Utredande däggdjur Axon regenerering: In Vivo elektroporation av vuxen mus dorsalrotsganglier Ganglion

Summary

Elektroporation är en effektiv strategi att leverera gener av intressen i celler. Genom att tillämpa denna strategi i vivo på nervceller i vuxen mus dorsalrotsganglier ganglion (DRG), beskriver vi en modell för att studera axon förnyelse i vivo.

Abstract

Elektroporation är ett viktigt icke-virala gen transfection förhållningssätt att införa DNA plasmider eller små RNA-molekyler i cellerna. En sensoriska neuron i dorsalrotsganglier ganglion (DRGs) sträcker sig en enda axon med två grenar. En gren går till perifera nerver (perifer gren), och den andra grenen går in i ryggmärgen genom dorsalrotsganglier (central branch). Efter neurala skadan regenererar grenen perifera kraftfullt medan den centrala grenen inte regenererar. På grund av den höga regenerativa kapaciteten, har sensoriska axon regenerering använts som ett modellsystem studera däggdjur axon förnyelse i både det perifera nervsystemet (PNS) och det centrala nervsystemet (CNS). Här beskriver vi ett tidigare etablerade tillvägagångssätt protokoll för att manipulera genuttryck i mogen sensoriska nervceller i vivo via elektroporation. Baserat på transfection med plasmider eller små RNA oligos (siRNAs eller mikroRNA), möjliggör metoden både förlust - och gain-of-function-experiment för att studera gener-av-intressen eller mikroRNA i regleringen av axon förnyelse i vivoroller. Dessutom kan manipulation av gen uttryck i vivo styras både spatialt och temporalt inom en relativt kort tid kurs. Denna modellsystem ger ett unikt verktyg för att undersöka de molekylära mekanismer som däggdjur axon regenerering är reglerade i vivo.

Introduction

Skador i nervsystemet orsakade av neurala trauma eller olika neurodegenerativa sjukdomar som vanligtvis resulterar i defekter i motoriska, sensoriska och kognitiva funktioner. Mycket möda har nyligen ägnats åt regenerativ potens re-establishment i vuxen nervceller att återställa den fysiologiska functionsof skadade nervceller^1,2,3. Sensoriska nervceller i DRG är ett kluster av nervceller som förmedlar olika sensoriska stimuli, såsom smärta, temperatur, beröring eller kroppshållning, till hjärnan. Var och en av dessa nervceller är pseudo unipolär och innehåller en enda axon som bifurcates med en filial utökas mot periferin och den andra grenen på väg mot ryggmärgen⁴. Adult sensoriska nervceller i DRGs är bland några mogna däggdjur nervceller känt att regenerera deras axoner aktivt efter skada. Därför har skador av sensoriska axoner flitigt använts som avgörande modell att studera mekanismerna i axonal förnyelse i vivo.

In vivo gen transfection tekniker, vilket är vanligtvis mindre tidskrävande att ställa in och mer flexibla än med transgena djur, har spelat viktiga roller i studera funktionerna av gener och signalering utbildningsavsnitt i nervsystemet. De viktigaste teknikerna kan delas in i två tillvägagångssätt: instrumentet- och virus-baserade⁵. Viral-baserade i vivo gen leverans i vuxen nervceller kan ge exakta spatiotemporal manipulation av gen uttryck⁶. Dock är arbetsintensiva processer involverade i viral-baserade metoder, såsom produktion och rening av viruspartiklar som innehåller den önskade genen. Dessutom kunde många virala vektorer aktivera immunsystemet hos värden, vilket kan störa datainsamling, dataanalys och eventuellt vilseleda tolkning av experimentella resultat. Elektroporation, en typisk instrument-baserade transfection strategi, använder en elektrisk puls att öka permeabiliteten i cell- och kärn membran normalnivå, vilket gynnar tillströmningen av genen vektorer eller små RNA oligos från utrymme utanför cellerna⁷ . In vitro elektroporation är allmänt erkänd som en övergående men mycket effektiv strategi för att manipulera riktade genuttryck i många celltyper. I vivo elektroporation leder bara till övergående genuttryck med låg transfecting effektivitet jämfört med virala vektorer, har men olika fördelar över viral strategier. Det kan exempelvis användas till nästan alla vävnader och celler^7,8,9. Dessutom antingen plasmider kodning gener-of-intresse eller små RNA oligos (t.ex. siRNAs, mikroRNA) mot vissa avskrifter kan injiceras i målvävnaden direkt och sedan elektriskt pulsade, som göra förfarandet mindre arbets - och tid tidskrävande. Det är dessutom möjligt att transfecting flera plasmider och RNA oligos samtidigt med enda elektroporation.

