollo spinale dopo in vivo elettroporazione delle DRG. (A) proiezione longitudinale degli assoni EGFP-identificati all'interno della colonna dorsale e radici dorsali L4/L5. Immagini di inserto A1 e A2 mostrano le due aree rettangolari contrassegnate nel pannello (A) una vista ingrandita. A1 esibisce una visione dettagliata degli assoni nella colonna dorsale. A2 esibisce una visione dettagliata degli assoni in zona dell'entrata della radice dorsale (DREZ). Barra della scala = 200 µm. (B) proiezione sagittale degli assoni EGFP-identificati all'interno della colonna dorsale. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1: ricostruzione 3D degli assoni che esprimono EGFP nel midollo spinale dopo in vivo elettroporazione del DRG. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Diverse fasi chirurgiche richiedono particolare attenzione. La L4 e L5 DRGs (posizione di somas), che dominano il nervo sciatico, devono essere correttamente identificati e iniettato con costrutti genici. In caso contrario, la GFP-etichettatura sarà assente negli assoni del nervo sciatico. Le creste iliache possono essere visualizzate come punti di riferimento anatomici utili per individuare L4 e L5 DRGs. Nella maggior parte dei topi, il giunto tra le vertebre L5 e L6 di sfaccettatura è prossima a creste iliache¹². In alternativa, L3 DRG può essere scelto invece di L5, soprattutto per le analisi come immunohistochemistry o macchia occidentale¹³, come l'esposizione chirurgica del L5 DRG solitamente incontra grandi difficoltà a causa di una posizione profonda e ricca offerta di sangue. Inoltre, l'intero intervento dovrebbe evitare dannosi DRG strutture, tra cui il midollo spinale e la radice di nervo circostanti. La seconda fase operativa critica degno di nota è l'iniezione. Il colorante Fast Green è stato mescolato con la soluzione di costrutti genici per visualizzare la soluzione espulsa dall'ago e diffondere in DRG. Un'iniezione di successo dovrebbe mostrare una chiara forma rotonda DRG delineato dal colorante fluorescente. Se la soluzione con colorante fluorescente fuoriesce da DRG durante l'iniezione, avanti e indietro messa a punto sulla profondità della punta del microago può garantire iniezione completa di tutta la soluzione nella capsula del DRG. Evitare di impalare il DRG in più di tre siti diversi. Più ulteriormente, lieve sanguinamento è solitamente inevitabile dopo l'iniezione di DRG, come DRGs ermeticamente incapsulati con rete venosum¹³. È importante fermare l'emorragia di modo che non ci sarà sangue isolante la superficie del DRG da elettrodi durante l'elettroporazione. Elettroporazione successo dipende dalla trasduzione corrente elettrica, e PBS soluzione può essere applicata sull'elettrodo. Infine, il sito sul nervo sciatico dove è schiacciato con forcipe deve essere contrassegnato con micro-sutura, perché il sito di lesione è invisibile sotto il microscopio e deve essere indicato come il punto di partenza della rigenerazione dell'assone per analisi di immagine più tardi. Se il nodo di sutura epineural presso il sito di schiacciamento si stacca dopo la dissezione e l'aspersione animale, è fondamentale per rietichettare il sito stesso con una sutura immediatamente sul nervo PFA-fisso quando il rientro schiacci-indotta è ancora identificabile.

Tra le tecniche di transfezione, elettroporazione ha un più alto tasso di transfezione. Secondo il nostro studio, il tasso di transfezione del neurone DRG per microRNA o siRNA dopo in vivo elettroporazione è prossimo al 90%. Ancora più importante, in vivo l'elettroporazione è lontano meno dispendio di tempo rispetto ai metodi basati su virus, che richiedono un imballaggio di virus di costrutti genici desiderata. Per quanto sappiamo, anche se la trasfezione basata su lipofectamine in vivo ha meno tossicità che elettroporazione, la lipofectamine non funziona sui neuroni di DRG in particolare, in vivo né in vitro. Degno di nota, la metodologia attuale ha alcune limitazioni tecniche. In primo luogo, la durata dell'efficacia di siRNA per abbattere il gene di interesse è più breve rispetto alla consegna dei plasmidi virus-ha basato. Di conseguenza, l'intera procedura dall'elettroporazione di sacrificio animale dev'essere finito in 4 – 6 giorni¹⁴. Inoltre, l'intervento chirurgico eseguito al microscopio richiede pratica e destrezza manuale. Per un novizio, la durata dell'intervento chirurgico è spesso più tempo del previsto. La dose di anestetica amministrata per il mouse deve essere attentamente controllato per evitare indesiderate mortalità. Infine, appiattendo il nervo sciatico provoca la sovrapposizione degli assoni nel condurre epifluorescente imaging. I nervi unflattened di imaging con un microscopio confocale è un'opzione alternativa.

Anatomicamente, i neuroni sensoriali di DRG hanno due rami axonal - periferico ramo discendente e ascendente ramo centrale sporgente nella colonna dorsale del midollo spinale¹⁰. La metodologia attuale mostra anche contrassegno distintivo della colonna dorsale del midollo spinale. Così, una metodologia simile utilizzabile come modello per studiare la rigenerazione assonale sensitivo dopo la ferita del midollo spinale. Combinato con tessuto-schiarimento tecniche¹¹, microscopia confocale convenzionale o microscopia luce-foglio può essere impiegata sul campione di midollo spinale deselezionata per costruire immagini 3D ricostruite di assoni sensoriali all'interno della colonna dorsale del midollo spinale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief