Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.
Abstract
Ten opzichte van de kwesties van off-target effecten en de moeilijkheid van het invoegen van een lang fragment van DNA in de toepassing van ontwerper nucleasen voor genoom editing, embryonale stamcellen (ES) cel-gebaseerde gentargeting technologie beschikt niet over deze tekortkomingen en wordt op grote schaal gebruikt voor het wijzigen van dier/muis genoom variërend van grote verwijderingen/ingevoegde tot één nucleotide vervangingen. Met name, identificatie van de relatief weinig homologe recombinatie (HR) gebeurtenissen nodig zijn om de gewenste ES klonen is een belangrijke stap, die vraagt om accurate en betrouwbare methoden. Southern blotting en/of conventionele PCR worden vaak gebruikt voor dit doel. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures van die twee methoden gebruiken voor het identificeren van HR gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis ES cellen waarin het endogene Myh9-gen is bedoeld om te worden verstoord en vervangen door cDNAs codering van andere nonmuscle myosin zware ketting IIs (NMHC IIs). De hele procedure van Southern blotting omvat de bouw van targeting vector(s), electroporation, selectie van de drug, de uitbreiding en de opslag van ES cellen/klonen, de voorbereiding, de spijsvertering en van genomic DNA (gDNA), de kruising bevlekken en wassen van probe(s), en een laatste stap van autoradiografie op de X-ray films. PCR kan worden uitgevoerd rechtstreeks met bereid en verdunde gDNA. Ideaal om resultaten te verkrijgen, moeten de sondes en restrictie-enzym (her) snijden sites voor het Zuidelijke bevlekken en de inleidingen voor PCR zorgvuldig worden gepland. Hoewel de uitvoering van de Southern blotting is tijdrovend en arbeidsintensief en PCR-resultaten hebben valse positieven, de juiste identificatie door Southern blotting en de snelle screening door PCR de uitsluitende of gezamenlijke toepassing van deze methoden toestaan in deze paper wijd gebruikt en geraadpleegd te worden door de meeste laboratoria in de identificatie van genotypen van ES-cellen en genetisch gemodificeerde dieren.
Introduction
De technologie van gen richten door HR in lymfkliertest ES-cellen zorgt voor een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de cellulaire gevolgen van specifieke genetische mutaties1,2. Het belang en de betekenis van deze technologie worden weerspiegeld in de erkenning ervan door 2007 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde3,4; Ondertussen, het vertegenwoordigt de komst van het moderne tijdperk van gene engineering5. Gen richten via HR kan worden gebruikt om ingenieur vrijwel elke wijziging variërend van puntmutaties tot grote chromosomale herschikkingen in het genoom van muis ES cellen6,7. Het is algemeen bekend dat, vóór de opkomst van de zogenaamde genoom bewerkingsgereedschappen, de generatie van een gen knockout muis de toepassing van gentargeting technologie in ES cellen8,9,,10 vereist. Tijdens de afgelopen twee decennia, werden meer dan 5.000 gen-gerichte muizen geproduceerd door deze benadering voor het modelleren van ziekten bij de mens of studeren gene functies11. De inspanning van een genoom-brede knock-out is opgezet voor het distribueren van gentargeting vectoren, gerichte ES cel klonen en levende muizen naar de wetenschappelijke gemeenschap2,12,13,14 , 15. ongetwijfeld ES cel-gebaseerde HR-gemedieerde gentargeting technologie zich sterk ontwikkeld ons begrip van de functies van genen in fysiologische of pathologische verband gespeeld.
Omdat HR is een relatief zeldzame gebeurtenis in zoogdieren16,17, de belangrijke cellen en volgende stap na is gentargeting in lymfkliertest ES-cellen voor het analyseren van de talrijke kolonies van de ES voor het identificeren van een paar klonen met mutaties die voortvloeien uit HR met de targeting vector18. De gouden methoden voor het identificeren van HR gebeurtenissen omvatten Southern blotting en PCR19,20. De voordelen van de benaderingen omvatten dat Southern blotting correct gerichte ES klonen identificeren kunt en toelaat van onderzoekers voor het analyseren van de structuur van het gen-gerichte evenement, zoals een verificatie van de invoeging van een enkel exemplaar van de constructie, terwijl een PCR gebaseerde strategie vergunningen meer snelle screening voor HR gebeurtenissen21,22. Al deze methoden nadelen, zoals hebben dat ze tijdrovend en kunnen hebben valse positieven, de combinatorische gebruik van hen is breed geaccepteerd en toegepast door de meeste laboratoria in het identificeren van HR gebeurtenissen, vooral in ES-cellen, voor genereren van genetisch gemodificeerde dieren.
Drie isoforms van nonmuscle myosin II (NM II) in zoogdieren, elk bestaande uit twee identieke NMHC IIs die zijn gecodeerd door drie verschillende genen (met de naam Myh9, Myh10, en Myh14) en twee paren van lichte kettingen, worden aangeduid als NM II-A en II-B II-C23. Eerdere studies hebben aangegeven dat ten minste de isoforms van NM II-A en II-B zijn essentieel voor de ontwikkeling van de muis, omdat de in-vivo -ablatie van deze isoforms in embryonale letaliteit24,25,26 resulteert. Om dit probleem te omzeilen en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de isovorm-specifieke functies van NM II-A en II-B in de latere stadia van de ontwikkeling van de muis, een genetische vervanging strategie met behulp van ES cel-gebaseerde HR-gemedieerde gentargeting technologie werd aangenomen het genereren van een serie van muis modellen27. In de loop van het identificeren van de gewenste ES klonen, zowel Southern blotting en PCR methodes werden gebruikt, en dit bleek te zijn efficiënt en betrouwbaar27,28.
Deze paper wil een gedetailleerde beschrijving van het Zuidelijke bevlekken en PCR, met inbegrip van het ontwerp van de doelgerichtheid van vector(s), probe(s), en inleidingen en de uitvoering van experimenten, evenals de analyse van de resultaten wordt geïllustreerd door het identificeren van HR gebeurtenis voorval in ES-cellen voor het creëren van genetische vervanging NM II muis modellen en representatieve gegevens. De protocollen van deze twee methoden die hier gepresenteerd kunnen ook worden vastgesteld voor de identificatie van de genotypen van genetisch gemodificeerde cellen of dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp van Targeting bedrijfsscholen, sondes voor zuidelijke vlek en inleidingen voor PCR
- Selecteer de eerste codering exon (exon 2) van het Myh9 gen voor verstoring of opneming in de toepassing van knock-out/knock-in gemeld hier.
- Ophalen van de 5-kb upstream- en 5-kb downstream DNA-sequenties rondom de exon 2 van de Myh9 van de genome.ucsc.edu website.
- Beperking spijsvertering patronen van enzymen (REs) met 1 – 2 bezuinigingen in deze regio 10-kb analyseren met behulp van de pDRAW software om te bepalen van de geschikte RE(s) te verteren de genomic DNA voor het Zuidelijke bevlekken.
Opmerking: Dra ik voldoet aan deze eis en voor het doel is geselecteerd. - Selecteer een onmiddellijke 4 kb-fragment stroomopwaarts van de exon Myh9 2 als de linker homologie arm (LHA) en een 1,7 kb fragment onmiddellijke downstream volgorde als de juiste homologie arm (RHA); Kies een fragment 1 kb 5' stroomopwaarts van de LHA als de linker sonde (LP) voor Southern blotting en een fragment van 1,2 kb 3' stroomafwaarts van de RHA als de juiste sonde (RP), op basis van bovenstaande analyse.
- Een primer3 programma gebruikt voor het ontwerpen van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor deze vier fragmenten van DNA door PCR frequentiebanden te versterken. Ontwerp een paar inleidingen met de voorwaartse primer verbleven in de buurt van de 3'-terminal van een selectie marker neomyocin resistentie gen (P1) en de omgekeerde primer gelegen net buiten de RHA (P2).
Opmerking: Dit paar primer zal worden gebruikt voor het identificeren van gerichte ES klonen door PCR29. - Vind een 129Sv BAC kloon die betrekking hebben op muis Myh9 gene locus door naar de website van de bacpac.chori.org (Opmerking: isogene DNA heeft de voorkeur). Isoleren BAC DNA met behulp van een kit geschikt voor het zuiveren van grote stukken van DNA na de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Gezuiverde BAC DNA zal worden gebruikt als sjabloon voor PCR versterking. - Teken een schematische voorstelling van de targeting constructies, sondes en inleidingen om samen te vatten van deze informatie.