Vi har etablerat en in vivo elektroporation-metod för att manipulera genuttryck i vuxen mus sensoriska nervceller och tillämpats och validerade sådant tillvägagångssätt i många banbrytande studier^{1,2,3 ,8,10}. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att underlätta användningen av denna strategi för framtida studier av däggdjur axon regenerering.

Protocol

Alla djurförsök har utförts i enlighet med protokollet djur godkänts av Johns Hopkins institutionella djur vård och användning kommittén.

1. material och reagenser

1. Djur
   1. Använd sex veckor gamla CF1 honmöss väger 30 – 35 g för experiment.
      Obs: Mössen var gruppen-inrymt (5 möss per bur) i individuellt ventilerade steriliserad burar med 1/4 ”corn cob sängkläder och 2” fyrkantig nestlets för sin häckning. Burarna bibehölls i en kontrollerad 12-h ljus-mörker cykel och rumstemperaturen var mellan 19,4 ° C och 25 ° C. Möss matades med globala gnagare kost och automatisk vatten levererar system.
2. Instrument
   1. Använda följande kirurgiska instrument för att effektivt genomföra operationen: engångssprutor (27 G, 1,0 mL) för intraperitoneal injektion, päls clipper, stereo dissektion Mikroskop, mikro-kirurgi pincett, mikro-kirurgi sax och små ben rongeurs och steriliserad icke-vävda svampar.
      Obs: Alla instrument och material är Ånghärdad före operation eller försteriliserade av producenterna. Under operation besprutas instrument som med 75% alkohol att upprätthålla sterilisering.
3. Bedövningsmedel lösningar
   1. Använda bedövningsmedel lösning #1 att framkalla anestesi och använda anestesi lösning #2 före DRG injektion till underhåll av anestesi.
      1. För att göra bedövningsmedel lösning #1, späd ketamin och xylazin i steril koksaltlösning på en slutlig koncentration på 10 mg/mL och 1,2 mg/mL.
      2. För att göra bedövningsmedel lösning #2, späd avertin i steril koksaltlösning på en slutlig koncentration på 20 mg/mL.
4. Plasmid DNA och RNA Oligos
   1. Förbereda de plasmider som använder kommersiella kit efter tillverkarens protokollen med detta. Späd plasmiden DNAs i sterilt avjoniserat vatten till koncentrationen av 2,0 µg/µL.
   2. Tillsätt snabbt grönt färgämne lösning för att nå en slutlig koncentration på 0,005-0,01% (v/v) för bättre visualisering av DRG dispositionen under injektionen.
   3. Lös den siRNA eller mikroRNA oligos i motsvarande buffertar som tillhandahålls av tillverkarna att nå en slutlig koncentration på 50 µM.
5. Mikroinjektion pipett
   1. Dra av kapillär glaset med hjälp av en mikropipett avdragare och skär spetsen av drog kapillär glas pipetten med mikrokirurgi sax för att generera en öppning med en ungefärlig ytterdiameter 50 µm. Sedan steriliseras glas pipetten under UV-ljus på en ren bänk för 20 – 30 min ungefär.
   2. Mount steriliserad glas pipetten på hållaren pipett ansluten till en intracellulär Mikroskop avstå från systemet. Ange parametrarna för Mikroskop systemet vid 30 psi tryck och 8 ms varaktighet.
6. Elektroporation System
   1. Anslut elektroderna till fyrkantsvåg elektroporation systemet och ange följande parametrar: 15 ms pulser på 35 V med 950 ms intervall för i vivo elektroporation.
7. Perfusion och fastställande lösning
   1. Lös PARAFORMALDEHYD (PFA) pulvret i 1 x PBS vid en koncentration på 4% (w/v). Lagra PFA lösningen vid 4 ° C.

2. experimentella rutiner

1. Kirurgisk exponering av L4 och L5 DRGs
   1. Söva musen använder en intraperitoneal injektion av bedövningsmedel lösning #1 förberett tidigare (med ketamin 100 mg/kg kroppsvikt och xylazin 12 mg/kg kroppsvikt).
   2. Raka det kirurgiska området med päls clipper.
      Obs: Eftersom det blir en annan operation för vänster ischiasnerven crush, päls av vänster bakre låret kan vara rakad samtidigt.
   3. Placera musen på den uppvärmd filten (35,0 ° C) och övervakning av rektal temperatur med en temperatursond.
   4. Att testa anestesi, nypa tårna och svans av musen och iaktta de beteendemässiga svar.
   5. Tejpa med musen på anslagstavlan fyra lemmar.
   6. Torka det kirurgiska området med iodophor lösning och sedan med 75% alkohol för att ta bort iodophor innan skära huden.
   7. Applicera oftalmologiska salva på ögon att förhindra torrhet under anestesi.
   8. Innan snittet, markerar du båda sidor av iliaca kammar med en fin tuschpenna. Rita en linje som förbinder två punkter av iliaca kammar att underlätta att identifiera positionerna för L5 DRGs.
   9. Gör en 3 cm snitt längs mittlinjen av låg rygg med mikro-sax. Dessutom lossa muskler i paraspinous, såsom den musculus multifidus och den musculus longissimus lumborum, från L3 till S1 spindelkrabba processer, och exponera facettleder L4-5 och L5-6.
   10. Använd en mikro-rongeur ta bort facettleder L4-5 och L5-6. Dessutom bort vänster neural fotvalvet L4 och L5 för att exponera den dorsala sidan av DRGs.
2. DRG injektion
   1. Injicera bedövningsmedel lösning #2 (med avertin 200 mg/kg kroppsvikt) intraperitonealt att upprätthålla anestesi före DRG injektion.
   2. Fyll på DNA plasmider eller RNA oligos (1 µL per DRG) i glas kapillär pipetten.
   3. Sätt spetsen på kapillär glas pipetten noga i DRG.
   4. Injicera gradvis 1,0 µL lösningen av DNA plasmider eller RNA oligos in den DRG använder den intracellulära Mikroskop avstå från system (30 psi, 8 ms).
      Obs: Varaktigheten av injektionen bör pågå inte mindre än 5 minuter.
3. Elektroporation
   1. Droppe PBS på tips av elektroderna.
   2. Städa upp blödningen med steriliserad fyrkantig bomull gasväv.
   3. Nypa målet DRG med elektroderna försiktigt och tillämpa 5 kvadrat elektriska pulser med elektroporation systemet.
   4. Stäng den muskel och hud lagren respektive med 5-0 nylon suturer.
   5. Placera musen på en uppvärmd filt (35,0 ° C) under stor uppmärksamhet tills den helt har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Återgå musen till buren efter det har återhämtat sig helt från anestesi.
      Obs: Det tar ungefär 60 min för musen att helt återhämta sig från anestesi på 37 ° C filten. Lös ett piller (200 mg) ibuprofen till 1 000 ml vatten (0,2 mg/ml) för daglig utfodring för att lindra den postoperativa smärtan.
4. Ischiasnerven Crush
   1. Två eller tre dagar (beroende på experimentell design) efter den DRG elektroporation, söva musen intraperitonealt med bedövningsmedel lösning #2 (med avertin 400 mg/kg kroppsvikt).
   2. Tejpa med musen på anslagstavlan fyra lemmar.
   3. Gör en 1 cm snitt 0,5 cm på vänster sida längs mittlinjen. Skär musklerna, såsom gluteus maximus muskeln och piriformis muskeln, longitudinellt. Exponera segmentet av ischiasnerven mellan ökad ischiasnerven foramen och ischiasnerven skåran.
   4. Krossa nerven med mikrokirurgi pincett för 12 s och märket crush platsen med en 10-0 nylon epineurala suturen. Gör en knut på dural membranet att markera webbplatsen crush.
   5. Stäng den muskel och hud lagren med 5-0 nylon sutur.
   6. Placera musen på en uppvärmd filt (35,0 ° C) med stor uppmärksamhet tills den helt har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Återgå musen till buren efter det har återhämtat sig helt från anestesi.
      Obs: Det tar ungefär 60 min för musen att helt återhämta sig från anestesi på 37 ° C filten. Lös ett piller (200 mg) ibuprofen till 1 000 ml vatten (0,2 mg/ml) för daglig utfodring för att lindra den postoperativa smärtan.
5. Mus Perfusion, DRG och ischiasnerven skörd
   1. Två eller tre dagar efter ischiasnerven krossa (beroende på experimentell design), söva musen intraperitonealt med bedövningsmedel lösning #2.
   2. BEGJUTA mus transcardially med PBS (pH 7,4) följt av iskall 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (pH 7,5) i PBS.
   3. Efter perfusion, separat i DRGs tillsammans med nervrötter och ischiasnerven innan knäet noggrant med mikro-sax och mikro-pincett under mikroskopet dissektion. Placera ischiasnerven direkt i 4% PFA övernattning vid 4 ° C.
6. Imaging och mäta fluorescens-märkt sensoriska axoner
   1. Remsor av den bifogade vävnaden och membran på fasta ischiasnerven med mikro-sax och mikro-tången noggrant under mikroskopet dissektion. Sedan utbyta 4% PFA med PBS och tvätta nerven tre gånger.
   2. Placera ischiasnerven i en bild och hålla den rak. Tillsätt 80 µL antifade lösning runt nerven, sedan låg ett täckglas på den. Platta till hela monterade vävnaden med tryck.
   3. Placera flattened vävnader på mikroskopet inverterad epifluorescent utrustad med ett tillbehör för mosaik förvärv och bildbehandling.
      Obs: Excitation och utsläpp längderna är 488 nm och 509 nm. Det är också möjligt att ta flera överlappande bilder manuellt och sy bilder tillsammans med mosaiken plug-in ImageJ.
   4. När man mäter längden på regenererad axoner, spåra alla identifierbara fluorescently-märkt axoner i ischiasnerven från webbplatsen crush (markerade med 10-0 epineurala suturen) till distala axonet ändarna.

Representative Results

Att kvantifiera cytotoxicitet av det nuvarande protokollet och att validera att transfection i vivo DRG elektroporation är tillräckligt hög, vi injiceras och electroporated fluorescently-taggade mikroRNA eller siRNA i L4 och L5 DRGs. De fristående DRGs bearbetades genom cryo-snittning och immunohistokemi (figur 1A-B). När du uppskattar cell överlevnaden efter injektionen och elektroporation, var de intakt DRGs från L4 och L5 skördas och bearbetas genom cryo-snittning och immunohistokemi. De neuron densiteterna, återspeglas med Tuj1 färgning, visade inte en signifikant skillnad jämfört med den neuron täthet av intakt DRGs, vilket indikerar att elektroporation inte inducerade neuronal celldöd (figur 1C). Transfection var beräknad som förhållandet mellan antalet märkta RNA oligo neuroner och antalet Tuj1-positiv neuroner. MiRNA är genomsnittlig transfection 80.7 ± 4,3% och siRNA 94,2 ± 0,3% (figur 1D). När du tillämpar den nuvarande i vivo elektroporation metoden för att studera axon regenerering, var ischiasnerven tillplattad och avbildas. Varje regenererad axon med distinkt bollbana och igenkännlig distala axonet avslutas kan spåras från crush webbplatsen anges av suturen Knut (figur 2). Dessutom kan vi electroporated DRGs med andra plasmider och skördas ryggmärgen från T7 till L2 tillsammans med dorsal rötter L4 och L5 efter 7 dagar. Använde vi en väletablerad vävnad clearing protokoll — uDISCO att rensa ryggmärgen¹¹. Den andra-märkt dorsala kolumnen axoner i ryggmärgen var avbildas med en confocal Mikroskop och sedan identifierat både i det längsgående och sagittal projicera bilderna (figur 3). Alternativt kan confocal bilderna bearbetas med mikroskopi visualiseringsprogram att rekonstruera en 3D-bild (film 1).

