Undersøker pattedyr Axon gjenfødelse: I Vivo Electroporation av voksen mus Dorsal Root Ganglion

Summary

Electroporation er en effektiv tilnærming til å levere gener interesser i celler. Ved å bruke denne tilnærmingen i vivo på nervecellene i voksen mus dorsal root ganglion (DRG), beskriver vi en modell for å studere axon gjenfødelse i vivo.

Abstract

Electroporation er en viktig ikke-viral genet transfection å innføre DNA plasmider eller små RNA molekyler i celler. En sensorisk Nevron i dorsal root ganglion (DRGs) utvider et enkelt axon med to grener. En gren går til tilleggsutstyret nerve (eksterne gren), og den andre grenen inn ryggmargen gjennom dorsal root (sentrale gren). Etter nevrale skaden regenererer perifere grenen robust mens den sentrale grenen ikke regenereres. På grunn av den høye regenerative kapasiteten, har sensoriske axon gjenfødelse vært mye brukt som en modell for å studere pattedyr axon gjenfødelse både perifere nervesystemet (PNS) og sentralnervesystemet (CNS). Her beskriver vi en tidligere etablerte tilnærming protokoll for å manipulere genuttrykk i eldre sensoriske neurons i vivo via electroporation. Basert på hva med plasmider eller liten RNA-oligos (siRNAs eller microRNAs), gir tilnærmingen både tap og gevinst-av-funksjon eksperimenter for å studere roller av gener av interesser eller microRNAs i regulering av axon gjenfødelse i vivo. I tillegg kan manipulering av genet uttrykk i vivo kontrolleres både romlig og timelig i en relativt kort tid kurs. Denne modellen systemet gir et unikt verktøy for å undersøke molekylære mekanismer som pattedyr axon regenereringen er regulert i vivo.

Introduction

Skader i nervesystemet forårsaket av nevrale traumer eller forskjellige nevrodegenerative sykdommer som regel resultere i feil i motoren, sensoriske og kognitive funksjoner. Nylig har mye innsats vært viet til regenerativ styrke re-etablering i voksen neurons å gjenopprette den fysiologiske functionsof skadet neurons^1,2,3. Sensoriske neurons i DRG er en klynge av nerveceller som formidler ulike sensoriske stimuli, som smerte, temperatur, trykk eller kroppsstilling, til hjernen. Hver av disse neurons pseudo Unipolare og inneholder et enkelt axon som bifurcates med en gren mot periferien og den andre grenen vei mot ryggmargen⁴. Voksen sensoriske neurons i DRGs er blant noen eldre pattedyr neurons kjent å regenerere deres axons aktivt etter skader. Derfor har skader av sensoriske axons vært mye ansatt som avgjørende modell å studere mekanismer for axonal gjenfødelse i vivo.

I vivo genet transfection teknikker, som er vanligvis mindre tidkrevende å definere og mer fleksibelt enn bruke transgene dyr, har spilt viktige roller i å studere funksjonene av gener og signalnettverk trasé i nervesystemet. De viktigste teknikkene kan kategoriseres i to tilnærminger: instrument- og virus-baserte⁵. Viral-basert i vivo gen levering i voksen neurons kan gi nøyaktig spatiotemporal manipulasjon av gene expression⁶. Imidlertid er arbeidskrevende prosesser involvert i viral-baserte metoder, for eksempel produksjon og rensing av virus partikler som inneholder ønsket genet. I tillegg kunne mange viral vektorer aktivere immunsystemet til verten, som kan forstyrre datainnsamling, analyse og muligens villede tolkning av eksperimentelle resultater. Electroporation, en typisk instrument-baserte transfection tilnærming, bruker en elektrisk puls for å øke permeabilitet av cellen og kjernefysiske membraner transiently, noe som favoriserer tilstrømningen av genet vektorer eller liten RNA oligos fra plassen utenfor cellene⁷ . In vitro electroporation er anerkjent som en midlertidig, men svært effektive strategi for å manipulere målrettet genuttrykk i mange celletyper. Selv om i vivo electroporation fører bare til midlertidig genuttrykk med lav transfecting effektivitet sammenlignet med viral vektorer, har ulike fordeler over viral tilnærminger. Det kan for eksempel brukes til nesten alle^7,8,9-med vev og celler. I tillegg enten plasmider koding gener steder eller liten RNA oligos (f.eks siRNAs, microRNAs) mot visse utskrifter kan injiseres vevet direkte og deretter elektrisk pulserende, som gjør prosedyren mindre arbeids - og tid - forbruker. Videre er det mulig å transfecting flere plasmider og RNA oligos samtidig med enkel electroporation.