2. productie van doelgerichtheid bedrijfsscholen en sondes voor zuidelijke vlek, en de voorbereiding van inleidingen voor PCR
- Bestel de PCR inleidingen hierboven beschreven en los ze op in een concentratie van 20 µM.
- Versterken van de homologie armen en sondes door PCR in een reactie-oplossing inclusief 1 µL vooruit en 1 µL omgekeerde inleidingen, 1 µL van BAC DNA (50 ng) als de sjabloon, 5 µL van buffer voor Pfu en 1 µL van Pfu ultra als de polymerase van DNA , en H2O tot 50 µL. de PCR uit te voeren in een PCR machine onder de volgende voorwaarden: 95 ° C gedurende 3 min; 95 ° C gedurende 30 s; 60 ° C gedurende 30 s; 72 ° C en 1 kb/min; 30 cycli; Ten slotte, 72 ° C gedurende 10 minuten.
- Zuiveren van PCR producten met behulp van een PCR Schoonmaakbeurt kit volgens het protocol dat door de fabrikant verstrekte en elueer de DNA-fragmenten met 40 µL van H2O. Digest de gezuiverde PCR producten met vooraf ontworpen REs in een oplossing van de reactie met 5 µL van 10 x buffer for REs , 2.5 µL van RE1 en 2.5 µL van RE2, en de eluted DNA, bij 37 ° C gedurende 2 h. uitvoeren van een 1% DNA-gel accijnzen van de gel met doelDNA onder de UV-licht, te scheiden van DNA doelbandbreedtes zuiveren de target-DNA-fragmenten uit de gel met een DNA gel extractie kit volgens het Protocol geleverd door de fabrikant, en elueer de DNA-fragmenten met 40 µL van H2O.
- Kloon de homologie armen en vervanging expressie animatiefi in de mpNTKV-LoxP-vector volgens de volgorde van de versterkte en gezuiverde RHA, LHA en vervanging expressie animatiefi vrijgelaten uit andere vectoren te krijgen de laatste gericht op bedrijfsscholen. Klonen van DNA-fragmenten van de versterkte en gezuiverde sondes in de T-gemakkelijk vector.
- Bevestig de nucleotidesequenties van alle gekloonde DNA-fragmenten door sequentiebepaling27,28.
3. bereiding van doelgerichtheid bedrijfsscholen, de Electroporation van ES-cellen, en de versterking van ES klonen
- Bereiden elke targeting constructie met behulp van een plasmide maxiprep kit volgens het protocol geleverd door de fabrikant. Elke constructie plasmide Linearize door het verteren met niet ik in een reactie van de 400 µL inclusief 40 µL van 10 x buffer voor niet ik, niet ik 10 µL, 100 µg van DNA, en H2O tot 400 µL, bij 37 ° C's nachts.
- Zuiveren de gelineariseerde targeting bedrijfsscholen.
- Pak de verteerd reactie oplossing 1 x met een gelijk volume van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) en centrifuge op een troepenmacht van 2.000 x g gedurende 10 minuten.
- Het supernatant overbrengen in een nieuwe 1.5-mL-buis, het DNA met behulp van 2.5 x ethanol en 0.1 x 3M Natriumacetaat (pH 5.2) (volumeverhouding) neerslaat en centrifugeer bij een troepenmacht van 2.000 x g gedurende 10 minuten.
- Verwijder het supernatant, wassen het DNA pellet 1 x met 1 mL van 75% ethanol en centrifugeer bij een troepenmacht van 2.000 x g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en drogen van de DNA-pellet gedurende 5 minuten.
- Los de gelineariseerde DNA pellet in steriele buffer van Tris-EDTA (TE) op een eindconcentratie van 1 µg/µL.
- Meng 50 µg voor elke gelineariseerde targeting construct met 0,5 x 107 ES-cellen. Het uitvoeren van de electroporation op 320 V en 250 µF. plaat de electroporated ES-cellen op gerechten met neo-resistente MEF feeders.
- Na 24u, overschakelen naar ES cel medium met 400 µg/mL G418 en 200 µM ganciclovir en cultuur voor 4-5 dagen met een dagelijkse middellange verandering blijven. Pick-up resistente ES klonen in 48-Wells-platen.
Opmerking: Normaal, vier 48-Wells-platen worden gebruikt per construct. - Dupliceren van de 48-Wells-platen.
Opmerking: Een set van de platen is cryopreserved, en de andere reeks wordt gebruikt voor bereiding van genomic DNA.
4. voorbereiding van Genomic DNAS-systeem en de spijsvertering met Restriction Enzyme(s)
- GDNAs van ES-cellen met behulp van een commerciële kit (genomic DNA zuivering kit) met kleine wijzigingen voor te bereiden.
- Verwijder media uit de cultuur van de cel van de ES en voeg 500 µL van kernen lysis van de oplossing, waaronder RNaseA, direct aan de putjes Lyse de cellen.
Opmerking: De cel lysate kan worden opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk behandeld. - Pipetteer op en neer meermaals lyse de cellen volledig en overbrengen naar een schone 1.5-mL-buis.
- Toevoegen van een derde van het volume van het eiwit neerslag oplossing voor de 1,5 mL-buis, vortex krachtig gedurende 20 s, chill de monsters op ijs gedurende 5 minuten, en vervolgens, centrifugeer bij een troepenmacht van 2.000 x g voor 5 min. het supernatant overdracht aan een andere schone 1,5 mL tube contai ning een gelijke hoeveelheid isopropanol; Meng voorzichtig de oplossing. (Let op dat de witte draad-achtige strengen op dit moment kunnen worden beschouwd.) Centrifugeer bij een troepenmacht van 2.000 x g voor 1 min; vervolgens Verwijder het supernatant.
- Wassen van de gDNA pellet met 1 mL ethanol 70% bij kamertemperatuur, centrifuge op een troepenmacht van 2.000 x g voor 1 min, gecombineerd het supernatant zorgvuldig en vervolgens drogen de gDNA pellet gedurende 3 minuten.
- Los van de gDNAs met 100 µL van DNA rehydratie oplossing en, vervolgens, bij 65 ° C gedurende 1 uur, of bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
- Opslaan van de gDNAs bij 2-8 ° C.
- Verwijder media uit de cultuur van de cel van de ES en voeg 500 µL van kernen lysis van de oplossing, waaronder RNaseA, direct aan de putjes Lyse de cellen.
- De gDNAs met vooraf ontworpen RE Dra I. instellen van een 30-µL spijsvertering reactie door het mengen van 3 µL van 10 x Digest buffer voor Dra I, 3 µL van Dra ik, 10 µg van gDNAs/monster, en H2O tot 30 µL en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
- Controleren van de volledigheid van de spijsvertering door DNA-gel, 5 µL van het verteerd reactie, analyseren en voeg vervolgens de 3 µL van 10 x de buffer van de DNA-laden voor de volgende stap.
5. Southern Blotting en PCR identificatie
- Zuidelijke Bevlekkende screening
- Scheid de verteerd gDNAs door elektroforese en transfer naar een membraan.
- Voorbereiden van een 1% agarose gel elektroforese ethidiumbromide (EB), de monsters uit stap 4.3 en een ladder 1 kb laden en de gel met een laag voltage (30 – 40 V) 's nachts.
- Neem de gel en neem een foto met een DNA-gel-imaging systeem na elektroforese. Controleer of het verteerd en gescheiden gDNAs een uitstrijkje-achtige afbeelding weergeven.
- Geniet van de gel in een lade met 0,2 N HCl-oplossing en schud het zachtjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de gel aan DNA-denaturering oplossing en schud het zachtjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Schakel de gel in DNA-neutraliserende oplossing en schud het zachtjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De gel is gevoelig voor breuk na deze stap, dus het moet voorzichtig worden omgegaan. - Gebruik de snelle neerwaartse transfersysteem het DNAS-systeem van de gel overbrengen naar het membraan. Het monteren van de TurboBlotter en de Bevlekkende stack volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: 10 x of 20 x saline-Natriumcitraat (SSC) oplossing wordt gebruikt als een overdracht buffer. In het algemeen, is 3 h van overdracht genoeg om 95% van de gDNAs van gel naar membraan; een langere tijd van overdracht is echter onschuldig. - Neem het membraan en wassen met 2 x SSC voor 1 min, absorberen de vloeistof met weefsels, en dan het cross-link van het DNA met het membraan met behulp van een UV-crosslinker.
Opmerking: Het membraan kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende één week.
- Label de DNA-sondes met radioactiviteit.
- Zuiveren van de sonde plasmiden met behulp van een miniprep-kit volgens het protocol geleverd door de fabrikant.
- Release de DNA fragmenten van de sondes van de plasmide vector door EcoR ik spijsvertering in een oplossing van de reactie met inbegrip van 5 µL van buffer voor EcoR ik, 2 µL van EcoR ik enzym, 20 µg plasmide DNA en H2O tot 50 µL , gedurende 2 uur.
- Voer een 1% DNA gel voor het scheiden van de sonde DNA-fragmenten van de vector en zuiveren van de DNA-fragmenten van de sondes met een DNA-gel-extractie kit volgens het protocol geleverd door de fabrikant.
- Met behulp van 1 µL van DNA de oplossing, de DNA-concentratie van de sonde DNA-fragmenten te meten met een spectrofotometer bij een golflengte van 260/280 nm.
- 40-ng voor probe ANI in een tube van 1,5 mL met 45 µL van buffer voor TE bereiden, koken gedurende 3 minuten kort draaien en dan de sproeibuis(-buizen) te plaatsen op het ijs gedurende 2 minuten.
- De warmte-gedenatureerd sonde ANI's toevoegen aan de buis met kant-en-klare DNA-labeling kralen (-dCTP), Pipetteer omhoog en omlaag te mengen, voeg 5 µL van [α32P] dCTP, vervolgens, Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- De gelabelde sondes zuiveren met behulp van G-50 microcolumns volgens de instructies van de fabrikant en, vervolgens, het meten van de radioactiviteit door een Scintillatie teller (optioneel).
- Kruisen de membrane(s) met de gelabelde sondes.
- Prehybridize van het membraan.
- Prewarm de oplossing van de kruising bij 42 ° C gedurende 30 min. Mix 20 mL voorverwarmde hybridisatie oplossing met 200 µg gekookte zalm sperma DNA in een 50 mL-buis.
- Plaats het membraan in de kruising buis. Voeg de gemengde prehybridization oplossing aan de hybridisatie buis. Plaats het in de oven hybridisatie (set rollen en de temperatuur op 42 ° C) en laat de prehybridization gaan voor 30 min.
- Het membraan te vermengen met het label probe(s).
- Neem de tube van hybridisatie en giet de prehybridization oplossing in een tube van 50 mL; de gedenatureerde sonde (verwarmd bij 100 ° C gedurende 3 minuten) uit toevoegen stap 5.1.2.7 aan deze buis en meng voorzichtig.
Opmerking: Verminderen eventuele inducerend bubbels. - De gemengde oplossing terug te keren naar de kruising buis en uitvoeren van de kruising bij 42 ° C's nachts.
- Neem de tube van hybridisatie en giet de prehybridization oplossing in een tube van 50 mL; de gedenatureerde sonde (verwarmd bij 100 ° C gedurende 3 minuten) uit toevoegen stap 5.1.2.7 aan deze buis en meng voorzichtig.
- Prehybridize van het membraan.
- Wassen van de membrane(s) om te verwijderen nonhybridized sondes.
- Plaats de membrane(s) in een lade met 1 x SSC + 0,1% SDS en schud zachtjes bij 55-60 ° C gedurende 10 minuten.
- De membrane(s) overbrengen in een lade met 0,5 x SSC + 0,1% SDS en schud zachtjes bij 55-60 ° C gedurende 10 minuten.
- Controleer de radioactiviteit op de membrane(s) met behulp van een draagbare geigerteller om te beslissen of een derde wassen vereist is.
- De radioactiviteit op het membraan X-ray films bloot.
- Verwijder de vloeistof uit de gewassen membrane(s).
- De membrane(s) met plastic wrap hullen en monteren het/hen in het blootstelling cassette.
- Bloot het membraan naar twee bladen van X-ray film in een donkere kamer.
- Plaats de cassette van de blootstelling aan-80 ° C, overnachting of langer.
- Ontwikkelen van de films om te visualiseren van de resultaten. Beoordelen of een overeenkomstige ES kloon de gewenste dia met de gerichte recombinatie of niet, volgens de grootte van de DNA-bands gedetecteerd door de sondes.
- Rehybridize van de dezelfde membraan door een ander sonde na strippen uit de gebruikte sonde volgens de volgende procedure: Neem uit de gebruikte membraan, het wassen 1 x met schoon H2O en het vervolgens uit te broeden in striping oplossing (55% formamide, 2% SSPE, 1% SDS, H 2 O) bij 65 ° C met zacht schudden voor 1-2 h.
- Scheid de verteerd gDNAs door elektroforese en transfer naar een membraan.
-
PCR identificatie
- Uitvoeren van PCR identificatie van de gewenste ES klonen in een 50-µL reactie oplossing inclusief 5 µL van 10 x PCR buffer, 2 µL van 50 mM MgSO4, 1 µL van 10 mM dNTP, 1 µL van 20 µM voorwaartse primer, 1 µL van 20 µM omgekeerde primer , 1 µL van HiFi-platina Taq, gDNAs (~ 100 ng), en H2O tot 50 µL.
- Gebruik de oorzaken van de PCR-reactie: een initiële denaturatie bij 94° C gedurende 3 min, 30 cycli van denaturatie bij 94° C voor 30 s, gloeien bij 60° C gedurende 30 s en extensie bij 68° C voor 132 s, en een laatste stap van 68° C gedurende 10 minuten.
- Analyseer de PCR producten door elektroforese in 1,0% agarose.
- Klonen van de PCR-fragmenten met hun verwachte omvang in de T-gemakkelijk vector en volgorde ter bevestiging van de aanwezigheid van een partiële sequentie van de doel-vector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze paper, een gedetailleerd protocol van Southern blotting en PCR wordt beschreven, die wordt gebruikt om te identificeren HR gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis ES cellen voor de generatie van NM II genetische vervanging muismodellen, met behulp van cellen gebaseerde ES HR-gemedieerde targeting technologie. Hoewel Southern blotting en PCR, evenals traditionele gentargeting technologie, wijd voor enkele tientallen jaren gebruikt zijn, moet de succesvolle toepassing van hen zorgvuldig worden gepland. Ten minste deze aspecten dienen te worden beschouwd: de lengte van de lange en korte armen, de standpunten en de lengte van de sondes, de geschikte REs voor het snijden van de genomic DNAs-systeem en de inleidingen voor PCR, zoals samengevat in Figuur 1, die u kan helpen voor latere analyse. Als een belangrijke stap van het Zuidelijke bevlekken, de bereid en verteerd genomic DNAs-systeem dienen te worden gescheiden op DNA gel voor de detectie van de sonde. Omdat genomic DNAs zijn gesneden in een heleboel fragmenten met verschillende lengtes, weergegeven zij een uitstrijkje-achtige status op de DNA-gel, suggereren een volledige spijsvertering van de genomic DNAs-systeem, zoals aangegeven in Figuur 2. Als laatste stap van het Zuidelijke bevlekken, worden de signalen van een radioactiviteit-geëtiketteerden sonde kwekers met een doel DNA fragment weergegeven op de film, die weerspiegelen HR gebeurtenissen in de ES-klonen, waardoor die aangeeft of een kloon van ES de gewenste dia. Volgens het rioleringssysteem in deze studie hebben ES klonen met gemuteerde allel twee verschillende grootte bands, terwijl wild-type ES klonen slechts één band hebben, suggereren de gewenste ES klonen zijn heterozygoot (Figuur 3). Verhouding tot de procedure en de resultaten van het Zuidelijke bevlekken, de werking en de resultaten van PCR zijn eenvoudige en directe. Naar aanleiding van de PCR-reactie, de PCR producten kunnen worden geanalyseerd op de DNA-gel. Als de PCR-bands specifieke zijn en rangschikking van de gekloonde PCR producten bevestigt de aanwezigheid van een partiële sequentie van doel vector zoals een neo-resistentie gen, evenals genomic regio's die net buiten de homologie-arm, kan HR gebeurtenissen worden verwacht en gecontroleerd (Figuur 4).
Figuur 1 : Gericht op constructies. Dit is een schema te tonen van de generatie van meerdere targeting constructies. Het wild-type (WT) Myh9 gene allel, gentargeting vector, vervanging exogene expressie animatiefi, en de resulterende gemuteerde allele(s), evenals de sondes (LP, RP) voor zuidelijke vlek en de inleidingen (P1, P2) voor PCR, zijn getoond en eerder beschreven 27. een pijl op exon 2 geeft de translationeel initiatie-site. Na het succesvolle optreden van HR, de vervanging expressie cassette en het neomycine resistentie gen (Neor) worden ingevoegd slechts 5' van de initiatiefnemende ATG-codon. Daarom het endogene Myh9-allel wordt verstoord en het klopte-in-gene(s) is/zijn uitgedrukt in de mutantcellen en muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verteerd genomic DNAs-systeem met Dra I. Genomic DNAs-systeem van ES-klonen gericht met de constructie NMHC II-A vervangen door II-B zijn verteerd met Dra ik en, vervolgens, gescheiden op een agarose gel door elektroforese. Een uitstrijkje-achtige verteerd gDNA wordt waargenomen. C1 - C8 verbeelden individuele ES klonen. Een volledige spijsvertering van gDNA produceert een heleboel DNA-fragmenten met een verschillende lengte, waardoor een uitstrijkje-achtige afbeelding worden weergegeven. Dit resultaat weerspiegelt ook de goede kwaliteit van bereid gDNAs en de volledigheid van de spijsvertering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatieve resultaten van Southern blotting. Deze panelen tonen een zuidelijke Bevlekkende screening van de genomic DNAs-systeem van ES-klonen gericht met de constructie van de vervanging van NMHC II-A met II-AB, met behulp van de linker- en sondes. De gemuteerde allel toont een 12,1 kb of 6 kb band wanneer de linker sonde of juiste sonde wordt gebruikt, respectievelijk, terwijl de WT een 9.7 kb-band toont. M: marker; PC1-PC5: positieve klonen; NC: negatieve kloon. De grootte van de zuidelijke Bevlekkende bands zijn ook aangegeven. Alle procedures van Southern blotting strikt worden uitgevoerd en de specificiteit van de sondes is goed genoeg; Er mag geen nonspecific bands voor de verwachte bands verwachten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatieve resultaten van PCR. Dit paneel toont de PCR-identificatie van de genomic DNAs-systeem van ES-klonen gericht met de constructie van de vervanging van NMHC II-A met II-BA met behulp van de primer paar P1 + P2. De gemuteerde allel levert een 2.1 kb band, terwijl de WT-allel geen band levert. M: marker; PC1-PC3: positieve klonen; NC: negatieve kloon. De grootte van de PCR band wordt ook aangeduid. Aangezien de inleidingen zijn ontworpen om alleen detecteren de gemuteerde allel, weerspiegelt het uiterlijk van een enkele en verwachte band de specificiteit van de inleidingen en de hoge kwaliteit van de voorbereide gDNAs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op dit moment vervangen ontwerper nucleasen voor het bewerken van het genoom nog steeds niet ES cel-gebaseerde gentargeting technologie als gevolg van de problemen van off-target effecten en problemen bij het invoegen van een lange DNA fragment30,31. Als de gouden methoden voor het identificeren van HR gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis ES-cellen, biedt dit verslag een gedetailleerd protocol van Southern blotting en PCR voor het veld. We de betrouwbaarheid van deze methoden gevalideerd door het analyseren van de individuele klonen van muis ES cellen gericht met een aantal constructies. De gewenste ES klonen geïdentificeerd door deze methoden was met succes gebruikt voor het genereren van de bijbehorende muis modellen27.
Hoewel andere technieken voor de screening van gerichte ES klonen beschreven19,32, de methoden van Southern blotting zijn en PCR kan niet volledig worden vervangen door gevestigde die daarna32, omdat deze eerste technieken hebben een langer toegepaste geschiedenis en zijn geaccepteerd en bevestigd door de wetenschappelijke Sociëteit, uitgevoerd door de meeste biologische labs, en zijn de oorsprong van andere technologieën. Nog belangrijker is, wordt de goede prestaties van Southern blotting en PCR in de identificatie van HR gebeurtenissen goed geïllustreerd in eerdere werk29. De resultaten van het Zuidelijke bevlekken geven verschillende unieke eigenschappen: onder de willekeurig gescreend ES klonen, meer dan 90% van hen zijn gewenste, geen niet-specifieke banden worden gedetecteerd en de HR vond plaats bij voorkeur op één allel van het Myh9-gen. Ondertussen, de gegevens van PCR, samen met sequencing, bevestigen dat HR gebeurtenissen is sitespecifiek en goed overeenkomen met die van het Zuidelijke bevlekken.
Volgens onze praktijk, moeten verschillende factoren worden overwogen wanneer Southern blotting en PCR worden gebruikt voor het identificeren van HR gebeurtenissen in ES-cellen, waardoor het verkrijgen van goede en verwachte resultaten. De eerste is de lengte van de homologie armen; in het algemeen, het verhogen van de homologie arm lengte zal verbeteren van de efficiëntie van HR33. Dit is echter niet altijd het geval. Aan de ene kant, verhogen langere armen de moeilijkheid van manipulatie; aan de andere kant, resulteerde de lengte van de armen van de homologie (4 kb voor de linkerarm en 1,7 kb voor de rechterarm) gemeld hier in de hoogste HR frequentie tot nu toe verkregen onder soortgelijke experimenten. Bovendien is een redelijke homologie wapens vergemakkelijkt de identificatie door PCR. De tweede is het gebruik van isogene DNA voor het voorbereiden van de homologie armen en zuidelijke Bevlekkende sondes34. Dit kan worden voldaan door het bestellen van een kloon van de BAC met de regio van de gen-of-interest of met behulp van genomic DNA van de cellen, bestemd om te worden gericht. De derde is de selectie van geschikte REs voor verteren genomic DNAs-systeem. In het algemeen, hebben één RE of de combinatie van twee REs die het wild-type of mutant allel slechts een of twee keer rond de targeting regio snijden de voorkeur; Bovendien, de resulterende grotere fragment van DNA mag niet hoger zijn dan 15 kb en de grootte verschil tussen de verschillende DNA-fragmenten is meer dan 2 kb. Deze vereisten kunnen vergemakkelijken de scheiding en de identificatie van verwachte bands door Southern blotting. De vierde is de lengte van de sondes en de minste gelijkenis met andere reeksen in het genoom. In het algemeen, is de lengte van de sondes 500 – 1000 bp. De gelijkenis met de andere reeksen in het genoom kan worden geanalyseerd met het NCBI BLAST-programma. Bovendien, een software gebruikt voor het ontwerp de sondes voor Southern blotting is beschreven35. De vijfde factor beschouwd is het gebruik van de conventionele methoden voor te bereiden genomic DNA een betere opbrengst. Genomic DNAs bereid uit een confluente putje van de plaat van een 48-well zijn over het algemeen genoeg voor ten minste twee rondes van zuidelijke Bevlekkende analyses. Over het ontwerpen van de inleidingen voor PCR, is de beste strategie het gebruik van een primer aanwezig op het markeerteken van de selectie in combinatie met een primer buiten de targeting armen. Bovendien is het belangrijk voor het bewijzen van HR evenementen20,36sequencing van het PCR-producten. Met name vervangen PCR-gebaseerde screening niet volledig de informatie verkregen door Southern blotting, terwijl het kan effectief verminderen het aantal klonen worden geëvalueerd.
Kortom, zijn Southern blotting en PCR goed bewezen methoden voor het screenen van ES klonen ter identificatie van de HR-gemedieerde gentargeting gebeurtenissen in ES-cellen. Hoewel het gedetailleerd protocol beschreven hier vooral op de screening van gewenste NM II genetische vervanging ES klonen gericht, kan het worden gebruikt voor genotypering muizen die daarna worden gegenereerd met behulp van de positieve ES klonen. Het kan gemakkelijk worden aangepast aan de identificatie van HR gebeurtenissen in andere celtypen, zoals iPS cellen of somatische cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk kreeg steun van het algemene programma van nationale Natural Science Foundation van China (subsidies nr. 31571432), de menselijke provinciale Natural Science Foundation van China (Grant No. 2015JC3097) en het onderzoek Stichting voor onderwijs Bureau van Hunan Provincie, China (Grant No. 15 K 054).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
