Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la síntesis y caracterización de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) de ROS (especies reactivas del oxígeno) barrido en vivo, nanoceria proyección de imagen en los tejidos vegetales por microscopía confocal e in vivo seguimiento de nanoceria ROS barrido por microscopia confocal.
Abstract
Acumulación de oxígeno reactivo (ROS) las especies es un rasgo distintivo de la respuesta de estrés abiótico las plantas. ROS desempeñan un papel dual en las plantas actuando como señales de moléculas en niveles bajos y dañar moléculas en niveles altos. Acumulación de ROS en plantas puede dañar metabolitos, enzimas, lípidos y ADN, provocando una reducción del crecimiento de las plantas y el rendimiento. La capacidad de compactar catalítico ROS en vivo de nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) proporciona una herramienta única para entender y tolerancia al estrés abiótico planta bioingeniero. Aquí, presentamos un protocolo para sintetizar y caracterizar poly (acrílico) ácido nanoceria revestido (PNC), interfaz de las nanopartículas con plantas vía infiltración de lámina de la hoja y controlar su distribución y ROS rebuscar en vivo usando confocal microscopia. Actuales herramientas moleculares para manipular la acumulación de ROS en las plantas se limitan a especies modelo y requieren métodos de transformación laboriosa. Este protocolo en vivo barrido ROS tiene el potencial para aplicarse a las plantas de tipo silvestre con hojas anchas y estructura de las hojas como Arabidopsis thaliana.
Introduction
Nanopartículas de óxido de cerio (nanoceria) son ampliamente utilizadas en los organismos vivos, desde la investigación básica a la bioingeniería, debido a sus especies distintas catalítico reactivas del oxígeno (ROS) barrido capacidad1,2,3. Nanoceria tienen ROS barrido capacidades debido a un gran número de vacantes de oxígeno superficial que se alternan entre dos oxidación Estados (Ce3 + y Ce4 +) 4,5,6. Los Ce3 + colgando los bonos efectivamente barrido ROS mientras que las cepas de enrejado en la nanoescala promueven la regeneración de estos sitios de defecto mediante redox reacciones7de ciclismo. Nanoceria también se han utilizado recientemente para estudiar e Ingeniería de la planta función8,9. Plantas bajo estrés abiótico experimentan acumulación de ROS, que causa daño oxidativo a lípidos, proteínas y ADN10. En plantas de a. thaliana , nanoceria depuración catalítica de ROS en vivo conduce a la fotosíntesis de la planta mejorada bajo la alta luz, calor y frío estrés8. Nanoceria aplicando al suelo también aumenta sesión de biomasa y rendimiento de grano de trigo (Triticum aestivum)11; las plantas de canola (Brassica napus) tratadas con nanoceria tienen mayor biomasa de la planta bajo estrés salino12.
Nanoceria ofrecemos bioingenieros y biólogos de la planta una herramienta basada en nanotecnología para entender las respuestas de estrés abiótico y mejorar la tolerancia al estrés abiótico planta. En vivo ROS barridas capacidades de Nanoceria independientes de especies de plantas, y la entrega fácil en los tejidos de la planta tiene el potencial para permitir amplia aplicación fuera de organismos modelo. A diferencia de otros métodos basados en la genética, nanoceria no requieren generar líneas de plantas con la sobreexpresión de enzimas antioxidantes para ROS mayor compactación capacidad13. Infiltración de lámina de la hoja de nanoceria a las plantas es un enfoque práctico para la investigación de laboratorio.
El objetivo general de este protocolo es describir 1) la síntesis y caracterización de poly cargados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) la entrega y seguimiento de la PNC a través de células de la hoja y 3) el monitoreo de depuración PNC permitió ROS en vivo. En este protocolo, poly cargados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) son sintetizados y caracterizados por su espectro de absorción, diámetro hidrodinámico y potencial zeta. Se describe un método de infiltración de lámina de hoja simple para entregar PNC en planta de tejidos de la hoja. En vivo imagen de distribución de nanopartículas en las células del mesófilo, un colorante fluorescente (DiI) fue utilizado para la etiqueta de PNC (DiI-PNC) y observar las nanopartículas mediante microscopía de fluorescencia confocal. Por último, explicamos cómo monitorear en vivo PNC ROS barrido a través de microscopía confocal.
