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Neuroscience

जांच स्तनधारी Axon पुनर्जनन: Vivo Electroporation में वयस्क माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/58171
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Electroporation कोशिकाओं में हितों के जीन देने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण है । vivo में वयस्क माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (डीआरजी) के ंयूरॉंस पर इस दृष्टिकोण को लागू करने से, हम एक मॉडल का वर्णन करने के लिए vivo मेंaxon पुनर्जनन अध्ययन ।

Abstract

Electroporation एक आवश्यक गैर वायरल जीन अभिकर्मक दृष्टिकोण को कोशिकाओं में डीएनए plasmids या छोटे आरएनए अणुओं परिचय है । पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि (DRGs) में एक संवेदी ंयूरॉन दो शाखाओं के साथ एक एकल axon फैली हुई है । एक शाखा परिधीय तंत्रिका (परिधीय शाखा) को जाता है, और अन्य शाखा पृष्ठीय रूट (केंद्रीय शाखा) के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में प्रवेश करती है । तंत्रिका चोट के बाद, परिधीय शाखा मजबूती से पुनर्जीवित जबकि केंद्रीय शाखा पुनर्जंम नहीं है । उच्च अपक्षयी क्षमता के कारण, संवेदी axon पुनर्जनन व्यापक रूप से परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) दोनों में स्तनधारी axon पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यहां, हम एक पहले से स्थापित दृष्टिकोण प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए electroporation के माध्यम से vivo में परिपक्व संवेदी ंयूरॉंस में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर । plasmids या छोटी आरएनए ओलिगोस्पर्मिया (siRNAs या microRNAs) के साथ अभिकर्मक के आधार पर, दृष्टिकोण दोनों नुकसान के लिए अनुमति देता है-और लाभ के समारोह प्रयोगों के जीन की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए-हितों या microRNAs में axon पुनर्जनन के विनियमन में vivo. इसके अलावा, vivo में जीन अभिव्यक्ति की हेरफेर एक अपेक्षाकृत कम समय पाठ्यक्रम के भीतर दोनों स्थानिक और अस्थाई नियंत्रित किया जा सकता है । इस मॉडल प्रणाली एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है आणविक तंत्र है जिसके द्वारा स्तनधारी axon पुनर्जनन vivo मेंविनियमित है की जांच करने के लिए ।

Introduction

तंत्रिका आघात या विभिन्न neurodegenerative रोगों की वजह से नर्वस सिस्टम में चोटों आमतौर पर मोटर में दोष में परिणाम, संवेदी और संज्ञानात्मक कार्यों. हाल ही में, बहुत प्रयास है वयस्क न्यूरॉन्स में फिर से अपक्षयी शक्ति पुनः स्थापित करने के लिए समर्पित किया गया है शारीरिक functionsof घायल ंयूरॉंस1,2,3। डीआरजी में संवेदी न्यूरॉन्स तंत्रिका कोशिकाओं के एक क्लस्टर कि इस तरह के दर्द, तापमान, स्पर्श, या शरीर मुद्रा, मस्तिष्क के रूप में अलग संवेदी उत्तेजनाओं, व्यक्त कर रहे हैं । इन ंयूरॉंस में से प्रत्येक छद्म एकध्रुवीय है और एक एकल axon कि एक परिधि की ओर विस्तार शाखा और रीढ़ की हड्डी4की ओर बढ़ अंय शाखा के साथ bifurcates शामिल हैं । वयस्क संवेदी न्यूरॉन्स DRGs में कुछ परिपक्व स्तनधारी न्यूरॉन्स उनके axons सक्रिय रूप से चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए जाना जाता है के बीच में हैं. इसलिए, संवेदी axons की चोटों को बड़े पैमाने पर vivo मेंaxonal पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल के रूप में नियोजित किया गया है ।

vivo जीन अभिकर्मक तकनीक में, जो आमतौर पर कम समय लेने वाली है और ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करने से अधिक लचीला स्थापित कर रहे हैं, तंत्रिका तंत्र में जीन और संकेत रास्ते के कार्यों का अध्ययन करने में आवश्यक भूमिका निभा रहा है । साधन आधारित है और वायरस आधारित5: मुख्य तकनीक दो दृष्टिकोण में वर्गीकृत किया जा सकता है । वायरल- में vivo जीन डिलिवरी में आधारित वयस्क न्यूरॉन्स जीन अभिव्यक्ति की सटीक spatiotemporal हेरफेर प्रदान कर सकते हैं6. हालांकि, श्रम-गहन प्रक्रियाओं वायरल आधारित तरीकों में शामिल हैं, ऐसे उत्पादन और वायरल वांछित जीन युक्त कणों के शोधन के रूप में । इसके अलावा, कई वायरल वैक्टर मेजबान है, जो डेटा अधिग्रहण, डेटा विश्लेषण और संभवतः प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या को गुमराह के साथ हस्तक्षेप कर सकते है की प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय कर सकता है । Electroporation, एक ठेठ साधन आधारित अभिकर्मक दृष्टिकोण, सेल और परमाणु झिल्ली की पारगम्यता को बढ़ाने के लिए एक बिजली के पल्स का उपयोग करता है क्षणिक, जो 7 कोशिकाओं के बाहर अंतरिक्ष से जीन वैक्टर या छोटे आरएनए ओलिगोस्पर्मिया का तांता एहसान . इन विट्रो electroporation व्यापक रूप से कई प्रकार के सेल में लक्षित जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए एक क्षणिक लेकिन अत्यधिक कुशल रणनीति के रूप में मांयता प्राप्त है । हालांकि vivo electroporation में ही वायरल वैक्टर की तुलना में कम transfecting क्षमता के साथ क्षणिक जीन अभिव्यक्ति की ओर जाता है, यह वायरल दृष्टिकोण पर विभिंन लाभ है । उदाहरण के लिए, यह लगभग सभी ऊतकों और कोशिकाओं7,8,9करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, या तो plasmids एंकोडिंग जीन के हित या छोटे आरएनए ओलिगोस्पर्मिया (जैसे, siRNAs, microRNAs) कुछ टेप के खिलाफ सीधे लक्ष्य ऊतक में इंजेक्शन किया जा सकता है और फिर बिजली स्पंदित, जो प्रक्रिया कम श्रम करना-और समय लेने वाली । इसके अलावा, transfecting मल्टीपल plasmids और आरएनए ओलिगोस्पर्मिया एक साथ एक electroporation के साथ संभव है ।

हम एक vivo electroporation दृष्टिकोण में स्थापित किया है वयस्क माउस संवेदी ंयूरॉंस में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर और सफलतापूर्वक लागू और कई पायनियर अध्ययन में ऐसे दृष्टिकोण मांय1,2,3 ,8,10. यहां, हम स्तनधारी axon पुनर्जनन के भविष्य के अध्ययन के लिए इस दृष्टिकोण के उपयोग की सुविधा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोग पशु जॉंस हॉपकिंस संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. सामग्री और रिएजेंट

  1. जानवरों
    1. प्रयोग के लिए छह सप्ताह की बूढ़ी मादा CF1 चूहों का वजन ३०-३५ ग्राम करें.
      नोट: चूहों समूह घर में थे (पिंजरे प्रति 5 चूहों) 1/4 "मकई सिल बिस्तर और 2" घोंसले के लिए वर्ग nestlets के साथ व्यक्तिगत हवादार निष्फल पिंजरों में । पिंजरों एक नियंत्रित 12-h प्रकाश अंधेरे चक्र में बनाए रखा गया था और कमरे के तापमान १९.४ डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच था । चूहों ग्लोबल कुतर आहार और स्वचालित पानी की आपूर्ति प्रणाली के साथ खिलाया गया ।
  2. उपकरणों
    1. सर्जरी को कुशलतापूर्वक संचालन करने के लिए निम्नलिखित सर्जिकल उपकरणों का प्रयोग करें: intraperitoneal इंजेक्शन, फर क्लिपर, स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप, माइक्रो सर्जरी संदंश, माइक्रो सर्जरी कैंची, और छोटे हड्डी rongeurs के लिए डिस्पोजेबल सीरिंज (27 जी, १.० एमएल) और निष्फल गैर बुना स्पंज ।
      नोट: सभी उपकरणों और सामग्री सर्जरी या पूर्व उत्पादकों द्वारा निष्फल से पहले autoclaved हैं । सर्जरी के दौरान नसबंदी को बनाए रखने के लिए यंत्रों का ७५% अल्कोहल के साथ छिड़काव किया जाता है ।
  3. संवेदनाहारी समाधान
    1. संज्ञाहरण को प्रेरित और संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए डीआरजी इंजेक्शन से पहले संज्ञाहरण समाधान #2 का उपयोग करने के लिए #1 संवेदनाहारी समाधान का प्रयोग करें ।
      1. संवेदनाहारी समाधान #1 बनाने के लिए, ketamine और xylazine बाँझ खारा में एक अंतिम एकाग्रता में 10 मिलीग्राम/एमएल और १.२ मिलीग्राम/
      2. संवेदनाहारी समाधान #2 बनाने के लिए, बाँझ खारा में avertin के एक अंतिम एकाग्रता में पतला 20 मिलीग्राम/
  4. डीएनए प्लाज्मिड और आरएनए ओलिगोस्पर्मिया
    1. तदनुसार निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद वाणिज्यिक किट का उपयोग कर plasmids तैयार करें । २.० µ जी/µ एल की एकाग्रता के लिए बाँझ जल में प्लाज्मिड DNAs को पतला करें ।
    2. इंजेक्शन के दौरान डीआरजी रूपरेखा के बेहतर दृश्य के लिए 0.005-0.01% (वी/वी) के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए तेजी से हरी डाई समाधान जोड़ें ।
    3. सिरना या microRNA ओलिगोस्पर्मिया निर्माताओं द्वारा प्रदान की इसी बफर में ५० µ एम पर एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए भंग ।
  5. माइक्रो इंजेक्शन पिपेट
    1. micropipette खींचने का उपयोग केशिका गिलास खींचो और एक अनुमानित ५० µm बाहरी व्यास के साथ एक खोलने उत्पन्न करने के लिए microsurgery कैंची के साथ खींच केशिका ग्लास पिपेट की नोक में कटौती । तो 20 के लिए एक स्वच्छ पीठ पर यूवी प्रकाश के तहत गिलास पिपेट निष्फल-30 मिनट लगभग ।
    2. एक intracellular microinjection वितरण प्रणाली से जुड़े पिपेट धारक पर निष्फल ग्लास पिपेट माउंट । दबाव के 30 साई और अवधि के 8 ms में microinjection प्रणाली के मापदंडों सेट करें ।
  6. Electroporation प्रणाली
    1. वर्ग तरंग electroporation सिस्टम के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें और निम्न पैरामीटर सेट करें: 15 ms दालों में ३५ वी के साथ ९५० ms अंतराल के लिए vivo electroporation.
  7. छिड़काव और समाधान फिक्सिंग
    1. 4% (डब्ल्यू/वी) की एकाग्रता पर 1x पंजाब में paraformaldehyde (पीएफए) पाउडर भंग । 4 ° c पर पीएफए समाधान संग्रहीत करता है ।

2. प्रायोगिक कार्यविधियां

  1. L4 और L5 DRGs के सर्जिकल एक्सपोजर
    1. Anesthetize माउस संवेदनाहारी समाधान के एक intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग कर पहले तैयार #1 (ketamine के साथ १०० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन और xylazine 12 मिलीग्राम/
    2. फर क्लिपर के साथ सर्जिकल क्षेत्र दाढ़ी ।
      नोट: के बाद से वहां छोड़ दिया sciatic तंत्रिका क्रश के लिए एक और सर्जरी होगी, बाएं पीछे जांघ के फर एक साथ मुंडा जा सकता है ।
    3. गर्म कंबल (३५.० डिग्री सेल्सियस) पर माउस प्लेस और एक तापमान जांच के साथ मलाशय के तापमान की निगरानी ।
    4. संज्ञाहरण का परीक्षण करने के लिए, उंगलियों और माउस की पूंछ चुटकी और व्यवहार प्रतिक्रियाओं का पालन ।
    5. corkboard पर माउस के चार अंगों का टेप ।
    6. iodophor समाधान के साथ सर्जिकल क्षेत्र पोंछ और फिर ७५% शराब के साथ त्वचा को काटने से पहले iodophor को दूर करने के लिए ।
    7. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें ।
    8. चीरा से पहले, मार्क एक ठीक मार्कर पेन के साथ श्रोणि शिखाओं के दोनों पक्षों. एक लाइन श्रोणि शिखाओं के दो अंक जोड़ने के लिए L5 DRGs के पदों की पहचान की सुविधा ड्रा ।
    9. माइक्रो-कैंची के साथ कम वापस की midline साथ एक 3 सेमी चीरा बनाओ । इसके अलावा, इस तरह के musculus multifidus और musculus longissimus lumborum के रूप में paraspinous की मांसपेशियों को अलग, L3 से एस 1 रीढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं से, और L4 के पहलू जोड़ों-5 और L5-6 बेनकाब ।
    10. L4-5 और L5-6 के पहलू जोड़ों को दूर करने के लिए एक माइक्रो-rongeur का प्रयोग करें । इसके अलावा, L4 और L5 के वाम तंत्रिका मेहराब को हटाने के लिए DRGs के पृष्ठीय पक्ष का पर्दाफाश ।
  2. डीआरजी इंजेक्शन
    1. सुई संवेदनाहारी समाधान #2 (avertin के साथ २०० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) intraperitoneally डीआरजी इंजेक्शन से पहले संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए ।
    2. डीएनए plasmids या आरएनए ओलिगोस्पर्मिया (1 µ l प्रति डीआरजी) को ग् केशिका पिपेट में लोड कर ᱶ ।
    3. डीआरजी में पिपेट ध्यान से केशिका ग्लास की नोक डालें ।
    4. धीरे से intracellular microinjection वितरण प्रणालियों (30 साई, 8 एमएस) का उपयोग डीआरजी में डीएनए plasmids या आरएनए ओलिगोस्पर्मिया के १.० µ एल समाधान इंजेक्षन.
      नोट: इंजेक्शन की अवधि नहीं 5 मिनट से कम पिछले चाहिए ।
  3. Electroporation
    1. इलेक्ट्रोड के सुझावों पर गिरा पंजाबियों.
    2. निष्फल वर्ग कपास धुंध के साथ खून बह रहा साफ ।
    3. धीरे इलेक्ट्रोड के साथ डीआरजी लक्ष्य चुटकी और electroporation प्रणाली के साथ 5 वर्ग बिजली दालों लागू होते हैं ।
    4. 5-0 नायलॉन टांके के साथ क्रमशः मांसपेशी और त्वचा परतों को बंद करें ।
    5. करीब ध्यान के तहत एक गर्म कंबल (३५.० डिग्री सेल्सियस) पर माउस प्लेस जब तक यह पूरी तरह से पर्याप्त चेतना को कड़ी recumbency बनाए रखने के लिए आ गया है । घर के पिंजरे में चूहा लौटने के बाद यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है ।
      नोट: यह पूरी तरह से ३७ डिग्री सेल्सियस कंबल पर संज्ञाहरण से उबरने के लिए माउस के लिए लगभग ६० मिनट लगते हैं । शल्य चिकित्सा दर्द को दूर करने के लिए दैनिक खिलाने के लिए एक गोली भंग (२०० मिलीग्राम) ibuprofen में १,००० मिलीलीटर पानी (०.२ मिलीग्राम/एमएल) ।
  4. Sciatic तंत्रिका क्रश
    1. दो या तीन दिन (प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है) डीआरजी electroporation के बाद, anesthetize संवेदनाहारी समाधान के साथ माउस intraperitoneally #2 (avertin ४०० मिलीग्राम/
    2. corkboard पर माउस के चार अंगों का टेप ।
    3. एक 1 सेमी चीरा midline साथ बाईं ओर करने के लिए ०.५ सेमी बनाओ । मांसपेशियों को काटें, जैसे gluteus maximus बलवान और piriformis बलवान, longitudinally. ग्रेटर sciatic फोरमेन और sciatic पायदान के बीच sciatic तंत्रिका के खंड बेनकाब ।
    4. 12 एस के लिए microsurgery संदंश के साथ तंत्रिका क्रश और एक 10-0 नायलॉन epineural टांका के साथ क्रश साइट निशान । क्रश साइट को निशाना बनाने के लिए ड्युल झिल्ली पर गाँठ लगाएं ।
    5. 5-0 नायलॉन सीवन के साथ मांसपेशी और त्वचा परतों को बंद करें ।
    6. करीब ध्यान के साथ एक गर्म कंबल (३५.० डिग्री सेल्सियस) पर माउस रखें जब तक यह पूरी तरह से पर्याप्त चेतना को प्राप्त करने के लिए स्टर्नल recumbency बनाए रखने है । घर के पिंजरे में चूहा लौटने के बाद यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है ।
      नोट: यह पूरी तरह से ३७ डिग्री सेल्सियस कंबल पर संज्ञाहरण से उबरने के लिए माउस के लिए लगभग ६० मिनट लगते हैं । शल्य चिकित्सा दर्द को दूर करने के लिए दैनिक खिलाने के लिए एक गोली भंग (२०० मिलीग्राम) ibuprofen में १,००० मिलीलीटर पानी (०.२ मिलीग्राम/एमएल) ।
  5. माउस छिड़काव, डीआरजी और Sciatic तंत्रिका फसल
    1. दो या तीन दिनों के बाद sciatic तंत्रिका क्रश (प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है), anesthetize माउस intraperitoneally के साथ संवेदनाहारी समाधान #2.
    2. Perfuse के साथ माउस transcardially (पीएच ७.४) के बाद पंजाब में बर्फ ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) (पीएच ७.५) ।
    3. छिड़काव के बाद, DRGs तंत्रिका जड़ों और sciatic तंत्रिका के साथ एक साथ घुटने से पहले सूक्ष्म कैंची और सूक्ष्म संदंश के साथ विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत अलग । 4 ° c पर रात भर पीएफए 4% में सीधे sciatic तंत्रिका प्लेस ।
  6. इमेजिंग और मापने प्रतिदीप्ति-लेबल संवेदी Axons
    1. सूक्ष्म कैंची और सूक्ष्म संदंश विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत ध्यान से फिक्स्ड sciatic तंत्रिका पर संलग्न ऊतक और झिल्ली पट्टी । फिर, पंजाबियों के साथ 4% पीएफए विनिमय और तीन बार तंत्रिका धो लो ।
    2. sciatic नर्व को एक स्लाइड पर रखें और सीधा रख दें । तंत्रिका के आसपास antifade समाधान के ८० µ एल जोड़ें, तो उस पर एक coverslip करना । दबाव के साथ पूरे घुड़सवार ऊतक समतल ।
    3. मोज़ेक अधिग्रहण और छवि प्रसंस्करण के लिए एक सहायक के साथ सुसज्जित औंधा epifluorescent माइक्रोस्कोप पर flattened ऊतकों प्लेस ।
      नोट: उत्तेजना और उत्सर्जन की लंबाई ४८८ एनएम और ५०९ एनएम हैं । यह भी कई अतिव्यापी छवियों को मैन्युअल रूप से लेने के लिए और मोज़ेक प्लग में साथ ImageJ का उपयोग कर एक साथ छवियों सिलाई करने के लिए संभव है.
    4. जब पुनर्जीवित axons की लंबाई को मापने, sciatic तंत्रिका में सभी identifiable fluorescently-लेबल axons को कुचलने साइट से ट्रेस (10-0 epineural टांका के साथ चिह्नित) बाहर की axon समाप्त होता है ।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल के cytotoxicity को बढ़ाता है और यह मांय करने के लिए कि vivo डीआरजी electroporation में अभिकर्मक दर काफी अधिक है, हम इंजेक्शन और electroporated फ्लोरोसेंट-टैग microRNA या सिरना और L5 L4 । रेग्युलेटर DRGs को क्रायो-सेक्शनिंग और immunohistochemistry (फिगर 1A-B) के जरिए प्रोसेस किया गया । इंजेक्शन और electroporation के बाद कोशिका जीवित रहने की दर का आकलन करते समय, L4 और L5 से बरकरार DRGs को काटा गया और क्रायो-सेक्शनिंग और immunohistochemistry के माध्यम से संसाधित किया गया । ंयूरॉन घनत्व, Tuj1 धुंधला के साथ प्रतिबिंबित, एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा जब बरकरार DRGs के ंयूरॉन घनत्व की तुलना में, जो इंगित करता है कि electroporation ंयूरॉन कोशिका मृत्यु (चित्रा 1सी) प्रेरित नहीं किया । अभिकर्मक दर टैग की गई आरएनए oligo न्यूरॉन्स की संख्या के बीच अनुपात के रूप में और Tuj1 की संख्या-सकारात्मक न्यूरॉन्स की गणना की गई. miRNA का मतलब अभिकर्मक दर ८०.७ ± ४.३% और सिरना ९४.२ ± ०.३% (चित्रा 1डी) है । axon पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए विवो electroporation पद्धति में वर्तमान लागू करते हैं, sciatic तंत्रिका समतल और छवि थी । विशिष्ट पथ और पहचानने योग्य बाहर axon अंत के साथ हर पुनर्जीवित axon टांका गाँठ (चित्रा 2) द्वारा संकेत क्रश साइट से पता लगाया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हम EGFP plasmids के साथ DRGs electroporated और T7 से रीढ़ की हड्डी को L4 और L5 की पृष्ठीय जड़ों के साथ 7 दिनों के बाद के साथ काटा । हम एक अच्छी तरह से स्थापित ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया-रीढ़ की हड्डी11स्पष्ट करने के लिए uDISCO । EGFP-रीढ़ की हड्डी में पृष्ठीय कॉलम axons लेबल एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ imaged थे और फिर दोनों अनुदैर्ध्य और sagittal पेश छवियों में पहचान (चित्रा 3) । वैकल्पिक रूप से, फोकल छवियों को एक 3 डी छवि (फिल्म 1) पुनर्निर्माण के लिए सूक्ष्म दृश्य सॉफ्टवेयर के साथ संसाधित किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : डीआरजी क्रायो-खंड के electroporation के बाद फ्लोरोसेंट-tagged गैर विशिष्ट microRNA या vivo मेंसिरना की Immunohistochemistry. (एक) प्रतिनिधि क्रायो-डीआरजी ऊतक इंजेक्शन की धारा और फ्लोरोसेंट के साथ electroporated-टैग (Dy547) गैर लक्ष्य microRNAs । वाम छवि: फ्लोरोसेंट संकेत की छवि (लाल रंग) फ्लोरोसेंट के टैग (Dy547) गैर लक्ष्य microRNAs । मध्य छवि: माध्यमिक एंटीबॉडी पर एक Alexa488 fluorophore के साथ Tuj1 के इंयूनो-धुंधला (हरा रंग) । सही छवि: पिछले दो चैनलों की मर्ज की गई छवि । स्केल बार = १०० µm ।(ख) प्रतिनिधि क्रायो-डीआरजी ऊतक इंजेक्शन की धारा और electroporated के साथ फ्लोरोसेंट टैग (Cy3) गैर लक्ष्य siRNAs । वाम छवि: फ्लोरोसेंट संकेत की छवि (लाल रंग) फ्लोरोसेंट के टैग (Cy3) गैर लक्ष्य siRNAs । मध्य छवि: माध्यमिक एंटीबॉडी पर एक Alexa488 fluorophore के साथ Tuj1 के इंयूनो-धुंधला (हरा रंग) । सही छवि: पिछले दो चैनलों की मर्ज की गई छवि । स्केल बार १०० µm का प्रतिनिधित्व करता है । (ग) एक बरकरार डीआरजी क्रायो-खंड के ंयूरॉन घनत्व ८०९.६ ± १४.२ कोशिकाओं है/mm2 (एन = 6) और एक इंजेक्शन डीआरजी क्रायो-खंड ८०१.६ ± २७.४ कोशिकाओं है/mm2 (N = 6), मतलब ± SEM, छात्र टीपरीक्षण, एन एस: नहीं महत्व. तीन चूहों पर vivo डीआरजी electroporation में प्रदर्शन किया गया बाईं L4 और L5 DRGs के साथ टैग सिरना. बाएं और दाएं दोनों L4 और L5 DRGs ४८ h के बाद काटा जाता है और क्रायो-अनुभाग और immunohistochemistry के माध्यम से संसाधित किए जाते हैं । प्रत्येक डीआरजी लगभग ६० स्लाइस में खोदी गई है और स्लाइस की मोटाई 10 माइक्रोन है । प्रत्येक डीआरजी के तीन स्लाइस २०० माइक्रोन और औसत द्वारा चुने गए हैं । (घ) tagged miRNA की अभिकर्मक दर ८०.७ ± ४.३% (n = 4) है और tagged सिरना ९४.२ ± ०.३% है (n = 6), मतलब ± SEM । तीन चूहों पर vivo डीआरजी electroporation में प्रदर्शन किया गया बाईं L4 और L5 DRGs के साथ टैग की गईं सिरना और दो चूहों के साथ टैग की गईं miRNA. DRGs ४८ ज के बाद काटा और क्रायो-धारा और immunohistochemistry के माध्यम से संसाधित कर रहे हैं । प्रत्येक डीआरजी लगभग ६० स्लाइस में खोदी गई है और स्लाइस की मोटाई 10 माइक्रोन है । प्रत्येक डीआरजी के तीन स्लाइस २०० माइक्रोन और औसत द्वारा चुने गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : Ectopically व्यक्त EGFP चोट से कुचल के बाद sciatic तंत्रिका में पुनर्जीवित ंयूरॉन axons प्रदर्शित करता है । कुचल चोट से ग्रस्त एक समतल sciatic तंत्रिका में axons EGFP (हरी प्रतिदीप्ति) सोमाओं से axons के लिए उत्पात के साथ लेबल कर रहे हैं । लाल रेखा कुचल चोट साइट है, जो मूल रूप से शल्य चिकित्सा एक suturing गांठ द्वारा चिह्नित किया गया था की स्थिति को इंगित करता है । सफ़ेद arrowhead, तीर, और तारा तीन विशिष्ट axon सिरों को इंगित करते हैं, जिनमें से सभी क्रश साइट से विस्तार करते हैं । स्केल बार = ५०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : EGFP-व्यक्त axons के प्रक्षेपण छवियों के बाद रीढ़ की हड्डी में vivo electroporation में DRGs. (क) EGFP के अनुदैर्ध्य प्रक्षेपण-पृष्ठीय कॉलम के भीतर axons लेबल और L4/ इनसेट छवियां A1 और A2 कक्ष (A) में चिह्नित दो आयताकार क्षेत्रों के बढ़ाया गया दृश्य दिखाएं । A1 पृष्ठीय कॉलम में axons का एक विस्तृत दृश्य प्रदर्शित । A2 पृष्ठीय रूट प्रविष्टि क्षेत्र (ड्रेज) में axons की एक विस्तृत दृश्य दर्शाती है । स्केल बार = २०० µm. (ख) पृष्ठीय स्तम्भ के भीतर EGFP-त्यसपछि axons का Sagittal प्रक्षेपण । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: EGFP-व्यक्त axons के 3d पुनर्निर्माण के बाद रीढ़ की हड्डी में vivo electroporation of DRGs. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

कई शल्य चिकित्सा कदम विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है । L4 और L5 DRGs (सोमाओं के स्थान), जो sciatic तंत्रिका पर हावी, की जरूरत है सही ढंग से पहचान की और जीन के साथ इंजेक्शन का निर्माण । अंयथा, GFP-लेबलिंग sciatic तंत्रिका axons में अनुपस्थित हो जाएगा । श्रोणि शिखा L4 और L5 DRGs तुच्छ करने के लिए उपयोगी संरचनात्मक स्थलों के रूप में देखा जा सकता है । सबसे चूहों में, L5 और L6 कशेरुकाओं के बीच पहलू संयुक्त श्रोणि सेही12सीमेट है । वैकल्पिक रूप से, L3 डीआरजी के बजाय l5 के लिए चुना जा सकता है, immunohistochemistry या पश्चिमी दाग13के रूप में विशेष रूप से परख के लिए, l5 डीआरजी के सर्जिकल जोखिम के रूप में आम तौर पर एक गहरे स्थान और अमीर रक्त की आपूर्ति के कारण महान कठिनाइयों मिलता है । इसके अलावा, पूरी सर्जरी रीढ़ की हड्डी और तंत्रिका जड़ सहित आसपास के डीआरजी हानिकारक संरचनाओं से बचना चाहिए । टिप्पण लायक दूसरा महत्वपूर्ण परिचालन कदम इंजेक्शन है । तेजी से हरे रंग जीन के समाधान के साथ मिलाया गया था निर्माण सुई से बेदखल समाधान कल्पना और डीआरजी में फैलाना । एक सफल इंजेक्शन फ्लोरोसेंट डाई द्वारा उल्लिखित एक स्पष्ट गोल आकार डीआरजी दिखाना चाहिए । अगर फ्लोरोसेंट डाई के साथ समाधान डीआरजी से बाहर लीक जबकि इंजेक्शन, एक पीठ और आगे ठीक-माइक्रो सुई की नोक की गहराई पर ट्यूनिंग डीआरजी कैप्सूल में सभी समाधान का पूरा इंजेक्शन सुनिश्चित कर सकते हैं । तीन से अधिक विभिंन साइटों पर डीआरजी impaling से बचें । इसके अलावा, हल्के रक्तस्राव आमतौर पर डीआरजी इंजेक्शन के बाद अपरिहार्य है, के रूप में DRGs कसकर रेते venosum13के साथ encapsulated हैं । यह खून बह रहा है ताकि वहाँ electroporation के दौरान इलेक्ट्रोड से डीआरजी की सतह को अछूता नहीं होगा बंद करने के लिए महत्वपूर्ण है । सफल electroporation विद्युत वर्तमान transduction पर निर्भर करता है, और पंजाबियों समाधान इलेक्ट्रोड पर लागू किया जा सकता है. अंत में, sciatic तंत्रिका पर साइट जहां संदंश के साथ कुचल दिया है माइक्रो suturing के साथ चिह्नित किया जाना चाहिए, क्योंकि चोट साइट माइक्रोस्कोप के नीचे अदृश्य है और छवि विश्लेषण के लिए axon पुनर्जनन के प्रारंभिक बिंदु के रूप में बाद में संकेत दिया जाना चाहिए । यदि क्रश साइट पर epineural टांका गाँठ पशु छिड़काव और विच्छेदन के बाद बंद हो जाता है, यह फिर से एक सीवन के साथ एक ही साइट लेबल पीएफए-फिक्स्ड तंत्रिका पर तुरंत जब क्रश-प्रेरित इंडेंट अभी भी पहचाने जाने योग्य है करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

अभिकर्मक तकनीक के अलावा, electroporation एक उच्च अभिकर्मक दर है । हमारे अध्ययन के मुताबिक vivo electroporation में microRNAs या siRNAs के बाद डीआरजी न्यूरॉन की अभिकर्मक दर ९०% के करीब है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, vivo electroporation में अब तक कम समय है वायरस की तुलना में खपत आधारित तरीकों, जो वांछित जीन का निर्माण के वायरस पैकेजिंग की आवश्यकता है । जहां तक हम जानते हैं, भले ही lipofectamine-vivo अभिकर्मक में आधारित electroporation से कम विषाक्तता है, lipofectamine पर काम नहीं करता है डीआरजी न्यूरॉन्स विशेष रूप से, न तो vivo में और न ही इन विट्रो में. उल्लेखनीय है, वर्तमान कार्यप्रणाली में कई तकनीकी सीमाएं हैं । सबसे पहले, सिरना प्रभावकारिता की अवधि नीचे दस्तक जीन के हित वायरस-plasmids के आधार पर वितरण की तुलना में कम है । इसलिए, electroporation से पशु बलि के लिए पूरी प्रक्रिया में 4-6 दिन14में समाप्त हो गया है । इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप के तहत किया सर्जरी अभ्यास और कुछ मैनुअल निपुणता की आवश्यकता है । एक नौसिखिया के लिए, सर्जरी की अवधि अक्सर अपेक्षा से अधिक है । संवेदनाहारी खुराक administrated माउस को सावधानी से नियंत्रित करने के लिए अवांछित मृत्यु दर को रोकने के लिए किया है । अंत में, sciatic तंत्रिका समतल axons के अतिव्यापी कारण जब epifluorescent इमेजिंग का आयोजन । इमेजिंग एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ unflatten नसों एक वैकल्पिक विकल्प है ।

Anatomically, डीआरजी संवेदी न्यूरॉन्स दो axonal शाखाओं है-परिधीय अवरोही शाखा और आरोही केंद्रीय रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय स्तंभ में पेश शाखा10. वर्तमान पद्धति भी रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय कॉलम के विशिष्ट लेबल से पता चलता है । इस प्रकार, एक ऐसी ही पद्धति को रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद संवेदी axon पुनर्जनन की जांच करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । ऊतक समाशोधन के साथ संयुक्त तकनीक11, पारंपरिक फोकल माइक्रोस्कोपी या हल्की चादर माइक्रोस्कोपी रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय स्तंभ के भीतर संवेदी axons के 3 डी खंगाला छवियों का निर्माण करने के लिए रिक्त स्पाइनल कॉर्ड के नमूने पर नियोजित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अध्ययन में वित्त पोषित (एफ-क्यू को संमानित किया गया । Z.) NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), क्रेग एच नेलसन फाउंडेशन और BrightFocus फाउंडेशन द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Square wave electroporation system BTX Harvard Apparatus 45-0052 For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes BTX Harvard Apparatus 45-0524 For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III Parker Instrumentation 1096 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller NARISHIGE PC-10
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. 1902328
Stereo Dissection Microscope Leica M80
Microsurgery Rongeur F.S.T 16221-14
Microsurgery Forceps FST by DUMONT, Switzerland 11255-20 Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary World Precision Instruments, Inc. TW100-4 10 cm, standard wall
Tape Fisherbrand 15-901-30 For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402 Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC003 Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 Dharmacon CP-004500-01-05 Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit Invitrogen Purelink K210016 GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye Millipore-Sigma F7252 For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine Putney, Inc NDC 26637-731-51 Anesthesia induction
Xylazine AnaSed NDC 59399-110-20 Anesthesia induction
Acetaminophen McNeil Consumer Healthcare NDC 50580-449-36 Post-surgical pain relief

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References

  1. Saijilafu,, et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
  2. Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
  3. Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
  4. Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
  5. Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
  6. Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
  7. Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  8. Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
  11. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
  12. Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
  13. Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
  14. Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३९ Electroporation पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि डीआरजी vivo में आनुवंशिक हेरफेर संवेदी ंयूरॉन axon पुनर्जनन परिधीय तंत्रिका चोट गैर वायरल अभिकर्मक
जांच स्तनधारी Axon पुनर्जनन: Vivo Electroporation <em>में</em> वयस्क माउस पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि
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Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Q.… More

Li, Q., Qian, C., Zhou, F. Q. Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion. J. Vis. Exp. (139), e58171, doi:10.3791/58171 (2018).

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