Summary
Burada, malzemelerin ve Seryum oksit nano tanecikleri (nanoceria) (reaktif oksijen türlerine) için için bir protokol atılmasını vivo içindebitki dokularda düşsel confocal mikroskobu ve in vivo tarafından nanoceria mevcut nanoceria ROS tarafından confocal mikroskobu atma izleme.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) birikimi bitki abiyotik stres tepkisi bir özelliğidir. ROS bitkilerde sinyal molekülleri düşük seviyelerde ve yüksek düzeyde moleküller zarar olarak hareket ederek ikili bir rol oynar. ROS birikimi stresli bitki metabolitleri, enzim, lipidler ve bitki büyüme ve verim azalması neden DNA, zarar verebilir. Seryum oksit nano tanecikleri (nanoceria) catalytically ROS vivo içinde çöpçülük yeteneğini anlamak için benzersiz aracı ve genetiğinin bitki abiyotik stres toleransı sağlar. Burada, sentez ve poli (Akrilik) asit kaplı nanoceria (PNC) karakterize, nano tanecikleri ile bitkilerin yaprak lamina sızma yolu ile arayüzü ve kendi dağıtım ve ROS atılmasını vivo içinde confocal kullanarak izlemek için bir iletişim kuralı mevcut mikroskobu. ROS birikimi tesislerinde değiştirmek için geçerli moleküler araç modeli türleri için sınırlıdır ve zahmetli dönüştürme yöntemleri gerektirir. Vivo ROS atma bu protokol vahşi türü bitkiler ile geniş yaprakları ve yaprak yapı Arabidopsis thalianagibi uygulanmak üzere potansiyeline sahiptir.
Introduction
Seryum oksit nano tanecikleri (nanoceria) canlı organizmalar, biyomühendislik, yetenek1,2,3atma onların ayrı katalitik reaktif oksijen türleri (ROS) nedeniyle için temel araştırma, yaygın olarak kullanılır. Çok sayıda iki oksidasyon Birleşik Devletleri (Ce3 + ve Ce4 +) 4arasında,5,6alternatif yüzey oksijen açık pozisyonlar nedeniyle yeteneklerini atma ROS Nanoceria var. Kafes suşları nano, redoks reaksiyonları7Bisiklete binme aracılığıyla bu kusur sitelerin rejenerasyon teşvik ederken Ce3 + sarkan tahvil ROS etkili bir şekilde at. Nanoceria da son zamanlarda kullanılan eğitim için ve mühendislik bitki işlevi8,9. Bitkiler abiyotik stres altında ROS, yağlar, proteinler ve DNA10oksidatif hasara sebep birikimi deneyimi. A. thaliana bitkilerde nanoceria ROS vivo içinde katalitik atma geliştirilmiş bitki fotosentez yüksek ışık, ısı ve soğutma gerilmeler8altında yol açar. Uygulanan nanoceria da artar ateş biyokütle ve tane verimi buğday (Triticum soğanı)11toprak; nanoceria ile tedavi Kolza (Brassica napus) bitkiler daha yüksek bitki biyokütle tuz stres12altında var.
Nanoceria bioengineers teklif ve biyologlar abiyotik stres yanıt-e doğru anlamak ve bitki abiyotik stres toleransı geliştirmek için Nanoteknoloji tabanlı bir araç bitki. Nanoceria'nin vivo ROS atma yetenekleri bitki türlerinin bağımsızdır ve bitki doku içine facile teslim model organizmalar dışında geniş uygulama etkinleştirmek potansiyeline sahiptir. Genetik olarak tabanlı diğer yöntemlerinden farklı olarak, nanoceria bitki satırlar ile antioksidan enzimler overexpression daha yüksek ROS yetenek13atma için değil gerektirir. Nanoceria bitkilere yaprak lamina infiltrasyonu laboratuar tabanlı araştırma için pratik bir yaklaşımdır.
Bu iletişim kuralı genel amacı 1) sentezi ve karakterizasyonu olumsuz ücret poli (Akrilik) asit nanoceria (PNC), 2) teslim ve PNC yaprak hücreleri boyunca izleme ve 3) izleme PNC etkin ROS atma tarif etmektir Vivo. Bu protokol için olumsuz ücret poli (Akrilik) asit nanoceria (PNC) sentezlenmiş ve onların soğurma spektrumu, hidrodinamik çapı ve zeta potansiyel ile karakterize. PNC bitki yaprak dokuları sunmak için basit yaprak lamina infiltrasyon yöntemi açıklanmaktadır. Vivo içinde görüntüleme için mesophyll hücrelerin içindeki nanopartikül dağılımının, floresan boya (dıı) PNC (dıı-PNC) etiket ve nano tanecikleri confocal floresans mikroskobu ile gözlemlemek için kullanıldı. Son olarak, biz in vivo PNC ROS confocal mikroskobu atma izlemek nasıl açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. A. thaliana bitki yetiştirme
- 5 cm x 5 cm tek kullanımlık tencere standart toprak karışımı ile dolu A. thaliana tohumları ekmek. 32 bu tencere içine su dolu bir plastik tepsi koymak (~ 0.5 cm derinlik) ve bitkiler ile plastik tepsi bir bitki büyüme odasına aktar.
- Büyüme odası ayarlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 200 µmol/ms fotosentetik aktif radyasyon (PAR), 24 ± 1 ° C gün ve 21 ± 1 ° C gece, % 60 nem ve 14/10 h gündüz/gece ışık rejimi, anılan sıraya göre.
- Sadece bir bitki çimlenmesi bir hafta sonra terk etmek her pot ince. Her pot fidan benzer boyutta tutmaya dikkat edin.
- Tencere Dökme musluk suyu doğrudan plastik tepsi tarafından her iki günde su. Dört hafta boyunca bitkiler büyümek. A. thaliana bitkiler daha fazla kullanıma hazır.
2. malzemelerin ve PNC
- Seryum (III) nitrat 1.08 g tartmak ve moleküler biyoloji sınıf su 50 mL konik tüp içinde 2.5 mL içinde çözülür.
- Poli (Akrilik) asit 4,5 g ağırlığında ve 5 ml 50 mL konik tüp moleküler biyoloji sınıf suda çözülür.
- Bu iki çözüm sayısal vortex Mikser kullanarak 15dk için 2.000 devirde iyice karıştırın.
- 15 mL amonyum hidroksit çözeltisi (7.2 M) 50 mL Cam kabı aktarın.
- Süre karıştırma 500 rpm karışımı adım 2.3 dropwise amonyum hidroksit ekleyin ve duman başlıklı 24 hr için oda sıcaklığında 500 rpm'de karıştırın.
- Bir gecede reaksiyonu sırasında çözüm önemli kaybı önlemek için kağıt parçası ile kabı kapağı.
- 24 saat sonra elde edilen çözüm 50 mL konik tüp aktarmak ve herhangi bir olası enkaz ve büyük aglomeralar kaldırmak 1 h 3900 x g, santrifüj kapasitesi.
- Bu 22,5 mL süpernatant çözeltisi üç 15 mL 10 kDa filtre aktarmak ve filtre kalan 45 mL toplam bir seyreltme yapmak için moleküler sınıf su ile doldurun.
- Ücretsiz polimerler süpernatant çözümden arındırmak ve diğer ayıraçlar ekleyerek süpernatant 15 mL 10 kDa filtre ve 15 dakika süreyle 3900 x g, santrifüj benchtop santrifüj ile en az altı kez bu adımı yineleyin.
- 220-700 nm hiçbir ücretsiz polimerler emin olmak için gelen UV-VIS Spektrofotometre ile eluent absorbans her çevrimde ölçmek ve diğer reaktifler son PNC çözümde mevcuttur.
- Toplanan PNC çözüm 5 mL şırınga almak ve 20 nm gözenek boyutu şırınga filtre karşı filtre. Filtre uygulanmış PNC çözüm 50 mL konik tüp içinde toplamak.
- Plastik bir küvet içinde seyreltilmiş son PNC çözüm almak ve 220-700 nm gelen UV-VIS Spektrofotometre ile onun absorbans ölçün. PNC absorbans tepedir 271 nm.
- Bira-Lambert'ın hukuk kullanarak onun konsantrasyonu hesaplama: A εCL =. A belirli bir örnek için en yüksek değer absorbans, ɛ olduğunu PNC (cm-1 M-1) molar emme katsayısı, L. optik yol uzunluğu (küvet genişliği, bu yöntemde 1 cm), ve C ölçülen nano tanecikleri molar konsantrasyonu olduğunu.
- Hidrodinamik çapı ve zeta potansiyel bir parçacık boyutu ve zeta potansiyel Analyzer'ı (Şekil 1) sentezlenmiş PNC ölçmek.
- Bir buzdolabı (4 ° C) son PNC çözümünde daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
Not: Lütfen Wu ve diğerleribakın. 8 daha fazla iletişim kuralı ayrıntılarını PNC karakterizasyonu için.
3. PNC dıı floresan boya ile etiketleme
- 5 mm (58 mg/L) PNC 0.4 mL moleküler biyoloji 3.6 mL ile 20 mL Cam şişe suda sınıf mix ve 500 rpm'de heyecan.
- Ekle 24 µL 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat boya çözüm (dıı, 2.5 mg/mL; DMSO seyreltik) dıı boya çözüm yapmak DMSO (dimetil sülfoksit) 176 µL içine.
- Dıı boya dropwise, ortam sıcaklığında 1 dk 1000 devirde karıştırarak PNC çözüm ekleyin.
- Elde edilen bu karışımı 15 mL 10 kDa filtre aktarmak ve üst tüp toplam seyreltme yapmak için moleküler biyoloji sınıf su ile doldurun 15 mL.
- PNC (dıı-PNC) çözüm DMSO ve herhangi bir olası ücretsiz dıı boya benchtop Santrifüjü tarafından 5 min için 3900 x g de 15 mL 10 kDa filtre etiketlenmiş dıı arındırmak.
- Adım 3.5 en az beş kez tekrarlayın.
- Son dıı-PNC çözümleri 20 nm gözenek boyutu şırınga filtre ile filtre.
- UV-VIS spectrophotometry tarafından son dıı-PNC absorbans ölçmek ve bira-Lambert'ın Hukuku (Şekil 2) göre onun konsantrasyonu hesaplayın. Adım 2,13 daha fazla ayrıntı için bkz.
- Daha fazla kullanım için 4 ° C'de bir buzdolabında saklayın.
4. bitki infiltrasyonu ile PNC bırakır
- İnfiltrasyon 0.1 mL ekleyin (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, HCl tarafından ayarlanmış) 0,5 mM PNC veya dıı-PNC çözüm ve girdap 0.9 mL bu arabellek. 10 mM TES infiltrasyon arabelleği bir çözüm bir negatif kontrol kullanın.
- 0.2 mL PNC veya dıı-PNC infiltrasyon çözeltisi bir 1 mL steril needleless şırıngaya aktarın. Herhangi bir olası hava kabarcıkları kaldırmak için dokunun.
- Bitki büyüme odası hemen önce infiltrasyon mümkün stoma bantlı kapama oda ışık koşulları altında önlemek için nano tanecikleri ile al.
- Önce infiltrasyon, A. thaliana yaprakları klorofil içeriği benzer boyutta bir klorofil ölçeri kullanmayı ölçmek. Her yaprak üç çoğaltır ile (en az üç ölçümleri oluşan her çoğaltma) ölçmek14. A. thaliana infiltrasyon deneme için benzer klorofil içeriği bırakır seçin.
- Son zamanlarda hazırlanmış PNC veya dıı-PNC çözüm ile yavaş yavaş yaprakları yaprak lamina (abaxial tarafı) alt karşı needleless şırınga ucu hafifçe basarak sızmak ve dalgıç (Şekil 3A) düşürmek.
- Hafifçe narin görev silecek (Şekil 3C) kullanarak yaprak lamina (Şekil 3B) yüzeyinde kalır fazla çözüm yok etmek ve bitki etiket. Yeni hassas görev mendil yaprakları her grup için kullanın.
- İnfiltre A. thaliana bitkilerin yaprak adaptasyon ve 3 h için PNC veya dıı-PNC kuluçka için tezgah üzerinde tutun.
Not: İnfiltre A. thaliana bitkiler sonra daha fazla kullanılmasını (Şekil 3D) için hazırsınız demektir.
5. Confocal Mikroskopi için yaprak örnekleri hazırlanması
- Gözlem bezelye boyutlu miktarı 1 cm RADIUS (Şekil 4A) hakkında jel ve 1 mm ince bir cam slayt (Şekil 4B) kadar o zaman uzat rulo.
- Bir cork matkap kullanmak (çapı 0,3 cm) (Şekil 4C) cam slayt üzerinde gözlem jel merkezi dairesel bir bölüm kesmek için.
- Kesme yaprak dokularında daha derin ve daha iyi confocal görüntüleme çözümü için de tamamen perfluorodecalin (PFD) ile doldurun.
- Bir cork matkap kullanmak (çapı 0.2 cm) yaprak diskler adapte dıı PNC toplamak için A. thaliana bitkiler (Şekil 4D) sızmış.
- İyi doldurdu PFD yaprak disk mount; yaprak infiltre (abaxial) tarafı yukarı dönük.
- Bir kare coverslip yaprak disk üzerine getirin ve yavaşça eşit gözlem jel kuyu ile kapatın ve kapana kısılmış (Şekil 4E) hiçbir hava kabarcıkları kalır emin olmak için slayt coverslip basın.
6. görüntüleme dıı-PNC yaprak dokularında Confocal mikroskobu tarafından
- 40 X objektif lens confocal mikroskobu tarama ters bir lazer kullanın.
- 2-GKD2O 40 X objektif lens üst kısmında üç damla damla.
- Hazırlanan dıı-PNC sızmış yaprak örnek slayt ters 40 X objektif lens üstüne yerleştirin.
- Coverslip yan ama GKD2O ile doğrudan temas objektif üzerinde slayt cam değil emin olun.
- Mikroskop altında örnek ilgi bir bölge lazer ışığı ya da parlak alan ile bulmak.
- Belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı başlatmak ve Argon lazer (%20 ayarlamak) açın.
- 2 µm ve bir satır ortalama 4 daha az optik bir dilim toplamak için iğne deliği ve sondaj ayarlayın.
- Confocal mikroskop ayarları ile örnek resim: 514 nm lazer uyarma (% 30); Z-yığın bölümü kalınlığı: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (için dıı-PNC görüntüleme); PMT2: 700-800 nm (kloroplast görüntüleme için).
- Confocal görüntülerini temsilcisi: yaprak örnekleri farklı bireylerin, en az üç biyolojik çoğaltır al.
7. PNC vivo içinde ROS atma Confocal mikroskobu tarafından görüntüleme
- Hazırlamak 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, bir genel ROS gösteren bir boya) ve 10 µM dihydroethidium (DHE, süperoksit anyon gösteren bir boya) TES infiltrasyon arabellek (pH 7.5) 1.5 mL microcentrifuge tüpler, boyalar ayrı ayrı.
- Bir cork matkap kullanmak (çapı 0.2 cm) yaprak toplamak için A. thaliana bitkiler adapte PNC disklerinden sızmış.
- Forseps keskin ucu boya yükleme işlemi hızlandırmak için yaprak diskler üzerinde üç veya dört delik olun
- Yaprak DCFDA ve DHE diskler ayrı ayrı H2microcentrifuge tüpler için ve karanlık altında 30 dk için kuluçkaya transfer.
- Kuluçka sonra durulama yaprak GKD2ile O üç kez diskler ve cam içine slayt gözlem ile bağlama (bkz. iletişim kuralı Bölüm 5) jel.
- Slayt confocal mikroskobunun koymak ve el ile bir yaprak mesophyll hücreleri bölgesine odaklan. İletişim kuralı Bölüm 6 Ayrıntılar için bkz.
- UV-A yaprak disklere maruz (405 nm) lazer ROS oluşturmak ve zaman serileri ("xyt") yaprak disk başına ROS sinyal şiddeti değişikliği kaydetmek için 3 dakika için.
- Görüntü confocal mikroskop ayarları ile yaprak disk: 40 X su amaç; 496 nm lazer uyarma; PMT1: 500-600 nm (için boya algılama) DHE ve DCFDA; PMT2: 700-800 nm (kloroplast algılama için). Sadece infiltrasyon arabellek çözüm olarak negatif kontrol ile sızmış bir bitki kullanın.
8. PNC atma H2O2içinde vitro
- Önceki yayınları3,8,15 yöntemleri izleyerek sentezlenmiş PNC vitro kedi (katalaz) mimetic etkinliklerini yürütmek
- 45.4 eklemek µL 1 x TES infiltrasyon tampon (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, HCl tarafından ayarlanabilir), PNC (60 nM, 3 µL) ve H2O2 (2 µM, 1 µL bir kuyuya (beyaz yuvarlak alt 96 iyi plaka)) ve pipetting tarafından karışımı yavaşça.
- 10-asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine (çalışma konsantrasyonu 100 µM, 0.5 µL) ve horseradish peroksidaz ekleyin (HRP; çalışma konsantrasyonu 0,2 U/mL, 0.1 µL) kuyuya yavaşça karıştırarak pipetting tarafından ve 30 dk 10-asetil-3,7-dihydroxyphenoxazine için kuluçkaya H2O2 ile reaksiyona girer ve resorufin huzurunda HRP dönüştürülür.
- Plaka ışık kuluçka sırasında önlemek için alüminyum folyo ile sarın.
- Bir negatif kontrol H2O2yerine tepki arabellek veya su kullanarak hazırlayın.
- Hisse senedi çözüm hariç, tüm diğer çözümleri, ortam sıcaklığında hazırlayın.
- Bir plaka okuyucu ile kuluçka sonra 560 absorbans izlemek nm H2O2düzeyini gösteren için resorufin kullanın. Zaman rejim 0, 2, 5, 10, 20 ve 30 dk ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PNC sentezi ve karakterizasyonu .
PNC sentez, saflaştırılmış ve Yöntem iletişim kuralı Bölüm 2'de açıklanan aşağıdaki karakterize. Resim 1 A Seryum nitrat, patır, Seryum nitrat ve PAA ve PNC karışımı çözümleri coloration gösterir. PNC sentezlenir sonra beyaz açık sarı bir renk değişikliği görülür. 10 kDa filtreli arıtma sonra PNC UV-VIS Spektrofotometre ile karakterize. Zirve absorbans PNC için 271 gözlendi nm (Şekil 1B). Son eluent da tepki kimyasal arıtma sırasında yıkanmış onaylamak için UV-VIS ile ölçüldü. Hidrodinamik çapı ve sentezlenmiş PNC zeta potansiyel bir parçacık büyüklük ve zeta potansiyel analyzer ile (Şekil 1C) ölçüldü.
PNC dıı boya ile etiketleme .
Nano tanecikleri vivo içindedağılımını belirlemek için PNC etiketli tabi belgili tanımlık yöntem iletişim kuralı Bölüm 3'te açıklanan bir floresan dıı boya ile. Polimer kaplamalar nanoceria16içinde hidrofobik etki alanları içine yerleştirebilirsiniz beri dıı boya PNC kaplama içinde kendiliğinden katıştırır. Dıı boya PNC çözüm ekledikten sonra hızlı bir rengi değiştirmek için pembe (Şekil 2A) gözlenen. Etiketli PNC vardı o zaman 10 kDa filtre ile saflaştırılmış ve UV-VIS spectrophotometry tarafından karakterize dıı. Absorbans PNC etiketli dıı için üç net doruklarına (Şekil 2B) tespit edildi. Son eluent tarafından tepki kimyasal arıtma sırasında yıkanmış onaylamak için UV-VIS spectrophotometry ölçülmüştür.
Yaprak Lamina infiltrasyon.
PNC veya dıı-PNC teslim içine A. thaliana yaprak yaprak lamina infiltrasyon yöntemi ile iletişim kuralı Bölüm 4'te açıklandığı gibi. Yaprak tam yaprak alanı PNC çözüm (Şekil 3A) ile periosteum emin olmak için dört farklı noktalarda sızmış. Kalan herhangi bir çözüm (Şekil 3B ve 3 C) yaprak yüzeyinden kaldırıldı. Yaprak rengi daha koyu yeşil (Şekil 3D) yeşil üzerinden infiltrasyon sırasında değişti. Şırıngayı yavaşça yaprak karşı herhangi bir fiziksel zarar görmemesi için basılıştan.
Yaprak numune hazırlama floresan mikroskopi için.
Yaprak örnekleri cam slaytlara de PFD. ile doldurulmuş yapılan bir gözlem jel içinde monte edildi Bezelye boyutu gözlem jel (Şekil 4A ve 4B) slayt üzerinde inişli çıkışlı bir de düz jel (Şekil 4C) ortasında yapıldı. O zaman, taze hazırlanmış yaprak disk önceden doldurulmuş PFD çözüm (Şekil 4D) de transfer edildi. Bir coverslip (Şekil 4E) slaytta yaprak örnek hareketsiz için kullanıldı.
Dıı-PNC içinde vivo confocal görüntüleme .
Dıı-PNC sızmış A. thaliana yaprakları dıı-PNC yaprak mesophyll hücrelere confocal görüntüleme (Şekil 5A ve 5B) üzerinden dağılımını belirlemek için kullanılmıştır. Colocalization dıı-PNC ve kloroplast arasındaki görselleştirmek için dıı-PNC sızmış yaprak örnekleri 514 nm lazer ile heyecan vardı. Dıı-PNC emisyon 550-615 nm ~ 650 nm17sonra kloroplast pigment sinyal girişimi mümkün engellemek için ayarlandı. Klorofil auto-floresan kloroplast gelen 700-800 nm algılandı. Confocal görüntüleme ayarları (lazer güç ve kazanç) hiçbir dıı boya sinyalleri (tek önbellekle sızmış) denetim yaprak örneği algılandı emin olmak için ayarlanmış (Şekil 5C). Dıı-PNC colocalization yaprak mesophyll hücrelerinde kloroplast ile algılanan dıı-PNC ve kloroplast pigment autofluorescence (Şekil 5D) Bindirme görüntüsünü tarafından görülebilir.
PNC atma ROS confocal görüntüleme vivo .
PNC 10 mM TES tampon çözelti içinde teslim içine A. thaliana yaprakları yaprak lamina infiltrasyon yöntemi ile iletişim kuralı Bölüm 7'de açıklandığı gibi. DHE (dihydroethidium) ve H2DCFDA (2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate) Floresan boyalar ROS bitki doku8,18' görselleştirmek için kullanılır. H2DCFDA floresan DCF (2 ', 7'dichlorofluorescein, bir gösterge genel oksidatif stres derecesi) dönüştürülmesi asetat grupları bölünme nedeniyle ROS19tarafından olduğu bilinmektedir. DHE olduğunu bir daha özel boya için süperoksit anyon floresan ürün (2-hydroxyethidium) sahip artırmak süperoksit anyon20tepki üzerine. Vivo ROS PNC tarafından etkin atma DHE ve DCF boya floresan yoğunluğu değişiklikleri (rakamlar 6A ve 6B) ölçme yaprak diskler takip. PNC yaprak örnekleri 496 nm lazer ile heyecan vardı sızmış. Boya DHE ve DCF emisyon 500-600 nm kloroplast otomatik floresans sinyalleri ile olası müdahale önlemek için kuruldu. Pigment auto-floresan kloroplast gelen 700-800 nm algılandı. UV 3 dakika stres sonra ROS boya PNC ve arabellek-sızmış yaprak örnekleri ayrı ayrı takip sinyalleri. Hayır-nanopartikül arabellek denetim (NNP) göre PNC önemli ölçüde daha az ROS aktif floresan DCF boya sinyal (Şekil 6A) gösterdi yaprakları sızmış. Benzer sonuçlar da sızmış PNC yaprakları arabellek denetim yaprakları (Şekil 6B) sızmış daha önemli ölçüde daha az DHE boya yoğunluğu olduğu süperoksit anyon aktif DHE boya ile bulunmuştur.
PNC kedi mimetic etkinliği tahlil . Tahlil PNC H2O2 / veri atma Protokolü Bölüm 8'de tanımlanmıştır. H2O2 kademede PNC içeren tepki karışımı (Şekil 7) gözlendi, gösterir resorufin bir azalma sentezlenmiş PNC kedi mimetic etkinliğini onaylayan.
Resim 1 : PNC malzemelerin ve. A. coloration Seryum nitrat, poli akrilik asit (PAA), Seryum nitrat ve PAA, karışımı ve sentezlenmiş PNC (kaplı PAA Seryum oksit nano tanecikleri, açık sarı). B. UV-VIS spectrophotometry tarafından ölçülen PNC absorbans spektrum. C. Hydrodynamic çap ve zeta potansiyel sentezlenmiş PNC bıktınız. ± Standart hata demek (n = 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : PNC dıı floresan boya ile etiketleme. A. PNC (açık sarı) ve dıı etiketli PNC çözüm (dıı-PNC, pembe) boya. B. absorbans dıı-PNC çözüm yelpazesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Yaprak PNC veya dıı-PNC lamina infiltrasyonu. A. A. thaliana infiltrasyon önce yaprak. Dıı-PNC şırınga içinde çözümdür. B. yaprak dıı-PNC ile sızmış. C. hassas görev ile yaprak yüzeyinden kalan çözüm temizlik bezleri. Ö. A. thaliana yaprak dıı-PNC ile infiltre temizledim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Yaprak örnek slaytlar hazırlanması. A. mikroskobu cam slayt bezelye boyutu gözlem jelleri ile. B. düz gözlem jelleri ile kaydırın. C. ortasında bir kuyu sahip düz gözlem jel ile kaydırın. Ö. de perfluorodecalin (PFD) çözüm ile dolu gözlem jel içinde yaprak yuvarlak yüzey ile kaydırın. E. kapak notu tarafından immobilize yaprak diskler ile kaydırın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Görüntüleme dıı-PNC içinde yaprak mesophyll hücreleri ile confocal mikroskobu. A. yaprak örnek bir 40 X su daldırma objektife sahip bir ters confocal mikroskobunun monte edilir. B. confocal mikroskop düşsel dıı-PNC ve kloroplast için kullanılır. C. kloroplast auto-floresan sızmış arabellek yaprak örnekleri nano tanecikleri (NNP) olmadan kaydedilir. Ö dıı-PNC sinyal ve kloroplast otomatik floresans dıı-PNC sızmış yaprak örnekleri görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : PNC planta içinde confocal mikroskobu ile atma ROS izleme. A. DCF floresan boya (için genel ROS sinyal izleme) mesophyll sızmış PNC bitki hücrelerinde arabellek denetim (hiçbir nano tanecikleri, NNP) önemli ölçüde düşüktür. Bu arabellek kontrolü (NNP) göre sızmış PNC bitkilerin mesophyll hücrelerdeki B. azaltılmış DHE floresan boya (süperoksit anyon izlemek için). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : PNC mimetic aktivitesinin katalaz (CAT). Horseradish peroksidaz, huzurunda floresan sonda hidrojen peroksit ile reaksiyona girer ve resorufin (absorbans 560 nm) dönüştürülür. Hidrojen peroksit düzeyi göstergesidir, resorufin absorbans 560 sınıf başkanı nm. PNC bir kedi mimetic faaliyet gösterdi. Demek ± SE (Standart hata) (n = 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için PNC sentezi, karakterizasyonu, floresan boya etiketleme ve in vivo ROS atma faaliyetlerini sergilemek için bitki mesophyll hücreleri içinde nano tanecikleri confocal görüntüleme açıklar. PNC Seryum nitrat ve PAA çözümde amonyum hidroksit karışımı üzerinden sentezledim. PNC emme spectrophotomery ve bira-Lamberts hukuk kullanarak kararlı konsantrasyon ile karakterizedir. Zeta potansiyel ölçümleri PNC olumsuz şarj edilmiş yüzey teslim kloroplast8artırılması için doğruladı. PNC floresan dıı boya ile etiketleme confocal mikroskobu içinde nerede görüneceğini nano tanecikleri colocalization kloroplast ile yüksek düzeyde yaprak mesophyll hücreleri tarafından vivo içinde görüntüleme sağlar. DHE ve DCF floresan boyalar kullanarak, bu PNC hareket süperoksit anyon ve ROS vivo içindegüçlü bir çöpçü doğruladık.
PNC sentezleme yöntemi Seryum oksit nano tanecikleri kontrollü boyutu, negatif yük ve yetenekleri16atma ROS oluşturur bir step-wise ve basit bir işlemdir. Termal hidroliz gibi diğer yöntemleri yüksek sıcaklık ve pahalı Kimya donatım21,22gerektirir. Sentez ve karakterizasyonu PNC ortak Labaratuar donanımları ile gerçekleştirilen bir yöntemdir ucuz. Dik bir öğrenme eğrisi ROS tür model sistemleri23yılında atma işlemi için üzerinde bir antioksidan enzim, Örneğin, SOD, APXve kedi, overexpression göre bitki moleküler yöntemleri ile karşılaştırıldığında gerektirmez. PNC zahmetli klonlama gerektirmeyen bir güçlü, çözünebilir ROS katalitik leş ve bitkinin genetik tractability ve mevcut Moleküler toolkit bağlıdır dönüştürme yöntemleri olduğunu.
Bu iletişim kuralı bir kritik yaprak mesophyll hücreleri ile PNC şırınga tabanlı infiltrasyonu adımdır. Nano tanecikleri infiltrasyonu yaşamak bitki içine yavaşça yaprak24fiziksel zarar önlemek için yapılmalıdır. Böylece, yöntemlerden Protokolü adım 4 olduğu gibi yavaşça yaprak yüzeyine karşı şırınga ile yırtılma veya abaxial yaprak yüzeyi delinme önlemek için itin. Adaxial yüzey25,26daha yüksek stomatal yoğunluğu yana abaxial A. thaliana yaprak yüzeyinden sızmak iyidir. Ayrıca, PNC veya dıı-PNC tampon çözeltisi fizyolojik pH aralığında (~ pH 7.5) yaprak lamina infiltrasyon sırasında kullanılmalıdır. Bu iletişim kuralı bir kritik adım okudu bitki dokusu ile PNC uygun konsantrasyonu uygulamaktır. Bu protokol için 50 mg/L PNC katalitik PNC atma ROS etkinleştirilirken A. thaliana yaprakları için zehirli değil. Geçerli nanopartikül teslim yönteminin bazı sınırlamalarını kalın ve balmumu cuticles sahip tür bitki veya stomatal yoğunluğu düşük 2) değil için geçerli değildir 1) alanında, 3) izlemek için bir confocal mikroskobu sistemin yüksek maliyeti uygulamaları için ölçeklenebilir vivo nanopartikül dağıtım ve ROS atma.
Bu iletişim kuralı ROS PNC eğitim ve abiyotik stres toleransı bitkilerde yaprak lamina infiltrasyon facile bir yöntemle arttırmak için atma işlemini uygulama gösterir. ROS birikimi bitkilerde bitki fotosentez, büyüme, azaltır ve8,27,28verim abiyotik stres eşlik ediyor. Bitki genetik değişiklikler yöntemleri ROS manipülasyon vivo içinde için genellikle PNC ROS atma çeşitli vahşi türü bitki türü için uygulanan potansiyeline sahipken modeli tür bitki için sınırlıdır. Yaprak lamina infiltrasyon anlama ve bitki abiyotik stres toleransı Mühendislik için yaprak dokularında ROS atma artırmak için pratik araştırma yöntemidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser University of California, Riverside ve USDA Ulusal Enstitüsü Gıda ve tarım, Hatch projeye J.P.G. 1009710 tarafından desteklenmiştir Bu malzeme Grant No 1817363 J.P.G. için altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