Vi har etablert en i vivo electroporation tilnærming for å manipulere genuttrykk i voksen mus sensoriske neurons og brukt og validert slik tilnærming i mange pioneer studier^{1,2,3 ,8,10}. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å lette bruken av denne tilnærmingen for fremtidige studier av pattedyr axon gjenfødelse.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med dyr protokollen godkjent av Johns Hopkins institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. materialer og reagenser

1. Dyr
   1. Bruk seks-uke-gamle kvinnelige CF1 mus veier 30-35 g for eksperimenter.
      Merk: Mus var gruppen plassert (5 mus per bur) i individuelt ventilert sterilisert bur med 1/4" korn cob senger og 2" firkant nestlets for nesting. Merdene ble opprettholdt i en kontrollert 12-h lys og mørke syklus og romtemperatur var mellom 19.4 ° C og 25 ° C. Mus ble matet med globale gnager kosthold og automatisk vann levere systemet.
2. Instrumenter
   1. Bruke følgende Kirurgiske instrumenter til å drive kirurgi: engangssprøyter (27 G, 1,0 mL) for intraperitoneal injeksjon, pels clipper, stereo disseksjon mikroskop, mikro-kirurgi tang, mikro-kirurgi saks og små ben rongeurs og sterilisert ikke vevede svamper.
      Merk: Alle instrumenter og materialer er autoklaveres før operasjonen eller pre-sterilisert av produsentene. Under kirurgi, er instrumentene sprayet med 75% alkohol å opprettholde sterilisering.
3. Anestesi løsninger
   1. Bruk bedøvende løsning #1 å indusere av bedøvelsen og bruke anestesi løsning #2 før DRG injeksjon for å opprettholde av bedøvelsen.
      1. For å gjøre bedøvende løsning #1, fortynne ketamin og xylazine i sterilt saltvann i en siste konsentrasjon av 10 mg/mL og 1.2 mg/mL.
      2. For å gjøre bedøvende løsning #2, fortynne avertin i sterilt saltvann på en siste konsentrasjon på 20 mg/mL.
4. Plasmider DNA og RNA Oligos
   1. Forberede plasmider bruke kommersielle kit etter produsentens protokoller tilsvarende. Fortynne plasmider DNAs i sterilt deionisert vann til konsentrasjonen av 2.0 µg/µL.
   2. Legge til Fast Green fargestoff løsning for å nå en siste konsentrasjon av 0.005-0,01% (v/v) for bedre visualisering av DRG disposisjonen under injeksjon.
   3. Oppløse den siRNA eller microRNA oligos i tilsvarende buffere levert av produsenter å nå en siste konsentrasjon på 50 µM.
5. Mikro-injeksjon Pipetter
   1. Trekk kapillær glasset med brønnene puller og kutte spissen av trakk kapillær glass pipette med mikrokirurgi saks til å generere en åpning med en omtrentlig 50 µm ytre diameter. Deretter sterilisere glass pipette under UV-lys på en ren benk i 20-30 min ca.
   2. Mount steriliserte glass pipette pipette holderen for koblet til en intracellulær microinjection dispensere systemet. Angi parametere av microinjection ved 30 psi press og 8 ms varighet.
6. Electroporation System
   1. Koble til elektrodene firkantbølge electroporation systemet og angi følgende parametere: 15 ms pulser på 35 V med 950 ms intervaller for i vivo electroporation.
7. Perfusjon og fikse løsning
   1. Oppløse den paraformaldehyde (PFA) pulveret i 1 x PBS i en konsentrasjon av 4% (w/v). Lagre PFA løsningen på 4 ° C.

2. eksperimentelle prosedyrer

1. Kirurgisk eksponering L4 og L5 DRGs
   1. Bedøve musen bruker en intraperitoneal injeksjon av bedøvende løsningen #1 forberedt tidligere (med ketamin 100 mg/kg kroppsvekt og xylazine 12 mg/kg kroppsvekt).
   2. Barbere det kirurgiske området med pels clipper.
      Merk: Siden det vil være en annen kirurgi for venstre ischias nerven knuse, pelsen til venstre bakre lår kan barberes samtidig.
   3. Plasser musen på oppvarmet teppet (35.0 ° C) og overvåke endetarms temperatur med en temperatur probe.
   4. For å teste anestesi, knip tærne og halen av musen og observerer til atferdsdata svar.
   5. Tape fire lemmer av musen på corkboard.
   6. Tørk det kirurgiske området med iodophor løsning og deretter med 75% alkohol å fjerne iodophor før kutte huden.
   7. Bruk ophthalmica salve øyne å hindre tørrhet under anestesi.
   8. Før snitt, merke begge sider av iliaca toppene med en fin markør pennen. Tegne en linje som kobler sammen to punkt iliaca hopp til rette identifiserer plasseringen av L5 DRGs.
   9. Gjør en 3 cm snitt langs midtlinjen av lav rygg med mikro-saks. Videre koble paraspinous musklene, som musculus multifidus og musculus longissimus lumborum, fra L3 S1 spinous prosesser, og utsette fasett leddene i L4-5 og L5-6.
   10. Bruk en mikro-rongeur for å fjerne fasett leddene i L4-5 og L5-6. Videre fjerne venstre neural buen av L4 og L5 å avsløre dorsal side av DRGs.
2. DRG injeksjon
   1. Injisere bedøvende løsning #2 (med avertin 200 mg/kg kroppsvekt) intraperitoneally å opprettholde anestesi før DRG injeksjon.
   2. Last DNA plasmider eller RNA oligos (1 µL per DRG) i glass kapillær pipette.
   3. Sett tuppen av kapillær glass pipette nøye inn DRG.
   4. Injisere gradvis 1.0 µL løsning av DNA plasmider eller RNA oligos i DRG bruker intracellulær microinjection dispensere systemer (30 psi, 8 ms).
      Merk: Varigheten av injeksjon skal vare ikke mindre enn 5 minutter.
3. Electroporation
   1. Slipp PBS på tips av elektrodene.
   2. Rydd blødningen med sterilisert kvadrat bomull gasbind.
   3. Knip målet DRG med elektrodene forsiktig og bruk 5 firkantet elektriske pulser med electroporation system.
   4. Lukk muskler og hud lag henholdsvis med 5-0 nylon sømmer.
   5. Plasser musen på en oppvarmet teppe (35.0 ° C) under hensyn til har helt ny tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Tilbake musen til hjem buret etter at det har helt utvinnes av bedøvelsen.
      Merk: Det tar ca 60 min musen du fullstendig gjenopprette bedøvelsen på 37 ° C teppet. Oppløse en pille (200 mg) ibuprofen til 1000 ml vann (0,2 mg/ml) for daglig fôring for å lindre den post-kirurgiske smerten.
4. Sciatic Nerve knuse
   1. To eller tre dager (avhengig av eksperimentell design) etter den DRG electroporation, bedøve musen intraperitoneally med bedøvende løsning #2 (med avertin 400 mg/kg kroppsvekt).
   2. Tape fire lemmer av musen på corkboard.
   3. Gjøre en 1 cm snitt 0,5 cm til venstre langs midtlinjen. Kuttet musklene, som gluteus maximus muskel og piriformis muskelen, langs. Utsett segmentet av ischias nerven mellom den større sciatic foramen og sciatic hakket.
   4. Knuse nerve med mikrokirurgi tang for 12 s og merke knuse området med en 10-0 nylon epineural Sutur. Lage en knute på dural membranen merke området knuse.
   5. Lukk muskler og hud lag med 5-0 nylon Sutur.
   6. Plasser musen på en oppvarmet teppe (35.0 ° C) med hensyn til det har helt gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Tilbake musen til hjem buret etter at det har helt utvinnes av bedøvelsen.
      Merk: Det tar ca 60 min musen du fullstendig gjenopprette bedøvelsen på 37 ° C teppet. Oppløse en pille (200 mg) ibuprofen til 1000 ml vann (0,2 mg/ml) for daglig fôring for å lindre den post-kirurgiske smerten.
5. Musen perfusjon og DRG Sciatic Nerve Harvest
   1. To eller tre dager etter sciatic nerve knuse (avhengig av eksperimentell design), bedøve musen intraperitoneally med bedøvende løsning #2.
   2. Perfuse musen transcardially med PBS (pH 7.4) etterfulgt av iskalde 4% paraformaldehyde (PFA) (pH 7.5) i PBS.
   3. Etter perfusjon, Skill DRGs nerve røttene og sciatic nerve før kneet nøye med mikro-saks og mikro-tang under disseksjon mikroskop. Plass sciatic nerve direkte i 4% PFA overnatting på 4 ° C.
6. Imaging og måle fluorescens-merket sensoriske Axons
   1. Stripe av tilknyttede vev og membran på fast sciatic nerve mikro-saks og mikro-tang nøye under disseksjon mikroskop. Deretter utveksle 4% PFA med PBS og vask nerve tre ganger.
   2. Plasser sciatic nerve i et lysbilde og holde den rett. Legg 80 µL antifade løsning rundt nerve, så legge en dekkglassvæske på den. Flat hele montert vevet press.
   3. Plass flattened vev på invertert epifluorescent mikroskopet utstyrt med tilbehør for mosaikk oppkjøp og bildebehandling.
      Merk: Eksitasjon og utslipp lengder er 488 nm og 509 nm. Det er også mulig å ta flere overlappende bilder manuelt og sette bildene sammen med ImageJ med mosaikk plug-in.
   4. Ved måling av lengden på Spartments axons, spore alle identifiable fluorescently-merket axons i sciatic nerve fra webområdet knuse (merket med 10-0 epineural Sutur) til distale axon ender.