Figur 1 : Immunohistokemi DRG cryo-avsnitt efter elektroporation av fluorescently-tagged icke-specifika mikroRNA eller siRNA i vivo. (A) representant cryo-avsnitt av DRG vävnad injiceras och electroporated med fluorescently-märket (Dy547) icke-målorganismer mikroRNA. Vänstra bilden: bilden av fluorescerande signalen (röd färg) av fluorescently-märkta (Dy547) icke-målorganismer mikroRNA. Mellersta bilden: immuno-färgning (grön färg) av Tuj1 med en Alexa488 fluorophore på den sekundära antikroppen. Högra bilden: den sammanlagda bilden av de föregående två kanalerna. Skalstapeln = 100 µm.()B) representant cryo-avsnitt av DRG vävnad injiceras och electroporated med fluorescently-taggade (Cy3) icke-målorganismer siRNAs. Vänstra bilden: bilden av fluorescerande signalen (röd färg) av fluorescently-märkta (Cy3) icke-målorganismer siRNAs. Mellersta bilden: immuno-färgning (grön färg) av Tuj1 med en Alexa488 fluorophore på den sekundära antikroppen. Högra bilden: den sammanlagda bilden av de föregående två kanalerna. Skala bar representerar 100 µm. (C) neuron tätheten av ett intakt DRG cryo-avsnitt är 809.6 ± 14,2 celler/mm² (N = 6) och en injicerade DRG cryo-avsnitt är 801.6 ± 27,4 celler/mm² (N = 6), menar ± SEM, Student's t-test, NS: ingen betydelse. Tre möss var utförda i vivo DRG elektroporation på vänster L4 och L5 DRGs med märkta siRNA. Både vänster och höger L4 och L5 DRGs skördas efter 48 h och bearbetas genom cryo-avsnitt och immunohistokemi. Varje DRG har varit sektioneras i ungefärlig 60 skivor och tjockleken på segmentet är 10 μm. Tre skivor av varje DRG väljs av 200 μm och i genomsnitt. (D), andelen transfection den märkta miRNA är 80.7 ± 4,3% (N = 4) och den märkta siRNA är 94,2 ± 0,3% (N = 6), menar ± SEM. Tre möss var utförda i vivo DRG elektroporation på vänster L4 och L5 DRGs med märkta siRNA och två möss med märkta miRNA. DRGs skördas efter 48 h och bearbetas genom cryo-avsnitt och immunohistokemi. Varje DRG har varit sektioneras i ungefärlig 60 skivor och tjockleken på segmentet är 10 μm. Tre skivor av varje DRG väljs av 200 μm och i genomsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Ectopically uttryckta andra visar regenereras nervcellernas axoner i ischiasnerven efter krossning skada. Axoner i en tillplattad ischiasnerven lidit från crush skada är märkta med andra (grön fluorescens) transporteras från somas till axoner. Den röda linjen anger positionen för krossning skadan webbplats, som markerades ursprungligen opereras av en suturering Knut. Den vita pilspets, pilen stjärnigt anger tre distinkta axon ändar, som sträcker sig från webbplatsen crush. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3 : Projektion bilder av andra-uttryckande axoner i ryggmärgen efter i vivo elektroporation av DRGs. (A) längsgående projektion av andra-märkt axoner inom den dorsala kolumnen och L4/L5 dorsala rötter. Infälld bilder A1 och A2 Visa förstorade vyer av de två rektangulära områden markeras i panelen (A). A1 uppvisar en detaljerad vy av axoner i dorsala kolumnen. A2 uppvisar en detaljerad vy av axoner i zonen dorsalrotsganglier inträde (DREZ). Skalstapeln = 200 µm. (B) Sagittal projektion av andra-märkt axoner inom den dorsala kolumnen. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Film 1: 3D rekonstruktion av andra-uttryckande axoner i ryggmärgen efter i vivo elektroporation av DRGs. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Flera kirurgiska steg kräver särskild uppmärksamhet. Den L4 och L5 DRGs (plats somas), som dominerar ischiasnerven, behöver korrekt identifieras och injiceras med gen konstruktioner. Annars GFP-märkning kommer att vara frånvarande i ischiasnerven axoner. Iliaca kammar kan ses som användbar anatomiska landmärken att lokalisera L4 och L5 DRGs. I de flesta möss är aspekten som är gemensamma mellan L5 och L6 Kotor närliggande till iliaca kammar¹². Alternativt, L3 DRG kan väljas i stället för L5, särskilt för analyser såsom immunohistokemi eller western blot¹³, som kirurgisk exponering av L5 DRG vanligtvis möter stora svårigheter på grund av en djup läge och riklig blodtillförsel. Hela operationen bör dessutom undvika skadliga DRG omgivande strukturer, inklusive ryggmärgen och nervrot. Andra kritiska operationssteget värt att notera är injektion. Snabbt gröna färgen blandades med lösningen av genen konstruktioner att visualisera lösningen utkastade från nålen och diffusa i DRG. En framgångsrik injektion bör visa en tydlig runda-form DRG beskrivs av den fluorescerande färgen. Om lösningen med fluorescerande färg läcker ut från DRG medan du injicerar, kan en fram-och-tillbaka finjustering på djupet i spetsen av mikro-nål säkerställa fullständig injektion av alla lösning i DRG kapseln. Undvik att spetsa DRG på mer än tre olika platser. Ytterligare, mild blödning är vanligtvis oundvikligt efter DRG injektion, eftersom DRGs är tätt inkapslade med rete venosum¹³. Det är viktigt att stoppa blödning så att det inte kommer blod isolerande DRG yta från elektroder under elektroporation. Framgångsrika elektroporation beror på elektriska nuvarande transduktion och PBS lösningen kan tillämpas på elektroden. Slutligen, platsen på ischiasnerven om krossas med pincett bör märkas med mikro-suturering, eftersom skadan webbplats är osynlig under mikroskopet och måste anges som utgångspunkt av axon regenerering för bildanalys senare. Om epineurala suturen Knut på webbplatsen krossa faller av efter djur perfusion och dissektion, är det kritiskt att märka samma plats med en sutur omedelbart på PFA-fasta nerven när crush-inducerad indraget är fortfarande identifierbar.

Bland transfection tekniker har elektroporation en högre transfection. Enligt vår studie, transfection DRG neuron för mikroRNA eller siRNAs efter i vivo elektroporation är nära 90%. Viktigare är i vivo elektroporation betydligt mindre tidskrävande än virus-baserade metoder, som kräver virus förpackningar önskade genen konstruktioner. Såvitt vi vet, även om den lipofectamine-baserat i vivo transfection har mindre toxicitet än elektroporation, lipofectamine fungerar inte på DRG neuroner särskilt, varken i vivo eller in vitro. Anmärkningsvärd, den nuvarande metoden har flera tekniska begränsningar. Först, siRNA effekt att knacka ner gen-av-intressera varar kortare än virus-baserat leverans av plasmider. Hela proceduren från elektroporation till djuroffer har därför att vara färdiga i 4 – 6 dagar¹⁴. Dessutom kräver den operation som utförts under mikroskopet träning och viss fingerfärdighet. För en novis varar kirurgi ofta längre än väntat. Bedövningsmedel dosen administreras till musen måste kontrolleras noga för att förhindra oönskade dödlighet. Slutligen, tillplattning ischiasnerven orsakar överlappning av axoner när de utför epifluorescerande imaging. Imaging unflattened nerverna med en confocal mikroskopet är ett alternativ.

Anatomiskt, har DRG sensoriska nervceller två axonal grenar - grenen perifera fallande och stigande centrala gren projicera in i dorsala kolumnen av ryggmärgen¹⁰. Den nuvarande metoden visar också tydlig märkning av den dorsala kolumnen i ryggmärgen. Således kan en liknande metodik användas som en modell för att undersöka sensoriska axon förnyelse efter ryggmärgsskada. Kombinerat med vävnad-clearing tekniker¹¹, kan konventionella konfokalmikroskopi eller ljus ark mikroskopi vara anställd på avmarkerad ryggmärgen prov att bygga 3D rekonstruerade bilder av sensoriska axoner inom den dorsala kolumnen i ryggmärgen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief