Summary
כאן, אנו מציגים עבור פרוטוקול סינתזה ואפיון של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) עבור ROS (מינים חמצן תגובתי) ניקוי ויוו, nanoceria הדמיה ברקמות הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, אין ויוו ניטור של nanoceria ROS ניקוי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Abstract
הצטברות (ROS) מינים חמצן תגובתי מהווה סימן היכר של תגובת המתח והאביוטיים הצמח. ROS לשחק תפקיד כפול צמחים על-ידי מתנהג כמו מולקולות ברמות נמוכות איתות ופגיעה מולקולות ברמה גבוהה. הצטברות של ROS בצמחים לחוץ עלולה לגרום נזק מטבוליטים, אנזימים, ליפידים ו DNA, גרימת הפחתה של צימוח ועם תשואה. היכולת של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) catalytically ניקוי ROS ויוו מספקת כלי ייחודי כדי להבין bioengineer צמחים לעקת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסנתז לאפיין פוליפוני (אקרילי) חומצה nanoceria מצופה (PNC), ממשק חלקיקים עם צמחים באמצעות חדירה פרופריה עלה ושל לפקח על ההפצה שלהם, ROS ניקוי ויוו באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. הנוכחי מולקולרית כלים לטיפול ROS הצטברות בצמחים מוגבלות לדגם מינים ודורשים שיטות טרנספורמציה מפרך. פרוטוקול זה עבור ויוו ROS ניקוי יש פוטנציאל שיוחל פראי סוג צמחים עם עלים רחבים ומבנה העלה כמו תודרנית לבנה.
Introduction
חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) נמצאים בשימוש נרחב אורגניזמים חיים, ממחקר בסיסי בביו-הנדסה, עקב שלהם מינים חמצן תגובתי קטליטי ברורים (ROS) ניקוי יכולת1,2,3. Nanoceria יש ROS ניקוי יכולות עקב מספר רב של משרות פנויות חמצן משטח זה לסירוגין שני חמצון הברית (Ce3 + ,4 +לסה נ.) 4,5,6. לסה נ3 + משתלשלות איגרות חוב ניקוי יעיל ROS בעוד זנים סריג ב הננומטרי רגנרציה של אתרים אלה פגם באמצעות רכיבה על אופניים תגובות7חמצון-חיזור. Nanoceria גם שימשו לאחרונה ללמוד ולשתול הנדסה פונקציה8,9. צמחים תחת לחץ והאביוטיים חווים הצטברות של ROS, גרימת נזק חמצוני שומנים, חלבונים ו DNA10. בצמחים לבנה א , ניקוי קטליטי nanoceria של ROS ויוו מוביל צמח משופרת פוטוסינתזה תחת אור גבוהה, חום ומדגיש מצמררת8. Nanoceria החלה קרקע גם עליות לירות תשואה ביומסה של דגנים של חיטה (חיטת הלחם)11; שמן קנולה (כרוב napus) הצמחים שטופלו nanoceria יש ביומסה צמח גבוה יותר תחת לחץ מלח12.
Nanoceria מציעים למלחמה ולשתול ביולוגים כלי מבוסס-ננו-טכנולוגיה כדי להבין תגובות הלחץ והאביוטיים ולשפר צמחים לעקת יובש. ויוו ROS הניקוי יכולות של Nanoceria עצמאיות של מיני צמחים, המשלוח נתיישב לרקמות הצמח יש הפוטנציאל לאפשר יישום רחב מחוץ דגם אורגניזמים. בניגוד לשיטות אחרות מבוססות מבחינה גנטית, nanoceria אינם מחייבים יצירת קווים צמח עם ביטוי של אנזימים נוגדי חמצון עבור ROS גבוהה ניקוי יכולת13. עלה פרופריה חדירה של nanoceria צמחים היא גישה מעשית במעבדה מבוסס מחקר.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר סינתזה 1) אפיון טעונים שלילית פוליפוני (אקרילי) חומצה nanoceria (PNC), 2) משלוח ואת המעקב של PNC בכל רחבי עלים תאים ולאחר 3) הפיקוח על התומכים ב- PNC ROS הניקוי ב ויוו. ב פרוטוקול זה, פוליפוני טעונים שלילית (אקרילי) חומצה nanoceria (PNC) מסונתז, המאופיינת שלהם ספקטרום הבליעה, קוטר hydrodynamic, פוטנציאל זטה. אנו מתארים שיטה הסתננות פרופריה עלה פשוטה כדי לספק PNC לתוך הצמח רקמות עלים. עבור ויוו הדמיה של ננו-חלקיק הפצה בתוך תאי mesophyll, צבע פלורסנט (DiI) שימש תווית PNC (DiI-PNC) ולצפות על חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. לבסוף, נסביר כיצד לפקח ויוו PNC ROS ניקוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול הצמחים לבנה א
- לזרוע זרעים לבנה א ב 5 ס מ x 5 ס מ חד פעמיות סירים מלאים תערובת אדמה רגיל. לשים 32 של כלי החרס האלה לתוך מגש פלסטיק מלאה במים (~ 0.5 ס מ עומק) ולהעביר את מגש פלסטיק עם הצמחים לתא גידול הצמח.