Representative Results

Å kvantifisere cytotoksisitet gjeldende protokollen og til å validere at transfection i vivo DRG electroporation er høy nok, vi injisert og electroporated fluorescently-merket microRNA eller siRNA i L4 og L5 DRGs. De frittliggende DRGs ble behandlet gjennom cryo-skjæring og immunohistochemistry (figur 1A-B). Ved beregning celle overlevelse etter injeksjon og electroporation, var de intakt DRGs fra L4 og L5 høstet og behandlet gjennom cryo-skjæring og immunohistochemistry. De Nevron tettheter, vises med Tuj1 flekker, viste ikke en betydelig forskjell i forhold til Nevron tettheter på intakt DRGs, som indikerer at electroporation ikke indusere neuronal celledød (figur 1C). Er beregnet på transfection som forholdet mellom antall merket RNA oligo nevroner og antall Tuj1-positive nevroner. Mener transfection er miRNA 80.7 ± 4,3% og siRNA 94.2 ± 0,3% (figur 1D). Når den gjeldende i vivo electroporation metoden å studere axon gjenfødelse, var ischias nerven flat og fotografert. Hver Spartments axon med karakteristiske bane og gjenkjennelig distale axon slutt kan spores fra knuse området angitt av Sutur knuten (figur 2). I tillegg vi electroporated DRGs med EGFP plasmider og høstet ryggmarg fra T7 til L2 sammen med dorsal røtter L4 og L5 etter 7 dager. Vi brukte en veletablert vev fjerne protokoll-uDISCO å fjerne ryggmargen¹¹. EGFP-merket rygg kolonnen axons i ryggmargen ble fotografert med AC confocal mikroskop og deretter identifisert i både den langsgående og sagittal projisere bilder (Figur 3). AC confocal bilder kan også behandles med mikroskopi visualisering programvare å rekonstruere et 3D-bilde (film 1).

Figur 1 : Immunhistokjemi av DRG cryo-seksjonen etter electroporation fluorescently-merket uspesifisert microRNA eller siRNA i vivo. (A) representant cryo-delen av DRG vev injisert og electroporated med fluorescently-merket (Dy547) ikke-målet microRNAs. Venstre bilde: bildet av lysrør (rød farge) fluorescently-merket (Dy547) ikke-målet microRNAs. Midterste bildet: immuno-flekk (grønn fargen) av Tuj1 med en Alexa488 fluorophore på videregående antistoffer. Høyre bilde: det sammenslåtte bildet av de forrige to kanalene. Skala bar = 100 µm.(B) representant cryo-delen av DRG vev injisert og electroporated med fluorescently-merket (Cy3) ikke-målet siRNAs. Venstre bilde: bildet av lysrør (rød farge) fluorescently-merket (Cy3) ikke-målet siRNAs. Midterste bildet: immuno-flekk (grønn fargen) av Tuj1 med en Alexa488 fluorophore på videregående antistoffer. Høyre bilde: det sammenslåtte bildet av de forrige to kanalene. Skalaen bar representerer 100 µm. (C) Nevron tettheten av en intakt DRG cryo-delen er 809.6 ± 14.2 celler/mm² (N = 6) og en injisert DRG cryo-delen er 801.6 ± 27,4 celler/mm² (N = 6), mener ± SEM, Student t-test, NS: ingen betydning. Tre mus ble utført i vivo DRG electroporation på venstre L4 og L5 DRGs med merket siRNA. Både venstre og høyre L4 og L5 DRGs er høstet etter 48 timer og behandlet gjennom cryo-delen og immunohistochemistry. Hver DRG har blitt delt i omtrentlig 60 skiver og tykkelsen av stykket er 10 μm. Tre skiver av hver DRG er valgt av 200 μm og gjennomsnitt. (D) hva frekvensen av merket miRNA er 80.7 ± 4,3% (N = 4) og den merket siRNA 94.2 ± 0,3% (N = 6), mener ± SEM. Tre mus ble utført i vivo DRG electroporation på venstre L4 og L5 DRGs merket siRNA og to mus med merket miRNA. DRGs er høstet etter 48 timer og behandlet gjennom cryo-delen og immunohistochemistry. Hver DRG har blitt delt i omtrentlig 60 skiver og tykkelsen av stykket er 10 μm. Tre skiver av hver DRG er valgt av 200 μm og gjennomsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Ectopically uttrykt EGFP viser regenerert neuronal axons i sciatic nerve etter knusende skade. Axons i en flat sciatic nerve led av knuse skade er merket med EGFP (grønn fluorescens) transportert fra somas til axons. Den røde linjen angir plasseringen av knusing skade området, som var opprinnelig kirurgisk preget av en suturing knute. Hvitt pilhode, pil og star angir tre særegne axon ender, som strekker seg fra webområdet knuse. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Projeksjon bilder av EGFP-uttrykke axons i ryggmargen etter i vivo electroporation av DRGs. (A) langsgående projeksjon av EGFP-merket axons innenfor kolonnen dorsal og L4/L5 dorsal røttene. Innfelt bilder A1 og A2 viser forstørrede visninger av to rektangulære områder i panelet (A). A1 viser en detaljert visning av axons i rygg kolonnen. A2 har en detaljert visning av axons i dorsal root oppføring sonen (DREZ). Skala bar = 200 µm. (B) Sagittal projeksjon av EGFP-merket axons i rygg kolonnen. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Film 1: 3D rekonstruksjon av EGFP-uttrykke axons i ryggmargen etter i vivo electroporation av DRGs. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Flere kirurgisk trinnene krever spesiell oppmerksomhet. L4 og L5 DRGs (plassering av somas), som dominerer sciatic nerve, må være korrekt identifisert og injisert med gene konstruksjoner. Ellers GFP-merkingen vil være fraværende i sciatic nerve axons. Iliaca toppene kan vises som nyttig anatomiske landemerker å finne L4 og L5 DRGs. I de fleste mus er fasett felles mellom L5 og L6 vertebrae proximate til iliaca toppene¹². Alternativt kan L3 DRG velges i stedet for L5, spesielt for analyser som immunohistochemistry eller western blot¹³, som kirurgiske eksponering av L5 DRG vanligvis møter store vanskeligheter på grunn av en dyp plassering og rikt blod forsyning. Hele operasjonen bør også unngå skadelige DRG omkringliggende strukturer, inkludert ryggmargen og nerve rot. Andre viktige operative trinn bemerkelsesverdig er injeksjon. Fast Green fargestoff ble blandet med løsning av genet konstruksjoner å visualisere løsningen ut fra nålen og diffus i DRG. En vellykket injeksjon skal vise en klar runde-figur DRG skissert av fluorescerende fargestoff. Hvis løsningen med fluorescerende farge lekker fra DRG mens sprøytebruk, kan en rygg-og-frem finjustering på dybden av spissen av mikro-nål sikre komplett injeksjon av alle løsning i DRG kapselen. Unngå impaling DRG mer enn tre ulike steder. Videre, mild blødning er vanligvis uunngåelig etter DRG injeksjon, som DRGs er strengt innkapslet med rete venosum¹³. Det er viktig å opphøre blø slik at det ikke blir blod isolerende overflaten av DRG fra elektroder under electroporation. Vellykket electroporation avhenger av elektrisk gjeldende signaltransduksjon og PBS løsning kan brukes på elektroden. Endelig området på sciatic nerve der er knust med tang skal merkes med mikro-suturing, fordi skaden nettstedet er usynlig under mikroskopet og må angis som startpunktet for axon regenerering for bildeanalyser senere. Hvis epineural Sutur knuten på webområdet knuse faller etter dyr perfusjon og disseksjon, er det viktig å merke det samme området med en Sutur umiddelbart på PFA-fast nerve når knuse-indusert innrykket identifiseres fremdeles.

Blant transfection teknikker har electroporation en høyere transfection rate. Ifølge vår studie transfection DRG Nevron for microRNAs eller siRNAs etter i vivo electroporation er nær 90%. Enda viktigere er i vivo electroporation langt mindre tidkrevende enn virus-basert metoder, som krever virus pakking av ønsket genet konstruksjoner. Så vidt vi vet, selv om lipofectamine-basert i vivo -hva har mindre toksisitet enn electroporation, lipofectamine fungerer ikke på DRG neurons spesielt, verken i vivo eller i vitro. Merke, gjeldende metoder har flere tekniske begrensninger. Først er varigheten av siRNA effekt banket ned genet steder kortere enn virus-basert levering av plasmider. Derfor har hele prosedyren fra electroporation til dyr offer ferdig i 4-6 dager¹⁴. I tillegg krever kirurgi utført under mikroskopet praksis og noen fingerferdighet. For en nybegynner er kirurgi varigheten ofte lenger enn forventet. Anestesi dosen administreres til musen har å bli nøye kontrollert for å hindre uønskede dødelighet. Til slutt, sammenslåing sciatic nerve årsaker overlapping av axons når du utfører epifluorescent bildebehandling. Bildebehandling sammenslåtte nerver med AC confocal mikroskop er et alternativ.

Anatomisk, har DRG sensoriske neurons to axonal grener - den eksterne nedadgående grenen og stigende sentrale grenen prosjektering i kolonnen dorsal ryggmargen¹⁰. Gjeldende metoder viser også karakteristiske merking av rygg kolonnen i ryggmargen. Dermed kan en lignende metode brukes som en modell for å undersøke sensoriske axon regenerasjon etter ryggmargsskade. Kombinert med vev-clearing teknikker¹¹, kan konvensjonelle AC confocal mikroskopi eller lys arks mikroskopi anvendes på ryddet ryggmargen prøven å bygge 3D rekonstruert bilder av sensoriske axons i rygg kolonnen i ryggmargen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief