Behandlende pattedyr Axon regenerering: In Vivo elektroporation af voksen mus dorsalrods Ganglion

Summary

Elektroporation er en effektiv metode til at levere gener af interesser i celler. Ved at anvende denne fremgangsmåde i vivo på neuroner af voksen mus dorsalrods ganglion (DRG), beskriver vi en model for at studere axon regenerering in vivo.

Abstract

Elektroporation er en væsentlig ikke-virale gen Transfektion tilgang til at indføre DNA plasmider eller små RNA molekyler i celler. En sensorisk neuron i dorsalrods ganglion (DRG) udvider et enkelt axon med to grene. En gren går til perifere nerve (perifere gren), og anden grenen indtaster rygmarv gennem dorsalrods (central gren). Efter den neurale skade regenererer den perifere gren håndfast der henviser til, at den centrale afdeling ikke regenerere. På grund af den høje regenerationsevne har sensoriske axon regenerering været meget anvendt som et modelsystem til at studere pattedyr axon regeneration i det perifere nervesystem (PNS) og det centrale nervesystem (CNS). Her, beskriver vi en tidligere etablerede tilgang protokollen for at manipulere genekspression i modne sensoriske neuroner i vivo via elektroporation. Baseret på Transfektion med plasmider eller små RNA oligos (siRNAs eller MicroRNA), tilgangen giver mulighed for både tab og gevinst-af-funktion eksperimenter til at studere rollerne af gener af interesse eller MicroRNA i regulering af axon regenerering in vivo. Derudover kan manipulation af genet udtryk i vivo kontrolleres, både rumligt og tidsligt inden for en relativt kort tidsforløb. Denne modelsystem giver et unikt værktøj til at undersøge de molekylære mekanismer som pattedyr axon regenerering er reguleret i vivo.

Introduction

Skader på nervesystemet forårsaget af neurale traumer eller forskellige neurodegenerative sygdomme som regel medføre defekter i motoriske, sensoriske og kognitive funktioner. For nylig, har meget arbejde været helliget regenerativ potens genetablering i voksne neuroner til at gendanne den fysiologiske functionsof skadet neuroner^1,2,3. Sensoriske neuroner i DRG er en klynge af nerveceller, der formidler forskellige sensoriske stimuli, såsom smerte, temperatur, tryk eller kropsholdning, at hjernen. Hver af disse neuroner er pseudo unipolar og indeholder et enkelt axon, der tveger med en filial hælder mod periferien og den anden gren på vej mod rygmarven⁴. De voksne sensoriske neuroner i DRG er blandt et par modne pattedyr neuroner kendt at regenerere deres axoner aktivt efter skade. Derfor er skader af sensoriske axoner blevet udførligt ansat som en afgørende model til at studere mekanismerne af cytoskeletale regenerering in vivo.

In vivo gen Transfektion teknikker, som er normalt mindre tidskrævende at konfigurere og mere fleksibel end ved hjælp af transgene dyr, har spillet væsentlige roller i at studere funktionerne af gener og signalering veje i nervesystemet. De vigtigste teknikker kan inddeles i to tilgange: instrument- og virus-baserede⁵. Viral-baseret i vivo gen levering i voksne neuroner kan give præcise spatiotemporelle manipulation af gen expression⁶. Men arbejdskrævende processer er involveret i viral-baserede metoder, såsom produktion og rensning af virale partikler der indeholder det ønskede gen. Derudover kunne mange virale vektorer aktivere immunsystemet af værten, som kan interferere med dataopsamling, analyse af data og eventuelt vildlede fortolkning af eksperimentelle resultater. Elektroporation, en typisk instrument-baserede Transfektion tilgang, bruger en elektrisk impuls for at øge permeabiliteten af celle og nukleare membraner forbigående, som favoriserer tilstrømningen af genet vektorer eller små RNA oligos fra rummet uden for cellerne⁷ . In vitro elektroporation er bredt anerkendt som en forbigående, men yderst effektiv strategi for at manipulere med målrettede genekspression i mange celletyper. Selv i vivo elektroporation kun fører til forbigående genekspression med lav transfecting effektivitet i forhold til virale vektorer, har det forskellige fordele i forhold til viral tilgange. Det kan for eksempel anvendes på næsten alle væv og celler^7,8,9. Derudover enten plasmider kodning gener af interesse eller små RNA oligos (f.eks. siRNAs, MicroRNA) mod visse udskrifter kan injiceres i målvæv direkte og derefter elektrisk impuls, som gøre proceduren mindre arbejdskraft - og tid - forbrugende. Desuden er transfecting flere plasmider og RNA oligos samtidig med enkelt elektroporation muligt.

Vi har etableret en i vivo elektroporation tilgang for at manipulere genekspression i voksen mus sensoriske neuroner og anvendt med succes og valideret sådan tilgang i talrige banebrydende undersøgelser^{1,2,3 ,8,10}. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at lette brugen af denne fremgangsmåde for fremtidige studier af pattedyr axon regenerering.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til animalsk protokollen godkendt af Johns Hopkins institutionelle Animal Care og brug udvalget.

1. materialer og reagenser

1. Dyr
   1. Bruge seks-uge-forhenværende kvindelig CF1 mus vejer 30 – 35 g for forsøgene.
      Bemærk: Mus var opstaldes (5 mus pr. bur) i individuelt ventileret steriliseret bure med 1/4" majs cob sengetøj og 2" firkantede nestlets indlejring. Bure blev opretholdt i en kontrolleret 12-h lys-mørke cyklus og rumtemperaturen var mellem 19,4 ° C og 25 ° C. Musene blev fodret med globale gnaver kost og automatisk vand levering system.
2. Instrumenter
   1. Brug de følgende kirurgiske instrumenter til at effektivt udføre kirurgi: engangs sprøjter (27 G, 1,0 mL) for intraperitoneal injektion, pels clipper, stereo dissektion mikroskop, mikro-kirurgi pincet, mikro-kirurgi saks og lille knogle rongeurs og steriliseret ikke-vævede svampe.
      Bemærk: Alle de instrumenter og materialer er autoklaveres før operation eller steriliseret ved producenterne. Under operationen, er instrumenterne, der sprøjtet med 75% alkohol til at opretholde sterilisation.
3. Bedøvelsesmiddel løsninger
   1. Bruge bedøvelsesmiddel løsning #1 at inducere anæstesi og bruge anæstesi løsning #2 før DRG injektion til at vedligeholde anæstesi.
      1. For at gøre bedøvelse løsning #1, fortyndes ketamin og xylazin i sterilt saltvand i en endelig koncentration på 10 mg/mL og 1,2 mg/mL.
      2. For at gøre bedøvelse løsning #2, fortyndes avertin i sterilt saltvand i en endelig koncentration på 20 mg/mL.
4. DNA Plasmid og RNA Oligos
   1. Forberede plasmider ved hjælp af kommercielle kit efter producentens protokoller i overensstemmelse hermed. Fortynd plasmid DNAs i sterile deioniseret vand til koncentrationen af 2,0 µg/µL.
   2. Tilføj hurtigt grønne farvestof løsning for at nå frem til en endelig koncentration på 0,005-0,01% (v/v) for bedre visualisering af DRG disposition under injektion.
   3. Opløse siRNA eller mikroRNA oligos i tilsvarende buffere, som producenterne at nå frem til en endelig koncentration på 50 µM.
5. Mikroinjektion Pipette
   1. Træk kapillær glasset ved hjælp af mikropipette aftrækker og klip spidsen af trak kapillær glas pipette med mikrokirurgi saks til at generere en åbning med en omtrentlig 50 µm ydre diameter. Derefter sterilisere glas pipette under UV-lys på en ren bænk i 20 – 30 min ca.
   2. Mount steriliseret glas pipette pipette indehaveren tilsluttet en intracellulær mikroinjektion dispensere system. Indstille parametre for mikroinjektion system på 30 psi pres og 8 ms af varighed.
6. Elektroporation System
   1. Elektroderne tilsluttes firkantbølge elektroporation system og angive følgende parametre: 15 ms pulser på 35 V med 950 ms intervaller for i vivo elektroporation.
7. Perfusion og fastsættelse af løsning
   1. Opløse PARAFORMALDEHYD (PFA) pulver i 1 x PBS ved en koncentration på 4% (w/v). Butik PFA løsning ved 4 ° C.

2. eksperimentelle procedurer

1. Kirurgiske eksponering af L4 og L5 DRG
   1. Bedøver musen ved hjælp af en intraperitoneal injektion af den bedøvende løsning #1 forberedt tidligere (med ketamin 100 mg/kg kropsvægt og xylazin 12 mg/kg legemsvægt).
   2. Barbere det kirurgiske område med pels clipper.
      Bemærk: Da der vil være en anden operation for venstre iskiasnerven crush, pels af den venstre bageste låret kan blive barberet samtidigt.
   3. Placer musen på den opvarmede tæppe (35,0 ° C) og overvåge den rektal temperatur med en temperatur sonde.
   4. At teste anæstesi, klemme tæerne og halen af musen og observere de adfærdsmæssige reaktioner.
   5. Tape fire lemmer af musen på opslagstavlen.
   6. Tør den kirurgisk område med iodophor opløsning og derefter med 75% alkohol til at fjerne iodophor før skære huden.
   7. Anvende oftalmologiske salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
   8. Før indsnit, skal du markere begge sider af de iliaca kamme med et fint tusch. Tegne en linje, der forbinder to punkter af iliaca kamme til at gøre det lettere at identificere holdninger af L5 DRG.
   9. Gøre en 3 cm indsnit langs midterlinjen af lænden med mikro-saks. Desuden frigøre paraspinous muskler, såsom musculus multifidus og musculus longissimus lumborum, fra L3 til S1 torntappene, og udsætte facetled L4-5 og L5-6.
   10. Bruge en mikro-rongeur til at fjerne facetled L4-5 og L5-6. Desuden Fjern den venstre neurale arch L4 og L5 at udsætte den dorsale side af DRG.
2. DRG injektion
   1. Injicere bedøvelsesmiddel løsning #2 (med avertin 200 mg/kg legemsvægt) intraperitoneal at opretholde anesthesia før DRG injektion.
   2. Indlæse DNA plasmider eller RNA oligos (1 µL pr. DRG) i glas kapillær pipette.
   3. Indsæt spidsen af kapillar glas pipette omhyggeligt i DRG.
   4. Injicere gradvist 1,0 µL opløsning af DNA plasmider eller RNA oligos i DRG ved hjælp af de intracellulære mikroinjektion dispensere systemer (30 psi, 8 ms).
      Bemærk: Varigheden af injektion skal vare ikke mindre end 5 minutter.
3. Elektroporation
   1. Drop PBS på tips til elektroderne.
   2. Rydde op i blødning med steriliseret firkantede bomuld gaze.
   3. Knivspids target DRG med elektroderne forsigtigt og anvende 5 firkantet elektriske impulser med elektroporation system.
   4. Luk muskel og hud lag henholdsvis med 5-0 nylon sutur.
   5. Placer musen på et opvarmet tæppe (35,0 ° C) under opmærksomme, indtil den er helt genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Returnere musen til hjem buret, når det er fuldt genoprettet fra anæstesi.
      Bemærk: Det tager ca 60 min til musen helt inddrive fra anæstesi på 37 ° C tæppe. Opløses en pille (200 mg) ibuprofen i 1000 ml vand (0,2 mg/ml) til daglig fodring for at lindre de post-operative smerter.
4. Iskiasnerven Crush
   1. To eller tre dage (afhængigt af den eksperimentelle design) efter DRG elektroporation, bedøver mus intraperitoneal med bedøvelsesmiddel løsning #2 (med avertin 400 mg/kg legemsvægt).
   2. Tape fire lemmer af musen på opslagstavlen.
   3. Gøre en 1 cm incision 0,5 cm til venstre langs midterlinjen. Skære musklerne, gluteus maximus muskel og piriformis muskel, på langs. Udsætte segment af iskiasnerven mellem de større ischiadicus foramen og ischiadicus hakket.
   4. Knuse nerve med mikrokirurgi pincet 12 s og mærke crush site med en 10-0 nylon epineural sutur. Lav en knude på den dural membran til at markere webstedet crush.
   5. Luk muskel og hud lag med 5-0 nylon sutur.
   6. Placer musen på et opvarmet tæppe (35,0 ° C) med fokus på, indtil den er helt genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Returnere musen til hjem buret, når det er fuldt genoprettet fra anæstesi.
      Bemærk: Det tager ca 60 min til musen helt inddrive fra anæstesi på 37 ° C tæppe. Opløses en pille (200 mg) ibuprofen i 1000 ml vand (0,2 mg/ml) til daglig fodring for at lindre de post-operative smerter.
5. Musen Perfusion, DRG og iskiasnerven høst
   1. To eller tre dage efter iskiasnerven knuse (afhængigt af den eksperimentelle design), bedøver mus intraperitoneal med bedøvelsesmiddel løsning #2.
   2. Perfuse musen transcardially med PBS (pH 7,4) efterfulgt af iskold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (pH 7,5) i PBS.
   3. Efter perfusion, adskille DRG samt nerve rødder og iskiasnerven før knæet forsigtigt med mikro-saks og mikro-pincet mikroskopet dissektion. Placer iskiasnerven direkte i 4% PFA natten over ved 4 ° C.
6. Imaging og måle fluorescens-mærket sensoriske axoner
   1. Krænge af den vedlagte væv og membran på den faste iskiasnerven med mikro-saks og mikro-pincet omhyggeligt under dissektion mikroskop. Derefter udveksle 4% PFA med PBS og vask nerve tre gange.
   2. Placer iskiasnerven på et dias og holde det lige. Tilsættes 80 µL af antifade løsning omkring nerven, så Læg en coverslip på det. Tromle det hele monteret væv med pres.
   3. Placer flattened væv på den inverterede epifluorescent mikroskop udstyret med tilbehør til mosaik erhvervelse og billedbehandling.
      Bemærk: Excitations- og længder er 488 nm og 509 nm. Det er også muligt at tage flere overlappende billeder manuelt og sy billederne sammen ved hjælp af ImageJ med mosaik plug-in.
   4. Ved måling af længden af folier axoner, spore alle identifiable fluorescently-mærket axoner i iskiasnerven fra webstedet crush (markeret med 10-0 epineural sutur) til distale axon enderne.