- קבע את הגידול קאמרית הגדרות כדלקמן: 200 µmol/ms פוטוסינתטיים קרינה פעיל (PAR) 24 ± 1 ° C יום ו 21 ± 1 ° C בלילה, 60% לחות, 14/10 h יום/לילה אור משטר, בהתאמה.
- רזה כל סיר לעזוב צמח יחיד אחד בלבד אחרי שבוע אחד של נביטה. שימו לב לשמור את השתילים עם גודל דומה כל סיר.
- מים את הסירים על ידי שפיכת מים מהברז ישירות על מגש פלסטיק פעם שני ימים. לגדל את הצמחים במשך ארבעה שבועות. לבנה א צמחים מוכנים לשימוש נוסף.
2. סינתזה ואפיון של PNC
- שוקל 1.08 גרם של חנקת צריום (III), לפזר זאת בתוך 2.5 מ ל מים כיתה ביולוגיה מולקולרית צינור חרוטי 50 מ.
- שוקל 4.5 גר' חומצת פולי (אקרילי), לפזר זאת בתוך 5 מ ל מים כיתה ביולוגיה מולקולרית צינור חרוטי 50 מ.
- לערבב שני פתרונות אלו ביסודיות ב-2000 סל ד למשך 15 דקות באמצעות מיקסר דיגיטלי מערבולת.
- להעביר 15 מ"ל של פתרון אמוניה מימית (7.2 M) גביע זכוכית 50 מ.
- תוך כדי ערבוב במהירות של 500 סל ד, להוסיף את התערובת 2.3 שלב dropwise אל הפתרון אמוניה מימית ומערבבים במהירות של 500 סל ד בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה בשכונה fume.
- מכסים את. הספל עם חתיכת נייר כדי למנוע אובדן משמעותי של פתרון במהלך התגובה בין לילה.
- לאחר 24 שעות, להעביר את הפתרון שיתקבל צינור חרוטי 50 מ ל, centrifuge זה ב g x 3,900 לשעה להסיר את כל הלכלוך אפשרי, agglomerates גדול.
- העברה זו 22.5 מ של פתרון supernatant לתוך שלושה מסננים kDa 15 mL 10 ולמלא את השארית של המסנן במים ברמה מולקולרית כדי לגרום לדילול סה כ 45 מ.
- לטהר את הפתרון supernatant של פולימרים חינם, אחרים ריאגנטים עם צנטריפוגה benchtop על-ידי הוספת את תגובת שיקוע, סינון kDa 15 mL 10 ו צנטריפוגה ב 3,900 x g במשך 15 דקות חזור על שלב זה לפחות שש פעמים.
- למדוד את ספיגת של eluent במחזור כל עם ספקטרופוטומטרים UV-VIS מ- 220-700 nm כדי להבטיח אין פולימרים חינם, אחרים נמצאים בהפתרון PNC הסופי.
- לקחת את הפתרון PNC שנאספו לתוך המזרק מ ל ולסנן אותו נגד 20 נקבובית ננומטר מסנן גודל מזרק. לאסוף את הפתרון PNC מסוננת פנימה צינור חרוטי 50 מ.
- לקחת בתמיסה מדוללת PNC הסופי cuvette פלסטיק ולמדוד את ספיגת שלה עם ספקטרופוטומטרים UV-VIS מ- 220-700 nm. שיא ספיגת PNC היא-271 ננומטר.
- לחשב את הריכוז שלו באמצעות החוק של למברט-: A = εCL. A הוא ספיגת של ערך שיא עבור מדגם נתון, ɛ הוא המקדם בליעה מולרי של PNC (ס מ-1 מ'-1), L הוא האורך אופטי (רוחב cuvette, 1 ס מ בשיטה זו), C הוא ריכוז מולרי של חלקיקים נמדד.
- למדוד את קוטר hydrodynamic ופוטנציאל זטה של PNC מסונתזת באמצעות חלקיקים הגודל של זטה פוטנציאליים מנתח (איור 1).
- לאחסן הפתרון הסופי PNC במקרר (4 ° C) עד שימוש נוסף.
הערה: נא עיין וו ואח. 8 פרטים על אפיון PNC פרוטוקול.
3. תיוג PNC עם DiI הפלורסנט
- לערבב מ 0.4 ל 5 מ מ (58 mg/L) PNC 3.6 מ של הביולוגיה המולקולרית כיתה במים בקבוקון זכוכית 20 מ"ל ומערבבים במהירות של 500 סל ד.
- להוסיף 24 µL 1 1'-dioctadecyl-3,3, 3', פתרון לצבוע פרכלורט 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI, 2.5 מ"ג/מ"ל; שתדללו ב דימתיל סולפוקסיד) לתוך µL 176 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי להפוך את הפתרון צבע DiI.
- להוסיף את הצבע DiI dropwise הפתרון PNC, זע ב 1,000 סל ד עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר את התערובת המתקבלת לתוך מסנן kDa 15 mL 10 ולמלא את הצינור העליון עם ביולוגיה מולקולרית מים כיתה לעשות דילול הכולל 15 מ"ל.
- לטהר את DiI המסומנת PNC (DiI-PNC) הפתרון של דימתיל סולפוקסיד וצבע בכל האפשר חינם DiI על ידי צנטריפוגה benchtop המסנן kDa 15 mL 10 ב 3,900 x g במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 3.5 לפחות חמש פעמים.
- לסנן את הפתרונות DiI-PNC הסופי דרך 20 ננומטר נקבובית גודל מזרק מסנן.
- למדוד את ספיגת של DiI הסופי-PNC מאת ספקטרופוטומטר UV-VIS ולחשב את הריכוז שלו על פי החוק של א-למברט (איור 2). ראה שלב 2.13 לפרטים נוספים.
- לאחסן אותו במקרר ב 4 ° C לשימוש נוסף.
4. חדירה של הצמח עוזב עם PNC
- להוסיף 0.1 מ"ל של חדירה מאגר (100 מ מ, מלון טס 100 מ"מ MgCl2, pH 7.5, על ידי HCl) לתוך מ 0.9 ל 0.5 מ מ PNC או DiI-PNC פתרון ו מערבולת זה. השתמש פתרון של 10 מ מ מלון טס הסתננות מאגר כפקד שלילי.
- העברה 0.2 מ"ל של הפתרון הסתננות PNC או DiI-PNC מזרק needleless עקר 1 מ"ל. הקש כדי להסיר את כל הבועות אוויר אפשרי.
- לאחזר את המפעל מן החדר צמיחה לפני חדירה עם חלקיקים כדי למנוע סגירת הפיוניות אפשרי בתנאים אור בחדר.
- לפני חדירה, למדוד את התוכן כלורופיל לבנה א עלים עם גודל דומה באמצעות מד כלורופיל. למדוד כל עלה עם משכפל שלוש (כל שכפול בהיקף של פחות שלוש מדידות)14. בחר לבנה א עלים עם תוכן דומה כלורופיל לניסוי. הסתננות.
- לחדור את העלים לאט עם הפתרון PNC או DiI-PNC לאחרונה מוכן בהקשת בעדינות את קצה המזרק needleless נגד התחתון של העלה הנדן (בצד abaxial), את הבוכנה (איור 3א).
- בעדינות לנגב את הפתרון העודף שנותר על פני העלה פרופריה (איור 3ב') באמצעות מגב של המשימה העדינה (איור 3C), לתייג את הצמח. השתמש מגבונים המשימה העדינה חדש עבור כל קבוצה של עלים.
- שמור הסתנן לבנה א צמחים על הספסל עלה הסתגלות, דגירה PNC או DiI-PNC עבור 3 שעות.
הערה: צמחים הסתנן לבנה א הם אז מוכן לשימוש נוסף (איור 3ד').
5. הכנה של דגימות עלים מיקרוסקופיה קונפוקלית
- רול כמות בגודל אפונה של התבוננות ג'ל כדי על רדיוס 1 ס מ (איור 4א) ולאחר מכן התפזרו זה עד 1 מ מ דק על משטח זכוכית (איור 4B).
- השתמש של בורר קורק (בקוטר 0.3 ס מ) כדי לגזור מקטע מעגלית במרכז של הג'ל תצפית על השקופית זכוכית (איור 4C).
- למלא את החתך טוב לחלוטין עם perfluorodecalin (PFD) לפתרון הדמיה קונאפוקלית יותר ויותר ברקמות עלה.
- השתמש של בורר קורק (קוטר 0.2 ס מ) כדי לאסוף דיסקים העלה DiI-PNC מותאם הסתננו לבנה א צמחים (איור 4D).
- הר בדיסק העלה PFD מילא היטב; פנים לצד (abaxial) הסתנן העלה למעלה.
- לשים על coverslip מרובע על גבי התקליטור עלה, לחץ בעדינות על coverslip את השקופית אחיד כדי לאטום אותו עם הבאר של התבוננות ג'ל ולהבטיח שאין בועות אוויר נשארים לכודים (איור 4E).
6. הדמיה DiI-PNC ברקמות עלה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית
- להשתמש עדשה המטרה X 40 לייזר הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי סורק.
- ירידה שתיים שלוש טיפות של ddH2O על העדשה המטרה X 40.
- במקום השקופית המדגם עלה DiI-PNC הסתננו מוכן על גבי ה-40 הפוכה X עדשה אובייקטיבית.
- ודא את הצד coverslip. אבל לא את הזכוכית שקופיות קשר ישירות עם ddH2O על העדשה.
- למצוא אזור התעניינות הדגימה במיקרוסקופ אור לייזר או שדה בהיר.
- להפעיל את התוכנה מיקרוסקופ והפעל ללייזר (מוגדר ב- 20%).
- הגדר את חריר לאסוף פרוסה אופטי פחות מ 2 מיקרומטר ו ממוצע של קו 4.
- תמונה לדוגמה עם מיקרוסקופ קונפוקלי הגדרות: 514 ננומטר לייזר עירור (30%); Z-מחסנית סעיף עובי: 2 מיקרומטר; PMT1: 550-615 nm (עבור הדמיה DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (עבור כלורופלסט הדמיה).
- קח להחליפן בתמונות קונאפוקלית של דגימות עלים מאנשים שונים, מינימום של שלושה ביולוגית משכפל.
7. דימות PNC ויוו ROS ניקוי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית
- להכין 25 מיקרומטר 2', diacetate 7'-dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA, צבע עבור המציין של ROS כללי) ו- 10 מיקרומטר dihydroethidium (היא, צבע עבור המציין סופראוקסיד אניון) צבעי במאגר הסתננות מלון טס (pH 7.5) 1.5 mL microcentrifuge צינורות, בנפרד.
- השתמש של בורר קורק (קוטר 0.2 ס מ) כדי לאסוף עלים דיסקים של PNC להתאים חדרו לבנה א צמחים.
- להשתמש את קצה חד המלקחיים שלושה או ארבעה חורים על הדיסקים עלה כדי להאיץ את צבען טעינת תהליך.
- העברה העלה דיסקים כדי microcentrifuge צינורות עם H2DCFDA, היא בנפרד ואת תקופת דגירה של 30 דקות תחת החושך.
- לאחר דגירה, שטיפה העלה דיסקים עם ddH2O 3 פעמים ו הר זה לתוך הכוס החלק עם תצפית ג'ל (ראה סעיף 5 לפרוטוקול).
- לשים את השקופיות מיקרוסקופ קונפוקלי ולהתמקד באופן ידני לאזור של תאים mesophyll עלה. לפרטים, ראה פרוטוקול סעיף 6.
- לחשוף את הדיסקים עלה ל ה UV-A (405 ננומטר) לייזר למשך 3 דקות ליצור ROS ולהקליט השינוי עוצמת האות ROS בסדרת הזמן-("xyt") לכל דיסק עלה.
- תמונת התקליטור עלה עם מיקרוסקופ קונפוקלי הגדרות: 40 X מים המטרה; עירור 496 ננומטר לייזר; PMT1: 500-600 nm (עבור היא DCFDA צבע זיהוי,); PMT2: 700-800 nm (לצורך זיהוי מהכלורופלסט). השתמש צמח הסתננו עם רק חדירה בופר של הפקד שלילי.
8. PNC ניקוי של H-2O-2-חוץ גופית בתוך
- לנהל את הפעילות מימטי של החתול (קטלאז) של ה מסונתז PNC במבחנה לפי השיטות הקודמות פרסומים3,8,15
- להוסיף 45.4 µL של חדירה x TES 1 מאגר (10 מ מ מלון טס, MgCl 10 מ מ2, pH 7.5, על ידי HCl), PNC (60 ננומטר, 3 µL), ו- H2O2 (2 מיקרומטר, 1 µL) לבאר (צלחת טוב לבן עגול התחתון 96), ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
- להוסיף 10-אצטיל-3,7-dihydroxyphenoxazine (עבודה ריכוז 100 מיקרומטר, 0.5 µL) ואת חזרת peroxidase (HRP; ריכוז בעבודה 0.2 U/mL, 0.1 µL) לתוך הבאר, לערבב את זה על-ידי pipetting ובעדינות דגירה זה במשך 30 דקות 10-אצטיל-3,7-dihydroxyphenoxazine מגיב2O H2 , מומר resorufin בנוכחות HRP.
- לעטוף את הצלחת ברדיד אלומיניום, כדי למנוע אור בתקופת הדגירה.
- להכין פקד שליליים באמצעות מאגר התגובה או מים כדי להחליף2O H2.
- מלבד הפתרון מניות, להכין את כל פתרונות אחרים בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה, עם קורא צלחת, לנטר את ספיגת-560 nm לשימוש resorufin המציין את הרמה של2O H2. לקבוע זמן משטר 0, 2, 5, 10, 20 ו- 30 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סינתזה PNC ואפיון .
PNC היו מסונתז, מטוהרים, מאופיין הבאים השיטה המתוארת פרוטוקול בסעיף 2. איור 1 א מראה מוספים הפתרונות של חנקת צריום, במספר דוכנים, התערובת של חנקת צריום במספר דוכנים, ואת PNC. שינוי צבע לבן לצהוב בהיר נראה לאחר PNC הוא מסונתז. לאחר טיהור עם מסנן 10 kDa, PNC מאופיינים עם ספקטרופוטומטרים UV-VIS. לשיא של ספיגת עבור PNC נצפתה ב- 271 nm (איור 1B). Eluent הסופית נמדדה גם עם UV-VIS כדי לאשר כי הכימיקלים שאינם הגיבו נשטפו במהלך הטיהור. קוטר hydrodynamic ופוטנציאל זטה של PNC מסונתזת נמדדו עם חלקיקים סייזר, זטה פוטנציאליים מנתח (איור 1C).
PNC תיוג עם צבע DiI .
כדי לקבוע את ההתפלגות של ה חלקיקים ויוו, PNC הודבקו תוויות עם הפלורסנט DiI בעקבות השיטה המתוארת פרוטוקול בסעיף 3. DiI צבע מטמיע בתוך הציפוי PNC באופן ספונטני מאז זה ניתן לכמס לתחומים הידרופובי בפנים ציפויים פולימריים nanoceria16. לאחר הוספת צבע DiI הפתרון PNC, לשנות צבע מהירה ורוד נצפתה (איור 2א). DiI PNC שכותרתו היו מטהרים אותה עם מסנן 10 kDa ואז מאופיין ספקטרופוטומטר UV-VIS. שלוש פסגות צלול של ספיגת עבור DiI עם התווית PNC נצפו (איור 2B). Eluent הסופית נמדדה באמצעות ספקטרופוטומטר UV-VIS כדי לאשר כי הכימיקלים שאינם הגיבו נשטפו במהלך הטיהור.
עלה פרופריה הסתננות.
PNC או DiI-PNC נשלחו לתוך לבנה א עלה באמצעות עלה פרופריה הסתננות שיטת כמתואר בסעיף 4 פרוטוקול. . חדרו עלה ארבעה מקומות שונים כדי להבטיח שהאזור מלא עלה היה perfused PNC פתרון (איור 3א). כל פתרון הנותרים הוסר ממשטח העלה (איור 3B ו- 3 C). צבע העלה השתנה במהלך חדירה מירוק כהה יותר ירוק (איור 3ד'). המזרק היה לחוץ בעדינות נגד העלה כדי למנוע נזק פיזי כלשהו.
עלה מדגם הכנה פלורסצנטיות מיקרוסקופ.
דגימות עלים רכוב על מדרון זכוכית בתוך ג'ל התבוננות עשה טוב מלא PFD. אחרי מגלגל את הג'ל תצפית בגודל אפונה על השקופית (איור 4A ו- 4B), נעשתה באר באמצע הג'ל שטוח (איור 4C). לאחר מכן, התקליטור העלה הטרי הועברה הבאר בעבר מלא פתרון קונספטואלית (איור 4D). Coverslip שימש כדי לשתק את המדגם עלה על השקופית (איור 4E).
הדמיה קונאפוקלית של DiI-PNC ויוו .
DiI-PNC הסתננו לבנה א עלים שימשו לקביעת ההתפלגות של DiI-PNC בתאים mesophyll עלה באמצעות הדמיה קונאפוקלית (איור 5א ו- 5B). כדי להמחיש colocalization בין DiI-PNC מהכלורופלסט, דגימות עלים DiI-PNC הסתננו היו נרגשים עם לייזר nm 514. הפליטה של DiI-PNC הוגדר ב- 550-615 nm כדי למנוע את הפרעות אפשריות של כלורופלסט פיגמנטים אותות לאחר ~ 650 nm17. האוטומטי כלורופיל-זריחה מ מהכלורופלסט אותרו מ 700-800 ננומטר. ההגדרות הדמיה קונאפוקלית נקבעו (עוצמת הלייזר ורווח) כדי לוודא כי אין אותות צבע DiI התגלו המדגם עלה שליטה (הסתננו עם המאגר היחיד) (איור 5C). Colocalization של DiI-PNC עם מהכלורופלסט בתאים mesophyll עלה יכול להיות שנצפו על ידי הדימוי שכבת-על DiI שזוהו-PNC, כלורופלסט פיגמנט autofluorescence (איור 5D).
הדמיה קונאפוקלית של ROS PNC ניקוי אין ויוו .
PNC ב- 10 מ מ מלון טס בופר נשלחו לתוך לבנה א עלים באמצעות שיטת הסתננות של עלה פרופריה כמתואר פרוטוקול בסעיף 7. היא (dihydroethidium) ו- H2DCFDA (2 ′, diacetate 7′-dichlorodihydrofluorescein) צבעי פלורסנט משמשים כדי להמחיש ROS צמח רקמות8,18. H2DCFDA ידוע להיות מומר DCF פלורסנט (2 ′, 7′-dichlorofluorescein, מצביע על מידת כללי סטרס חמצוני) בשל המחשוף של קבוצות אצטט מאת ROS19. . היא צבע ספציפי יותר עבור סופראוקסיד אניון נתקל המוצר שלה פלורסנט (2-hydroxyethidium) הגדל על התגובה של אניון סופראוקסיד20. אין ויוו ROS תכונת הניקוי זמינה על-ידי PNC היה בפיקוח דיסקים עלה מדידה היא DCF לצבוע פלורסצנטיות עוצמת השינויים (דמויות 6A, 6B). PNC הסתננו עלה הדגימות היו נרגשים עם 496 ננומטר לייזר. הפליטה של צבע היא ו DCF הוגדר ב- 500-600 nm כדי למנוע את הפרעות אפשריות עם כלורופלסט אוטומטי-זריחה אותות. פיגמנט אוטומטי-זריחה מ מהכלורופלסט אותרו מ 700-800 ננומטר. אחרי שלוש דקות של UV להדגיש, לצבוע ROS אותות PNC, מאגר-חדרו דגימות עלים נוטרו בנפרד. לעומת הפקד מאגר לא-ננו-חלקיק (nnp ב), PNC הסתננו עלים הראה באופן משמעותי פחות ROS מופעל פלורסנט DCF לצבוע אות (איור 6א). תוצאות דומות נמצאו גם עם סופראוקסיד מופעל אניון היא לצבוע, שבו PNC הסתננו עלים היו באופן משמעותי פחות עוצמת צבע היא ממה מאגר הסתננו שליטה עלים (איור 6B).
החתול PNC פעילות מימטי assay . וזמינותו של PNC ניקוי של H-2-O-2 תוארה פרוטוקול בסעיף 8. ירידה של resorufin אשר מציין רמה2 2O H בתערובת התגובה המכיל PNC נצפתה (איור 7), המאשר את הפעילות מימטי של החתול של PNC מסונתזת.
איור 1 : סינתזה ואפיון של PNC. א הגיוון של חנקת צריום, פולי חומצה אקרילית (על), תערובת של חנקת צריום במספר דוכנים, ולא את PNC מעוצבות (חלקיקי תחמוצת צריום במספר דוכנים מצופה, צהוב בהיר). B. ספיגת הספקטרום של PNC נמדדת ספקטרופוטומטר UV-VIS. ג Hydrodynamic קוטר, זטה פוטנציאלי של PNC מסונתז. אומר שגיאה סטנדרטית ± (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : PNC labelling עם תיוג הפלורסנט DiI. א PNC (צהוב בהיר) ו- DiI לצבוע PNC שכותרתה פתרון (DiI-PNC, ורוד). B. ספיגת ספקטרום של DiI-PNC פתרון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : העלה פרופריה חדירה של PNC או DiI-PNC. א א לבנה העלה לפני החדירה. הפתרון בתוך המזרק הוא DiI-PNC. ב'. עלה חדרה עם DiI-PNC ג. ניקוי הפתרון הנותרים ממשטח העלה עם המשימה העדינה מגבונים. ד לנקות עלים לבנה א חדרה עם DiI-PNC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הכנת שקופיות לדוגמה עלה. שקופיות זכוכית מיקרוסקופ א עם אפונה גודל תצפית ג'לים. B. החלק עם ג'לים תצפית שטוח. ג. החלק עם ג'ל תצפית שטוח בעל באר באמצע. ד שקופיות עם דיסקים עלה הג'ל תצפית טוב מלא עם perfluorodecalin (PFD) פתרון. אי שקופיות עם דיסקים עלה ותשמרו על ידי מכסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : הדמיה DiI-PNC ב- mesophyll עלה תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית- א עלה מדגם נטענה על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה יש עדשה טבילה במים 40 X. B. מיקרוסקופ קונפוקלי משמש עבור הדמיה DiI-PNC מהכלורופלסט. ג כלורופלסט אוטומטי-זריחה נרשם במאגר הסתננו דגימות עלים ללא חלקיקים (nnp ב). ד DiI-PNC אות ו כלורופלסט אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית צילמו בדגימות עלה DiI-PNC חדרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : ניטור ROS PNC ניקוי ב הפיסקו ויה מיקרוסקופיה קונפוקלית- א DCF הפלורסנט (עבור ניטור הכללי ROS אות) הוא נמוך באופן משמעותי בתאים mesophyll של צמחים PNC הסתננו מאשר מאגר שליטה (אין ננו חלקיקים, nnp ב). . היא מופחתת ב פלורסנט לצבוע (עבור ניטור סופראוקסיד אניון) בתאים mesophyll של צמחים PNC הסתננו ביחס לזה של מאגר שליטה (nnp ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : פעילות קטלאז (חתול) מימטי של PNC. בנוכחות peroxidase חזרת, החללית פלורסנט מגיב עם חמצן, מומר resorufin (ספיגת 560 ננומטר). ספיגת של resorufin, אשר מעיד על רמות חמצן, נוטרו-560 ננומטר. PNC הראה פעילות מימטי של החתול. זאת אומרת ± SE (שגיאה סטנדרטית) (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים PNC סינתזה אפיון, תיוג הפלורסנט, הדמיה קונאפוקלית של חלקיקים בתוך תאי צמחים mesophyll שהפגינו ויוו ROS הניקוי הפעילות שלהם. PNC הם מסונתז מתערובת של חנקת צריום והפתרון במספר דוכנים של אמוניה מימית. PNC מאופיינים spectrophotomery קליטה וריכוז באמצעות החוק באר-Lamberts. מדידות פוטנציאל זטה אישר השטח טעונים שלילית של PNC לשיפור משלוח מהכלורופלסט8. תיוג של PNC עם צבע DiI פלורסנט מפעילה ויוו הדמיה מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך התאים mesophyll עלה שם חלקיקים להראות רמות גבוהות של colocalization עם מהכלורופלסט. באמצעות צבעי פלורסנט היא ו DCF, אישרנו את המעשה הזה PNC כמו מנבלות חזק של סופראוקסיד אניון, ROS ויוו.