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Protocol
1. cultivo de plantas de a. thaliana
- Siembre las semillas de a. thaliana en ollas desechables de 5 cm x 5 cm llenados con mezcla de suelo estándar. Puesto 32 de estas macetas en una bandeja de plástico llenada de agua (~ 0,5 cm de profundidad) y la transferencia de la bandeja de plástico con las plantas en una cámara de crecimiento de la planta.
- Configurar el crecimiento cámara como sigue: 200 μmol/ms radiación fotosintéticamente activa (PAR) 24 ± 1 ° C día y 21 ± 1 ° C noche, 60% de humedad y régimen de luz de día/noche de 14/10 h, respectivamente.
- Fina de cada maceta para dejar solamente una planta individual después de una semana de germinación. Tenga en cuenta para mantener las plantas de semillero con tamaño similar en cada maceta.
- Agua las macetas por verter agua directamente en la bandeja de plástico una vez cada dos días. Crecer las plantas durante cuatro semanas. Plantas de a. thaliana están listas para su uso posterior.
2. síntesis y caracterización de PNC
- Pesa 1,08 g de nitrato de cerio (III) y disolver en 2,5 mL de agua de grado de biología molecular en un tubo cónico de 50 mL.
- Pesan 4.5 g de ácido poli (acrílico) y disolver en 5 mL de agua de grado de biología molecular en un tubo cónico de 50 mL.
- Mezclar estas dos soluciones de fondo a 2.000 rpm durante 15 minutos usando un mezclador de tipo vórtex digital.
- Transferir 15 mL de solución de hidróxido de amonio (7,2 M) a un vaso de precipitados de vidrio de 50 mL.
- Agitación a 500 rpm, añadir la mezcla del paso 2.3 gota a gota a la solución de hidróxido de amonio y agitar a 500 rpm a temperatura ambiente durante 24 horas en una campana de humos.
- Cubrir el vaso con un trozo de papel para evitar la pérdida sustancial de solución durante la reacción durante la noche.
- Después de 24 h, transferir la solución resultante a un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 3.900 x g durante 1 h eliminar cualquier posible escombros y grandes aglomeraciones.
- Transferir este 22,5 mL de la solución sobrenadante a tres filtros de 15 mL 10 kDa y llenar el resto del filtro con agua grado molecular para hacer una dilución total de 45 mL.
- Purificar la solución sobrenadante de polímeros libres y otros reactivos con una centrífuga de sobremesa añadiendo el sobrenadante a un filtro de 15 mL 10 kDa y centrifugue a 3.900 x g durante 15 minutos repetición la operación con al menos seis veces.
- Medir la absorbancia del eluyente en cada ciclo con un espectrofotómetro UV-VIS de 220-700 nm para no polímeros libres y otros reactivos están presentes en la solución final de la PNC.
- Tomar la solución recogida de PNC en la jeringa de 5 mL y filtrar contra un 20 filtro de jeringa de tamaño de poro nm. Recoger la solución filtrada de la PNC en un tubo cónico de 50 mL.
- Tomar una solución final diluida de la PNC en una cubeta plástica y medir su absorbancia con el espectrofotómetro de UV-VIS de 220-700 nm. Pico de absorbancia de PNC es 271 nm.
- Calcular su concentración mediante el uso de la ley de Beer-Lambert: A = εCL. A es la absorbancia del valor máximo para una muestra determinada, ɛ es el coeficiente de absorción molar del PNC (cm-1 M-1), L es la longitud de trayectoria óptica (anchura de la cubeta, de 1 cm de este método) y C es la concentración molar de nanopartículas medidas.
- Medir el diámetro hidrodinámico y el potencial zeta de la PNC sintetizada utilizando un tamaño y zeta potencial analizador de partículas (figura 1).
- Almacenar la solución final del PNC en el refrigerador (4 ° C) hasta su uso posterior.
Nota: Por favor consulte Wu et al. 8 para más detalles de protocolo sobre caracterización de la PNC.
3. etiquetado PNC con colorante fluorescente DiI
- Mezclar 0,4 mL de 5 mM (58 mg/L) PNC con 3,6 mL de biología molecular agua de grado en un frasco de vidrio de 20 mL y remover a 500 rpm.
- Añadir 24 μl 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato colorante solución (DiI, 2,5 mg/mL diluido en DMSO) en 176 μl de DMSO (dimetil sulfóxido) a la solución de tinte de DiI.
- Agrega el tinte DiI gota a gota a la solución de la PNC, revolviendo a 1.000 rpm durante 1 min a temperatura ambiente.
- Transferir esta mezcla resultante en un filtro de 15 mL 10 kDa y llene el tubo a la tapa con agua de grado de biología molecular para hacer la dilución total 15 mL.
- Purificar el DiI etiquetado solución PNC (DiI-PNC) de DMSO y cualquier posible tinte libre de DiI mediante una centrifugación de sobremesa con el filtro de kDa 15 mL 10 a 3.900 x g durante 5 minutos.
- Repita paso 3.5 por lo menos cinco veces.
- Filtrar las soluciones de DiI-PNC finales a través de un 20 filtro de jeringa de tamaño de poro nm.
- Medir la absorbancia del final DiI-PNC por espectrofotometría UV-VIS y calcular su concentración conforme a la ley de Beer-Lambert (figura 2). Ver paso 2.13 para más detalles.
- Almacenar en un refrigerador a 4 ° C para su uso posterior.
4. infiltración de planta hojas con PNC
- Añadir 0,1 mL de infiltración lo tampón (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado por el ácido clorhídrico) en 0,9 mL de solución PNC o DiI-PNC de 0,5 mM y de vortex. Utilizar una solución de 10 mM de tampón con infiltración TES como control negativo.
- Transferir 0,2 mL de la solución de infiltración PNC o DiI-PNC a una jeringa sin aguja estéril de 1 mL. Puntee para eliminar las posibles burbujas de aire.
- Recuperar la planta de la cámara de crecimiento justo antes de la infiltración con nanopartículas para evitar el cierre de estomas posible bajo condiciones de luz ambiente.
- Antes de la infiltración, medir el contenido de clorofila de las hojas de a. thaliana con tamaño similar, usando un medidor de clorofila. Medir cada hoja con tres repeticiones (cada repetición que consiste en al menos tres mediciones)14. Elegir que hojas de a. thaliana con similar contenido de clorofila para el experimento de infiltración.
- Infíltrate en las hojas lentamente con la solución recientemente preparada de PNC o DiI-PNC presionando suavemente la punta de la jeringuilla sin aguja contra la parte inferior de la lámina de la hoja (cara abaxial) y presione el émbolo (figura 3A).
- Suavemente Limpie el exceso de solución que queda en la superficie de la lámina foliar (figura 3B) utilizando un limpiador delicado de la tarea (figura 3C) y etiqueta de la planta. Nueva tarea delicada uso toallitas para cada grupo de hojas.
- Mantenga la infiltrada a. thaliana plantas en el Banco para la adaptación de la hoja e incubación con PNC o DiI-PNC durante 3 horas.
Nota: Las plantas infiltrada a. thaliana son entonces listas para su uso posterior (figura 3D).
5. preparación de las muestras de hojas para Microscopía Confocal
- Rollo una cantidad del tamaño de guisante de la observación del gel a sobre un radio de 1 cm (figura 4A) y luego extenderlo hacia fuera hasta que quede 1 mm delgada en un portaobjetos de vidrio (figura 4B).
- Utilizar un perforador del corcho (diámetro 0,3 cm) para cortar una sección circular en el centro del gel de observación sobre el portaobjetos de cristal (figura 4C).
- Llenan el corte bien enteramente perfluorodecalina (PFD) para la resolución de imágenes más profunda y mejor confocal en tejidos de la hoja.
- Utilizar un perforador del corcho (diámetro 0,2 cm) recopilar discos de hoja de la DiI-PNC adaptada se infiltraron en las plantas de a. thaliana (figura 4D).
- Montaje del disco de hoja en el PFD llenado afrontar el infiltrado (abaxial) lado de la hoja.
- Poner un cubreobjetos cuadrado encima del disco de hoja y presione suavemente sobre el cubreobjetos portaobjetos uniformemente para sellar con el pozo del gel de la observación y no mantener burbujas de aire atrapado (figura 4E).
6. proyección de imagen de DiI-PNC en tejidos de la hoja mediante Microscopía Confocal
- Utilice un objetivo de 40 X en un microscopio confocal invertido del laser.
- Caída de dos a tres gotas de ddH2O en la parte superior de la lente del objetivo 40 X.
- Colocar el preparado DiI-PNC infiltrado hoja muestra portaobjetos en la parte superior el invertido 40 X lente objetiva.
- Asegúrese de que el lado del cubreobjetos pero no el vidrio Deslice contacto directamente con el ddH2O en la lente.
- Encontrar una región de interés en la muestra bajo el microscopio con luz láser o campo claro.
- Inicie el software del microscopio y encienda el láser de argón (fijado en el 20%).
- Coloque el agujero de alfiler para recoger un corte óptico menos de 2 μm y un promedio de línea de 4.
- Imagen de la muestra con la configuración del microscopio confocal: excitación de láser de 514 nm (30%); Espesor de sección Z-Stack: 2 μm; PMT1: 550-615 nm (para imágenes de DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (para proyección de imagen de cloroplasto).
- Tome imágenes confocales representativas de las muestras de hojas de diferentes personas, un mínimo de tres réplicas biológicas.
7. proyección de imagen PNC en vivo ROS borrado mediante Microscopía Confocal
- Preparar 25 μm 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, un tinte para indicar un ROS general) y 10 μm dihydroethidium (DHE, un tinte para indicar el anión superóxido) tintes en TES infiltración de tampón (pH 7,5) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, por separado.
- Utilizar un perforador del corcho (diámetro 0,2 cm) para recoger hojas discos de la PNC adaptado se infiltraron en las plantas de a. thaliana .
- Use la punta afilada de las pinzas para hacer tres o cuatro agujeros en los discos de hoja para acelerar el proceso de carga de tinte.
- Transferencia de la hoja discos a tubos de microcentrífuga con H2DCFDA y DHE por separado e incubar durante 30 min bajo la oscuridad.
- Después de la incubación, enjuague la hoja discos con ddH2O tres veces y montaje que en el cristal se deslice con la observación del gel (ver protocolo de sección 5).
- Colocar el portaobjetos en el microscopio confocal y enfocar manualmente a una región de células del mesófilo de la hoja. Ver protocolo de sección 6 para más detalles.
- Exponga los discos de hoja a los UV-A (405 nm) láser de 3 minutos generar ROS y registrar el cambio de intensidad de señal ROS en series de tiempo ("xyt") por disco de hoja.
- Imagen del disco de hoja con la configuración del microscopio confocal: 40 X agua objetivo; 496 excitación láser de nm; PMT1: 500-600 nm (de DHE y DCFDA tinte detección); PMT2: 700-800 nm (para detección de cloroplastos). Utilice una planta infiltrada con sólo infiltración tampón como control negativo.
8. PNC depuración de H2O2in vitro
- Realizar la actividad mimética de la CAT (catalasa) de la sintetizada PNC en vitro siguiendo los métodos anteriores publicaciones3,8,15
- Añadir 45.4 μL de infiltración x TES 1 buffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, ajustado por el HCl), PNC (60 nM, 3 μL) y H2O2 (2 μm, 1 μl) en un pozo (placa bien fondo redondo blanco 96) y suavemente mezclar mediante pipeteo.
- Añadir 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine (trabajo concentración 100 μm, 0,5 μl) y peroxidasa de rábano (HRP; trabajo concentración 0,2 U/mL, 0.1 μl) en el pozo, suavemente mezclar mediante pipeteo e incube durante 30 min 10-acetilo-3,7-dihydroxyphenoxazine reacciona con H2O2 y se convierte en resorufin en presencia de HRP.
- Envolver el plato con papel de aluminio para evitar la luz durante la incubación.
- Preparar un control negativo utilizando agua o buffer de reacción para reemplazar H2O2.
- Excepción de la solución madre, preparar todas las soluciones a temperatura ambiente.
- Después de la incubación, con un lector de placas, monitorear la absorbancia a 560 nm a utilizar resorufin para indicar el nivel de H2O2. Régimen de tiempo en 0, 2, 5, 10, 20 y 30 minutos.
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Representative Results
Caracterización y síntesis de la PNC .
PNC fueron sintetizados, purificada y caracterizada siguiendo el método descrito en la sección de protocolo 2. Figura 1 A muestra la coloración de las soluciones de nitrato de cerio, PAA, la mezcla de nitrato de cerio y PAA y PNC. Un cambio de color de blanco a amarillo claro es visto después de PNC se sintetiza. Después de la purificación con un filtro de 10 kDa, la PNC se caracterizaron con un espectrofotómetro UV-VIS. Se observó un pico de absorbancia de PNC a 271 nm (figura 1B). El eluyente final también se midió con UV-VIS para confirmar que los productos químicos no reaccionaron fueron lavados durante la purificación. El diámetro hidrodinámico y potencial zeta de la PNC sintetizada se midieron con un calibrador y zeta potencial analizador de partículas (figura 1C).
PNC etiquetado con tinte de DiI .
Para determinar la distribución de nanopartículas en vivo, PNC fueron etiquetadas con un colorante fluorescente de DiI siguiendo el método descrito en la sección 3 de protocolo. Tinte de DiI incrusta dentro de la capa de PNC espontáneamente ya que puede encapsular en los dominios hidrofóbicos dentro de las capas de polímero de nanoceria16. Después de agregar el tinte DiI a la solución de la PNC, un color rápido cambiar a rosado se observó (figura 2A). El DiI etiquetado PNC fueron entonces purificada con un filtro de 10 kDa y se caracteriza por una espectrofotometría UV-VIS. Tres picos claros de absorbancia de la DiI etiquetado PNC fueron observados (figura 2B). El eluyente final fue medido por espectrofotometría UV-VIS para confirmar que los productos químicos no reaccionó lavaron durante la purificación.
Infiltración de la lámina de la hoja.
PNC o DiI-PNC fueron entregados en hojas de a. thaliana mediante método de infiltración de lámina de la hoja tal como se describe en la sección 4 de protocolo. La hoja fue infiltrada en cuatro puntos diferentes para asegurar que el área foliar completo fue inundado con solución PNC (figura 3A). Cualquier resto de solución fue quitado de la superficie de la hoja (figura 3B y 3 C). El color de la hoja cambiado durante la infiltración de verde a verde oscuro (figura 3D). La jeringa se presionó suavemente contra la hoja para evitar cualquier daño físico.
Preparación de la muestra de hojas para microscopía de fluorescencia.
Las muestras de hojas se montaron en portaobjetos de vidrio dentro de un gel de observación hizo bien lleno de PFD. Después de rodar el gel de observación del tamaño de guisantes en la diapositiva (figura 4A y 4B), se hizo un pozo en medio del plano gel (figura 4C). Entonces, el disco de hoja recién preparado fue transferido al pozo que se llena previamente con solución PFD (figura 4D). Se utilizó un cubreobjetos para inmovilizar la muestra de la hoja en la diapositiva (figura 4E).
Proyección de imagen confocal de DiI-PNC en vivo .
DiI-PNC se infiltraron en a. thaliana hojas se utilizaron para determinar la distribución de DiI-PNC en las células de mesófilo de hoja vía proyección de imagen confocal (figura 5A y 5B). Para visualizar colocalización entre el DiI-PNC y cloroplastos, muestras foliares de DiI-PNC infiltrado fueron excitadas con un láser 514. La emisión de DiI-PNC fue fijada en 550-615 nm para evitar la posible interferencia de las señales de los pigmentos del cloroplasto después de ~ 650 nm17. El auto-fluorescencia de la clorofila de los cloroplastos fueron detectados de 700-800 nm. Los ajustes de proyección de imagen confocales fueron fijados (energía del laser y ganancia) para asegurarse de que no hay señales de tinte DiI fueron detectadas en la muestra de hoja de control (infiltrada con tampón sólo) (figura 5C). La colocalización de DiI-PNC con cloroplastos en las células de mesófilo de hoja se puede observar por la imagen de superposición de DiI-PNC detectado y autofluorescencia de pigmentos del cloroplasto(figura 5).
Proyección de imagen confocal de PNC ROS borrado en vivo .
PNC en solución de tampón 10 mM TES fueron entregados en hojas de a. thaliana mediante el método de infiltración de lámina de la hoja tal como se describe en la sección 7 de protocolo. DHE (dihydroethidium) y H2DCFDA (2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetato) tintes fluorescentes se utilizan para visualizar ROS en los tejidos de planta8,18. H2DCFDA es conocido por ser convertido a fluorescente DCF (2′, Diclorofluoresceína 7′, un indicador del grado de estrés oxidativo general) debido a la ruptura de los grupos acetato por ROS19. DHE es un tinte más específico para superóxido anión su producto fluorescente (2-hydroxyethidium) aumenta en reacción con el anión superóxido20. En vivo ROS depuración de PNC fue supervisada en discos de hoja de medición DHE y DCF colorante fluorescencia intensidad cambios (figuras 6A y 6B). PNC se infiltraron en la hoja de muestras se excitaron con 496 nm láser. La emisión de tinte DHE y DCF se fijó en 500-600 nm para evitar la posible interferencia con las señales de auto fluorescencia de cloroplasto. Auto-fluorescencia de pigmentos de cloroplastos fueron detectados de 700-800 nm. Después de 3 minutos de UV el estrés, el tinte ROS señales en PNC y tampón-infiltrado en muestras foliares fueron monitoreadas por separado. En comparación con el control de buffer no nanopartículas (NNP), PNC se infiltraron en hojas mostraron significativamente menos activado ROS fluorescente tinte de señal DCF (figura 6A). Resultados similares fueron encontrados también con el tinte DHE activado por el anión superóxido, donde hojas PNC infiltrado tuvieron significativamente menor intensidad de tinte DHE de búfer se infiltraron en hojas de control (figura 6B).
Ensayo de actividad mimética de PNC CAT . Análisis de depuración de PNC de H2O2 fue descrito en la sección 8 de protocolo. Una disminución de resorufin que indica el nivel de H2O2 en la mezcla de reacción que contienen PNC se observó (figura 7), confirmando la actividad mimética de gato de la PNC sintetizada.
Figura 1 : Síntesis y caracterización de PNC. A. coloración de nitrato de cerio, ácido de acrílico polivinílico (PAA), mezcla de nitrato de cerio y PAA y el PNC sintetizada (nanopartículas de óxido de cerio PAA revestido, amarillo claro). B. espectro de absorbancia de de PNC medido por espectrofotometría UV-VIS. Diámetro hidrodinámico de C. y zeta potencial del CNP sintetizado. Promedio ± error estándar (n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : PNC etiquetado con colorante fluorescente DiI. A. PNC (amarillo claro) y DiI teñir con solución PNC (DiI-PNC, rosa). B. espectro de absorbancia de de solución DiI-PNC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Hoja de la infiltración de la lámina de PNC o DiI-PNC. A. a. thaliana la hoja antes de la infiltración. La solución dentro de la jeringa es DiI-PNC. B. hoja infiltrada con DiI-PNC. C. la solución restante de la superficie de la hoja con la delicada tarea de limpieza de los trapos. D. limpiar hoja de a. thaliana que se infiltraron con DiI-PNC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Preparación de diapositivas muestra de hoja. Portaobjetos de vidrio de microscopia A. con geles de observación tamaño guisante. B. Deslice con geles planos de observación. C. Deslice con gel de observación plano con un pozo en el medio. D. Deslice con discos de hoja en el gel de observación bien llenado con solución de perfluorodecalina (PFD). E. Deslice con discos de hoja inmovilizados por cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Proyección de imagen de DiI-PNC en el mesófilo de la hoja las células mediante microscopia confocal. Muestra de A. hoja está montada sobre un microscopio confocal invertido teniendo un lente de inmersión de agua X 40. B. un microscopio confocal se utiliza para la proyección de imagen DiI-PNC y cloroplastos. Se registra C. cloroplasto auto-fluorescencia en las muestras de hojas de búfer que se infiltraron sin nanopartículas (NNP). D. DiI-PNC señal y cloroplasto auto fluorescencia es reflejada en las muestras de hojas se infiltraron en DiI-PNC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Control de PNC ROS rebuscar en planta mediante microscopia confocal. Colorante fluorescente A. DCF (para monitoreo general ROS de señal) es significativamente menor en las células de mesófilo de las plantas de la PNC se infiltraron en que control de búfer (sin nanopartículas, NNP). Fluorescente de B. reducido DHE tinte (para monitoreo de anión superóxido) en las células de mesófilo de las plantas PNC se infiltraron en relación a la del control de búfer (NNP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Actividad mimética de catalasa (CAT) de la PNC. En presencia de peroxidasa de rábano, la sonda fluorescente reacciona con peróxido de hidrógeno y se convierte en resorufin (absorbancia a 560 nm). Absorbancia de resorufin, que es indicativo de los niveles de peróxido de hidrógeno, fue monitoreada a 560 nm. PNC demostraron una actividad mimética de la CAT. Promedio ± SE (error estándar) (n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, describimos PNC síntesis, caracterización, colorante fluorescente etiquetado y proyección de imagen confocal de las nanopartículas en las células mesophyll vegetales para exhibir su en vivo ROS actividad libre-radical. PNC se sintetizan a partir de una mezcla de solución PAA en hidróxido de amonio y nitrato de cerio. PNC se caracterizan por spectrophotomery de absorción y la concentración determinada mediante ley de la cerveza-Lamberts. Medidas de potencial zeta confirman la superficie negativamente cargada de PNC para mejorar entrega a cloroplastos8. Etiquetado de PNC con un colorante fluorescente de DiI permite en vivo la proyección de imagen por microscopía confocal dentro de las células de mesófilo de hoja donde las nanopartículas muestran altos niveles de colocalización con cloroplastos. Utiliza tintes fluorescentes DHE y DCF, confirmamos eso acto de la PNC como un potente neutralizador de anión superóxido y ROS en vivo.
El método para sintetizar el PNC es un procedimiento paso a paso simple que genera nanopartículas de óxido de cerio con tamaño controlado, carga negativa y ROS barrido capacidades16. Otros métodos, tales como hidrólisis térmica, requieren de altas temperaturas y química costoso equipo21,22. La síntesis y caracterización de la PNC es un método de bajo costo, realizado con el equipo común de laboratorio. No requiere una curva de aprendizaje en comparación con los métodos moleculares en plantas basados en la sobreexpresión de una enzima antioxidante, por ejemplo, SOD, APXy gato, para rebuscar las especies ROS en el modelo de sistemas23. PNC es un sólido, soluble en agua ROS catalítico limpiador que no requiere clonación laborioso y métodos de transformación que dependen de maleabilidad genética de la planta y herramientas moleculares disponibles.
Un paso crítico en este protocolo es la infiltración basado en jeringa de células de mesófilo de hoja con PNC. Infiltración de nanopartículas en las plantas vivas debe hacerse suavemente para evitar daños físicos a la hoja24. Así, como en protocolo paso 4 de los métodos, empuje suavemente contra la superficie de la hoja con la jeringa para evitar rasgar o perforar la superficie abaxial de la hoja. Es mejor infiltrarse desde la superficie abaxial de la hoja de a. thaliana , ya que cuenta con mayor densidad estomática de la superficie adaxial25,26. Además, una solución de PNC o DiI-PNC dentro de la gama de pH fisiológico (~ pH 7,5) debe utilizarse durante la infiltración de lámina de la hoja. Otro paso crítico en este protocolo es la concentración adecuada de PNC se aplican en el tejido de la planta estudiada. En este protocolo, 50 mg/L de PNC no era tóxico para las hojas de a. thaliana permitiendo catalítico ROS PNC borrado. Algunas limitaciones del método de entrega de nanopartículas actual 1) no son aplicables a especies con cutículas gruesas y cerosas o baja densidad estomática, 2) no escalable para aplicaciones en el campo, 3) el alto costo de un sistema de microscopía confocal para controlar en vivo nanopartículas distribución y compactación de ROS.
Este protocolo muestra la aplicación de ROS depuración PNC para estudiar y mejorar la tolerancia a estrés abiótico en plantas a través de un fácil método de infiltración de lámina de la hoja. Acumulación de ROS se acompaña de estrés abióticos en plantas, que a su vez reduce la fotosíntesis de la planta, crecimiento y rendimiento8,27,28. Planta modificaciones genéticas métodos para manipulación de ROS en vivo a menudo se limitan a plantar especies modelo mientras que la depuración de PNC ROS tiene el potencial para aplicarse a especies de plantas de diverso tipo. Hoja lámina infiltración es un método de investigación práctica para aumentar la compactación de ROS en los tejidos de la hoja de comprensión y tolerancia al estrés abiótico planta de ingeniería.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Universidad de California, Riverside y USDA Instituto Nacional de alimentos y agricultura, proyecto de Portilla 1009710 J.P.G. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. 1817363 a J.P.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
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