Representative Results

At kvantificere cytotoksicitet af den nuværende protokol og at validere at Transfektion i vivo DRG elektroporation er høj nok, vi injiceres og electroporated fluorescently markeret mikroRNA eller siRNA i L4 og L5 DRG. De fritliggende DRG blev behandlet gennem cryo-skæring og Immunhistokemi (figur 1A-B). Når estimering celle overlevelsesrate efter injektion og elektroporation, var de intakte DRG fra L4 og L5 høstet og forarbejdet gennem cryo-skæring og Immunhistokemi. De neuron tætheder, afspejles med Tuj1 farvning, udviste ikke en betydelig forskel i forhold til neuron tætheder af intakt DRG, hvilket indikerer, at elektroporation ikke fremkalde neuronal celledød (figur 1C). Transfektion sats blev beregnet som forholdet mellem antallet af mærket RNA oligo neuroner og antallet af Tuj1-positive neuroner. Den gennemsnitlige Transfektion af miRNA er 80.7 ± 4,3% og siRNA 94,2 ± 0,3% (fig. 1D). Når du anvender den aktuelle i vivo elektroporation metode for at studere axon regenerering, var iskiasnerven fladtrykt og afbildet. Hver folier axon med karakteristiske bane og genkendelige distale axon ende kan spores fra webstedet crush angivet med sutur knude (figur 2). Derudover vi electroporated DRG med EGFP plasmider og høstet rygmarv fra T7 til L2 sammen med dorsale rødder af L4 og L5 efter 7 dage. Vi brugte en veletableret væv clearing protokollen — uDISCO til at fjerne rygmarv¹¹. EGFP-mærket dorsale kolonne axoner i rygmarven blev afbildet med en Konfokal mikroskop og derefter identificeret i både den langsgående og de sagittal projicere billeder (figur 3). Alternativt kan de Konfokal billeder behandles med mikroskopi visualisering software til at rekonstruere et 3D billede (film 1).

Figur 1 : Immunhistokemi af DRG cryo-afsnit efter elektroporation fluorescently markeret ikke-specifikke microRNA eller siRNA i vivo. (A) repræsentant cryo-sektion af DRG væv injiceres og electroporated med fluorescently mærket (Dy547) ikke-målarter MicroRNA. Venstre billede: billedet af den fluorescerende signal (rød farve) om fluorescently markeret (Dy547) ikke-målarter MicroRNA. Midterste billede: immuno-farvning (grøn farve) af Tuj1 med en Alexa488 fluorophore på den sekundære antistof. Højre billede: det flettede billede af de foregående to kanaler. Skalalinjen = 100 µm.()B) repræsentant cryo-sektion af DRG væv injiceres og electroporated med fluorescently mærket (Cy3) ikke-målarter siRNAs. Venstre billede: billedet af den fluorescerende signal (rød farve) om fluorescently markeret (Cy3) ikke-målarter siRNAs. Midterste billede: immuno-farvning (grøn farve) af Tuj1 med en Alexa488 fluorophore på den sekundære antistof. Højre billede: det flettede billede af de foregående to kanaler. Skala bar repræsenterer 100 µm. (C) neuron tætheden af et intakt DRG cryo-sektion er 809.6 ± 14.2 celler/mm² (N = 6) og en injiceret DRG cryo-sektion er 801.6 ± 27,4 celler/mm² (N = 6), mener ± SEM, Student's t-test, NS: ingen betydning. Tre mus blev udført i vivo DRG elektroporation på venstre L4 og L5 DRG med mærket siRNA. Både venstre og højre L4 og L5 DRG er høstet efter 48 h og behandles gennem cryo-sektion og Immunhistokemi. Hver DRG har været opdelt i tilnærmelsesvis 60 skiver, og tykkelsen af udsnittet er 10 μm. Tre skiver af hver DRG vælges af 200 μm og et gennemsnit. (D) Transfektion sats af mærket miRNA er 80.7 ± 4,3% (N = 4) og de mærkede siRNA er 94,2 ± 0,3% (N = 6), mener ± SEM. Tre mus blev udført i vivo DRG elektroporation på venstre L4 og L5 DRG med mærket siRNA og to mus med mærket miRNA. DRG er høstet efter 48 h og behandles gennem cryo-sektion og Immunhistokemi. Hver DRG har været opdelt i tilnærmelsesvis 60 skiver, og tykkelsen af udsnittet er 10 μm. Tre skiver af hver DRG vælges af 200 μm og et gennemsnit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Ectopically udtrykt EGFP viser regenereres neuronal axoner i iskiasnerven efter knusning skade. Axoner i en fladtrykt iskiasnerven lidt fra crush skade er mærket med EGFP (grøn fluorescens) transporteres fra svovldepositioner til axoner. Den røde linje angiver placeringen af den knusende skaden site, som var oprindeligt kirurgisk præget af en suturing knude. Hvid pilespids, pil og stjerne angiver tre særprægede axon ender, som strækker sig fra webstedet crush. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Projektion billeder af EGFP-udtrykker axoner i rygmarven efter i vivo elektroporation af DRG. (A) langsgående projektionen af de EGFP-mærket axoner i kolonnen dorsale og L4/L5 dorsale rødder. Indsatte billeder A1 og A2 viser forstørrede visninger af de to rektangulære områder er markeret i panelet (A). A1 udstiller en detaljeret visning af axoner i den dorsale kolonne. A2 udstiller en detaljeret visning af axoner i dorsalrods indrejse zone (DREZ). Skalalinjen = 200 µm. (B) Sagittal projektionen af de EGFP-mærket axoner i den dorsale kolonne. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1: 3D rekonstruktion af EGFP-udtrykker axoner i rygmarven efter i vivo elektroporation af DRG. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Flere kirurgiske skridt kræver særlig opmærksomhed. L4 og L5 DRG (placering af svovldepositioner), som dominerer iskiasnerven, skal være korrekt identificeret og injiceres med gen konstruktioner. Ellers normal god landbrugspraksis-mærkning vil være fraværende i iskiasnerven axoner. De iliaca kamme kan betragtes som nyttige anatomiske landemærker til at lokalisere L4 og L5 DRG. I de fleste mus er facet fælles mellem L5 og L6 ryghvirvler umiddelbare at iliaca kamme¹². Alternativt kan L3 DRG valgt i stedet for L5, især for assays Immunhistokemi eller vestlige skamplet¹³, som kirurgiske eksponering af L5 DRG mødes normalt store vanskeligheder på grund af en dyb placering og rig blodforsyning. Hele operationen bør undgå skadelige DRG omkringliggende strukturer, herunder rygmarven og nerve rod. Det andet kritiske operationstrin værd at bemærke er injektion. Hurtigt grønne farvestof var blandet med løsning af genet konstruktioner til at visualisere den løsning bortvist fra nålen og diffus i DRG. En vellykket injektion skal vise en klar runde-formet DRG skitseret af det fluorescerende farvestof. Hvis løsning med fluorescerende farvestof siver ud fra DRG mens indsprøjtning, kan en back-og-tilbage finjustering på dybden af spidsen af mikro-nål sikre fuldstændig injektion af alle løsning i DRG kapsel. Undgå at spidde DRG på mere end tre forskellige steder. Yderligere, milde blødning er normalt uundgåelige efter DRG injektion, som DRG er stramt indkapslet med rete venosum¹³. Det er vigtigt at stoppe blødningen så at der ikke kommer blod isolerende overfladen af DRG fra elektroder under elektroporation. Vellykket elektroporation afhænger af elektriske nuværende transduktion, og PBS løsning kan anvendes på elektroden. Endelig, webstedet på iskiasnerven hvor er knust med pincet bør være mærket med mikro-sutur, fordi skaden site er usynlige mikroskopet og skal angives som udgangspunktet for axon regeneration til billedanalyse senere. Hvis epineural sutur knude på webstedet crush falder af efter dyr perfusion og dissektion, er det kritisk at igen mærke det samme sted med en sutur straks på PFA-fast nerve når crush-induceret indrykningen er stadig identificerbare.