השיטה עבור סינתזה PNC היא הליך הדרגתיים פשוט שיוצר חלקיקי תחמוצת צריום עם גודל מבוקרת, מטען שלילי ROS ניקוי יכולות16. שיטות אחרות, כגון תרמית הידרוליזה, דורשים בטמפרטורות גבוהות וכימיה יקר ציוד21,22. סינתזה של אפיון PNC היא שיטה נמוכים עם ציוד מעבדה נפוץ. זה אינו מצריך עקומת למידה תלולה לעומת שיטות מולקולריות בצמחים המבוסס על ביטוי אנזימים נוגדי חמצון, למשל, SOD, APXואת החתול, עבור ניקוי ROS מינים דגם מערכות23. PNC היא איתנה, מסיסים במים ROS קטליטי מנבלות אשר אינם דורשים שכפול מפרך ושיטות טרנספורמציה התלויות ללקוחות שלנו גנטי של הצמח, זמין toolkit מולקולרית.
שלב קריטי ב פרוטוקול זה הוא מבוסס-מזרק חדירה של תאים mesophyll עלה עם PNC. חדירה של חלקיקים צמחים חיים צריך להיעשות בעדינות כדי למנוע פגיעה פיזית העלים24. לפיכך, כמו פרוטוקול בשלב 4 של השיטות, דחף בעדינות כנגד פני העלים עם המזרק כדי למנוע קריעה או ניקב פני העלים abaxial. עדיף להסתנן מפני השטח abaxial של לבנה א עלה שכן יש צפיפות גבוהה יותר stomatal מאשר השטח adaxial25,26. יתר על כן, פתרון במאגר PNC או DiI-PNC בטווח ה-pH פיזיולוגיים (~ pH 7.5) אמור לשמש במהלך חדירה פרופריה עלה. צעד קריטי נוסף פרוטוקול זה היא להחיל את הריכוז המתאים של PNC ברקמות הצמח למד. פרוטוקול זה, 50 מ"ג/ליטר של PNC היה לא רעיל לבנה א עלים תוך מתן אפשרות קטליטי ROS PNC ניקוי. כמה מגבלות של השיטה הנוכחית של משלוח nanoparticle חלים 1) לא נתקל ציפורנייך שעוותי ועבה זנים של צמחים או נמוך, צפיפות stomatal 2) מדרגיים עבור יישומים בתחום, 3) העלות הגבוהה של מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית לפקח אין ויוו nanoparticle הפצה, ניקוי ROS.
פרוטוקול זה מדגים היישום של ROS ניקוי PNC עבור לימוד ושיפור צמחים לעקת באמצעות שיטה נתיישב החדירה פרופריה עלה. הצטברות ROS מלווה מדגיש והאביוטיים בצמחים, אשר מפחיתים את הצמח פוטוסינתזה, צמיחה, ואת תשואה8,27,28. צמח שינויים גנטיים שיטות ROS מניפולציה ויוו מוגבלות לעתים קרובות מודל זנים של צמחים בזמן ניקוי PNC ROS יש פוטנציאל שיוחל פראי-סוג מגוונת מיני צמחים. עלה פרופריה חדירה היא שיטת מחקר מעשי להגדלת ROS ניקוי ברקמות עלה על הבנה ועל הנדסה צמחים לעקת יובש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון וחקלאות, פתח פרוייקט 1009710 J.P.G. חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט 1817363 מס על J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