Blandt Transfektion teknikker har elektroporation en højere Transfektion sats. Ifølge vores undersøgelse Transfektion DRG neuron til MicroRNA eller siRNAs efter i vivo elektroporation er tæt på 90%. Vigtigere, er i vivo elektroporation langt mindre tidskrævende end virus-baserede metoder, der kræver virus emballage af ønskede gen konstruktioner. Så vidt vi ved, selv om lipofectamine-baseret i vivo Transfektion har mindre toksicitet end elektroporation, lipofectamine virker ikke på DRG neuroner især, hverken in vivo eller in vitro. Bemærkelsesværdigt, de nuværende metoder har flere tekniske begrænsninger. Først, varigheden af siRNA effektivitet til at banke ned gen-af-interesse er kortere end den virus-baserede levering af plasmider. Hele proceduren fra elektroporation til animalske offer har derfor at være færdig i 4 – 6 dage¹⁴. Desuden kræver kirurgi udføres under mikroskop, praksis og nogle håndelag. For en novice er kirurgi varighed ofte længere tid end forventet. Den bedøvende dosis administreres til musen har skal kontrolleres omhyggeligt for at forhindre uønskede dødelighed. Endelig udfladning iskiasnerven medfører overlapning af axoner, når der udføres epifluorescerende billeddannelse. Imaging unflattened nerver med en Konfokal mikroskop er en alternativ mulighed.

Anatomisk, har DRG sensoriske neuroner to cytoskeletale grene - den perifere nedadgående gren og den opstigende centrale gren fremspringende i den dorsale kolonne i rygmarven¹⁰. Den nuværende metode viser også karakteristisk mærkning af den dorsale kolonne i rygmarven. Således, en lignende metode kan bruges som model til at undersøge sensorisk axon regenerering efter rygmarvsskade. Kombineret med væv-clearing teknikker¹¹, kan konventionelle Konfokal mikroskopi eller lys-ark mikroskopi være ansat på ryddet rygmarven prøve at opbygge 3D rekonstruerede billeder af sensoriske axoner i den dorsale kolonne i rygmarven.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief