Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58467
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1, 4, 5, 3, 1
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

Burada, fare embriyonik kök Southern blot ve/veya PCR kullanarak hücre Homolog rekombinasyon olayları tanımlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem ile nonmuscle myosin II genetik değiştirme fare modelleri geleneksel embriyonik kök hücre tabanlı Homolog rekombinasyon aracılı hedefleme teknolojisi kullanarak oluşturma tarafından örneklenir.

Abstract

Hedef kapalı etkileri konular ve genom düzenleme, embriyonik kök için tasarımcı nükleaz uygulamasında uzun bir DNA parçası ekleme zorluk göreceli (ES) hücre tabanlı gen hedefleme teknolojisi bu eksiklikleri yok ve yaygın büyük silme/eklemeler tek nükleotid oyuncu değişikliği için değişen hayvan/fare genom değiştirmek için kullanılır. Özellikle, görece az sayıda Homolog rekombinasyon (HR) olayları almak gerekli tanımlama ES klonlar doğru ve güvenilir yöntemler talepleri önemli bir adım isteniyorsa. Güney kurutma ve/veya geleneksel PCR kez bu amaçla kullanılmaktadır. Burada, hangi endojen Myh9 gene bozulur ve diğer nonmuscle myosin ağır zincir (NMHC IIS) IIS kodlama cDNAs tarafından yerini amaçlanmıştır fare ES hücrelerdeki İK olayları tanımlamak için bu iki yöntem kullanarak ayrıntılı yordamlar açıklanmaktadır. Southern Blot tüm prosedürü vector(s), çoğalmasıyla, ilaç seçimi, genişleme ve depolama ES Hücre/klonlar, hazırlık, sindirim hedefleme ve genomik DNA'ın (gDNA), hibridizasyon kurutma inşaat içerir ve probe(s) ve autoradiography son bir adım olarak röntgen filmleri yıkama. PCR doğrudan hazır ve sulandırılmış gDNA ile gerçekleştirilebilir. İdeal sonuçları elde etmek için sonda ve Restriksiyon enzimi (yeniden) Güney kurutma için kesme siteleri ve astar PCR dikkatlice planlanması gerekir. Southern Blot yürütme zaman alıcı ve emek yoğun ve PCR yanlış pozitif sonuçlara rağmen doğru kimlik Southern blot ve PCR tarafından hızlı tarama tarafından açıklanan bu yöntemlerin tek veya kombine uygulama izin yaygın olarak kullanılan ve genotip ES hücre ve genetik olarak tanımlaması içinde çoğu labs tarafından başvurulan için bu kağıt hayvanlar değiştiren.

Introduction

İK tarafından fare ES hücrelerde hedefleme gen teknolojisinin belirli genetik mutasyonlar1,2hücresel sonuçlarını dissekan için güçlü bir araç sağlar. Önem ve bu teknolojinin önemi onun tanıma Týp3,42007 Nobel Ödülü tarafından yansıtılır; Bu arada, gen mühendisliği5modern çağın gelişiyle temsil eder. İK ile hedefleme Gene nokta mutasyonlar büyük kromozomal düzenlemeler fare ES hücreleri6,7için genom içinde değişen hemen hemen herhangi bir değişiklik mühendisi için yararlı olabilir. İyi sözde genom düzenleme araçları ortaya çıkması daha önce bir gen nakavt fare nesil gen hedefleme teknolojisi ES hücreleri8,9,10uygulama gerekli olduğu bilinmektedir. Son iki yılda, 5.000'den fazla gen hedefli fareler insan hastalıkları modelleme veya gen fonksiyonları11eğitim için bu yaklaşım tarafından üretildi. Genom çapında nakavt çaba gen hedefleme vektörel çizimler, hedeflenen ES Hücre klonlar ve bilimsel topluluk2,12,13,14 canlı fareler dağıtmak için kurulmuştur , 15. şüphesiz, ES Hücre tabanlı HR-aracılı gen hedefleme büyük ölçüde anlayışımız fizyolojik veya patolojik bağlamda oynadı genlerin fonksiyonları gelişmiş bir teknoloji.

Çünkü İK memeli nispeten nadir bir olay16,17, önemli hücreleri ve sonraki takip adım gen fare ES hücrelerde çok sayıda ES koloniler meydana gelen mutasyonlar ile birkaç klonlar tanımlamak için analiz etmek için hedefliyor İK ile hedefleme vektör18. İK olayları tanımlamada altın yöntemleri Southern blot ve PCR19,20içerir. Southern Blot doğru hedeflenmiş ES klonlar belirleyebilir ve araştırmacılar inşa etmek, bir tek kopya ekleme bir doğrulama gibi gene hedefli olay yapısını analiz sağlar yaklaşımlar avantajları şunlardır iken bir PCR tabanlı strateji daha hızlı tarama İK olaylar21,22için izin verir. Bu yöntemlerin dezavantajları, gibi olsa onlar zaman alıcı ve var yanlış pozitif, onları kombinasyon kullanımı yaygın olarak kabul ve İK olaylar belirlenmesinde en labs tarafından uygulanan olduğunu, özellikle ES hücrelerdeki genetik olarak oluşturmak için modifiye hayvanlar.

Memelilerde, her üç farklı genler (adlandırılmış Myh9, Myh10 ve Myh14) ve hafif zincirleri, iki çift tarafından kodlanmış iki özdeş NMHC IIS oluşan nonmuscle myosin II (NM II) üç izoformlarının NM II-A, II-B ve II-C23adlandırılır. Önceki çalışmalarda en az bu belirtilmiştir var olduğundan bu izoformlarının in vivo ablasyon embriyonik ölümcül24,25,26' NM II-A ve II-B izoformlarının fare gelişimi için gereklidir. Bu sorunu aşmak ve Roman yorumlara izoformu özgü işlevleri NM II-A ve II-B içine fare geliştirme, genetik yerine daha sonraki aşamalarında edinmek için ES Hücre tabanlı HR-aracılı gen hedefleme teknolojisi kullanarak stratejisi için kabul edilmiştir fare modelleri27bir dizi oluşturur. Sırasında istenen ES klonlar belirlenmesi, Southern blot ve PCR yöntemleri kullanılmıştır ve bunlar verimli ve güvenilir27,28olduğu ortaya çıktı.

Bu kağıt Southern blot ve PCR, vector(s), probe(s) ve astar ve deneyler yürütülmesini yanı sıra İK olay tespit ederek örneği sonuçları analiz hedefleme tasarım dahil olmak üzere ayrıntılı bir açıklama sağlamak niyetinde olay ES hücrelerdeki genetik değiştirme NM II fare modelleri ve temsilcisi veri oluşturmak için. Burada sunulan bu iki yöntem protokollerin de genotip genetiği değiştirilmiş hücreler veya hayvanlar belirlemek için kabul edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. tasarım Construct(s), Southern Blot için sonda ve astar PCR hedefleme

  1. Myh9 gene bozulma veya ekleme için ilk kodlama exon (exon 2) nakavt/knock-in rapor burada uygulamada seçin.
  2. Genome.ucsc.edu Web sitesinden Myh9 exon 2 çevreleyen 5-kb ters yönde ve 5-kb aşağı akım DNA dizilerini almak.
  3. Kısıtlama sindirim desenleri enzim (REs) ile 1-2 kesim bu 10 kb bölgedeki Southern Blot için genomik DNA sindirmek için uygun RE(s) belirlemek için pDRAW yazılım kullanarak analiz.
    Not: Bu gereksinimi karşılıyorsa ve amaç için seçili Dra.
  4. Hemen bir 4 kb bölümünü seçin ters yönde Myh9 exon 2 sol Homoloji kolu (LHA) olarak ve 1.7 kb parçası anında akış aşağı sırası olarak doğru Homoloji kol (RHA); 1 kb parçası 5 Yukarıdaki analizi dayalı ' akıntıya karşı LHA Southern blot ve 1,2 kb parçası 3' aşağı RHA zırhı Delebilir doğru prob (RP), olarak sol sonda (LP) olarak seçin.
  5. Bir primer3 program bu dört DNA parçalarının PCR tarafından yükseltecek için ileriye ve geriye doğru astar tasarlamak için kullanın. Astar bir çift 3' terminal seçim işaretçisi neomyocin direnç gen (P1) ikamet ileri astar ve sadece RHA (P2) dışında bulunan ters astar tasarım yapın.
    Not: Bu astar çifti hedeflenen ES klonlar tanımlamak için PCR29tarafından kullanılır.
  6. Bacpac.chori.org Web sitesini ziyaret ederek fare Myh9 gen locus kapsayan bir 129Sv BAC klon bulmak (Not: isogenic DNA tercih edilir). BAC büyük üreticisi tarafından sağlanan yönergeleri izleyerek DNA parçaları temizlemek için uygun bir seti kullanarak DNA izole et.
    Not: Saf BAC DNA PCR güçlendirme için şablon olarak kullanılacak.
  7. Hedefleme yapıları, sondalar ve bu bilgileri özetlemek için astar şematik gösterimi çizin.

2. nesil Construct(s) ve sonda Güney leke için ve astar hazırlama PCR hedefleme

  1. Yukarıda açıklanan PCR astar sipariş ve onları 20 µM bir konsantrasyon geçiyoruz.
  2. Homoloji silah ve 1 µL ileri ve 1 µL ters astar, BAC DNA'ın 1 µL dahil olmak üzere bir reaksiyon çözümde PCR tarafından sondalar yükseltmek (50 ng) şablonu, 5 µL arabelleği için Pfu ve Pfu ultra DNA polimeraz olarak 1 µL , ve H2O kadar 50 µL. aşağıdaki koşullar altında bir PCR makinesi PCR gerçekleştirmek: 95 ° C 3 dakika; 95 ° C 30 s; 60 ° C 30 s; 72 ° C ve 1 kb/dak; 30 döngüleri; son olarak, 10 dk 72 ° C.
  3. PCR ürünleri üreticisi tarafından sağlanan protokolüne göre PCR temizleme seti kullanarak arındırmak ve DNA parçalarının H2o Digest 40 µL ile 10 x arabelleği 5 µL REs için içeren bir reaksiyon çözüm önceden tasarlanmış REs ile arıtılmış PCR ürünleri elute , 2.5 µL RE1 ve 2.5 µL RE2 ve 2 h. hedef DNA bantları ayrı, hedef DNA UV ışık altında içeren jel tüketim için % 1 DNA jel çalıştırmak için 37 ° C'de eluted DNA hedef DNA parçalarının bir DNA jel ekstraksiyon kiti according kullanarak jel üzerinden arındırmak iletişim kuralı için üretici tarafından sağlanan ve DNA parçalarının H2o 40 µL ile elute
  4. Nihai hedef elde etmek için diğer vektörlerinden yayımlanan güçlendirilmiş ve arıtılmış zırhı Delebilir, LHA ve değiştirme ifade cassette(s) sırasını göre mpNTKV-LoxP vektör içine Homoloji silah ve değiştirme ifade cassette(s) klonu Construct(s). Güçlendirilmiş ve arıtılmış probları DNA parçaları T kolay vektör kopyalayın.
  5. Tüm klonlanmış DNA parçalarının nükleotit dizileri sıralama27,28tarafından onaylayın.

3. hazırlık Construct(s), ES Hücre çoğalmasıyla ve ES klonlar amplifikasyon hedefleme

  1. Üreticinin sağladığı protokolüne göre bir plazmid maxiprep kit kullanarak her hedefleme yapı hazırlamak. Her yapı plazmid ile değil ben 10 x arabelleği 40 µL dahil değil ben, değil ben 10 µL, DNA, 100 µg için 400 µL tepki sindirerek tarafından linearize ve bir gecede H2O kadar 37 ° C'de 400 µL.
  2. Doğrusallaştırılmış hedefleme construct(s) arındırmak.
    1. Sindirilmiş tepki çözüm 1 hulâsa x eşit hacmi fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1) ve 10 min için bir kuvvet 2.000 x g , santrifüj ile.
    2. Yeni bir 1.5 mL tüp süpernatant transfer 2.5 etanol ve 0.1 x 3 M sodyum asetat (pH 5.2) x (hacim oranı) kullanarak DNA çökelti ve 2.000 x g 10 min için bir kuvvet, santrifüj kapasitesi.
    3. DNA ile % 75 etanol 1 mL 1 x cips ve 2.000 x g 5 min için bir kuvvet, santrifüj kapasitesi süpernatant, yıkama kaldırın.
    4. Süpernatant kaldırmak ve 5 min için DNA Pelet kuruması.
    5. 1 µg/µL son bir konsantrasyon, steril Tris-EDTA (TE) arabellekte Doğrusallaştırılmış DNA Pelet geçiyoruz.
  3. Her Doğrusallaştırılmış hedefleme yapı 0.5 x 10 ile 50 µg7 ES hücreleri karıştırın. Elektroporasyon 320 V, gerçekleştirmek ve 250 µF. neo-dayanıklı MEF besleyiciler ile electroporated ES hücreleri yemekleri üzerine plakası.
  4. Sonra 24 h, ES Hücre Orta 400 µg/mL G418 ve 200 µM Gansiklovir ile geçiş ve kültür için 4-5 gün ile bir günlük orta değiştirmek için devam etmek. İlaca dirençli ES klonlar 48-şey tabak içine almak.
    Not: Normalde, yapı dört 48-şey levhalar kullanılır.
  5. 48-şey plakaları yinelenen.
    Not: Plakaların bir set cryopreserved ve diğer küme genomik DNA hazırlık için kullanılır.

4. genomik DNA'lar ve sindirim Restriction Enzyme(s) ile hazırlanması

  1. GDNAs küçük değişiklikler ile ticari seti (genomik DNA arıtma seti) kullanarak ES hücrelerden hazırlayın.
    1. Medya ES Hücre kültürü kaldırın ve RNaseA, doğrudan wells için hücreleri parçalayıcı dahil olmak üzere çekirdek lizis çözeltinin 500 µL ekleyin.
      Not: Lysate hücre-80 ° C'de depolanan veya hemen tedavi.
    2. Damlalıklı tam hücreleri parçalayıcı ve temiz 1.5 mL tüp aktarmak için birkaç kez yukarı ve aşağı.
    3. Protein yağış eriyik-e doğru 1.5 mL Tüp, 20 için şiddetle girdap hacmi üçte birini eklemek s, 5 min için buz üzerinde örnekleri soğuk ve sonra santrifüj kapasitesi 2.000 x g 5 dk. başka bir temiz 1.5 mL tüp contai süpernatant aktarmak için bir kuvvet, Ning isopropanol eşit bir hacmi; çözüm karışımı yavaşça. (Beyaz iplik benzeri lifler Şu anda görülebilir unutmayın.) 2.000 x g 1 min için bir kuvvet, santrifüj kapasitesi; o zaman, süpernatant atmak.
    4. Oda sıcaklığında 1 dk. için 2.000 x g kuvveti, santrifüj gDNA pelet 1 mL % 70 etanol ile yıkama süpernatant dikkatle Aspire edin ve sonra 3 dk gDNA Pelet kuruması.
    5. GDNAs 100 µL DNA rehidrasyon çözüm ile dağıtılması ve sonra 1 h için 65 ° C'de veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
    6. GDNAs 2-8 ° C'de depolayın
  2. Dra için arabellek, ben, ben, gDNAs/örnek ve H2O 10 µg için 30 µL ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya Dra 3 µL Özet gDNAs ile ı. Dra ayarla 30-µL sindirim tepki kadar 10 x 3 µL karıştırılarak önceden tasarlanmış.
  3. Sindirim completeness sindirilmiş tepki 5 µL analiz DNA jel tarafından denetleyin ve sonra 10 sonraki adım için DNA-yükleme arabellek x 3 µL ekleyin.

5. Southern blot ve PCR tanımlama

  1. Southern Blot tarama
    1. Elektroforez ve bir membran aktarmak tarafından sindirilmiş gDNAs ayırın.
      1. % 1'özel Elektroforez jel etidyum bromür (EB) ile hazırlamak, adım 4.3 ve 1 kb merdiven örnekleri yükleyin ve jel gecede bir alçak gerilim (30-40 V) çalıştırın.
      2. Jel almak ve Elektroforez sonra DNA jel görüntüleme sistemi ile resim çekmek. Sindirilir ve ayrı gDNAs smear benzeri görüntü olup olmadığını kontrol edin.
      3. Jel içinde bir tepsi 0.2 N HCl çözüm ile ıslatın ve oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe için salla.
      4. Jel DNA denaturing eriyik-e doğru nakletmek ve oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe için salla.
      5. DNA nötralize çözüm içine jel geçin ve oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe için salla.
        Not: dikkatle ele gerekir bu yüzden jel sonra bu adımı kırılması eğilimli.
      6. Hızlı aşağı doğru transfer sistemi DNA'lar membran için jel aktarmak için kullanın. TurboBlotter ve kurutma yığın üretici tarafından sağlanan yönergelere göre bir araya getirin.
        Not: 10 x veya 20 x Serum sodyum sitrat (SSC) çözüm transfer tampon olarak kullanılır. Genel olarak, Transfer 3 h gDNAs % 95'i membran için jel aktarım için yeterlidir; Ancak, daha uzun bir süre transfer zararsız.
      7. Membran almak ve 2 ile yıkayın x SSC 1 dk, dokular ile sıvı emer ve UV crosslinker kullanarak membran ile DNA bölünmelerini.
        Not: Membran 4 ° C'de bir hafta boyunca saklanır.
    2. DNA probları radyoaktivite ile etiketleyin.
      1. Üreticinin sağladığı protokolüne göre miniprep kit kullanarak sonda plazmid arındırmak.
      2. Yayın DNA parçaları, EcoR tarafından plazmid vektöründen sondalar ben sindirim EcoR için arabelleği 5 µL dahil olmak üzere bir reaksiyon çözümde ben EcoR 2 µL ben enzim, plazmid DNA 20 µg ve H2O kadar 50 µL , 2 h için.
      3. DNA jel öğesinden sonda DNA parçaları ayırmak için % 1'çalıştırın ve sondalar üreticisi tarafından sağlanan protokolüne göre DNA jel ekstraksiyon kiti ile DNA parçaları arındırmak.
      4. DNA çözüm, 1 µL kullanarak bir dalga boyu 260/280, Spektrofotometre ile sonda DNA parçalarının DNA konsantrasyon ölçmek nm.
      5. 45 µL TE arabelleği ile 40-ng sonda DNA'lar bir 1,5 mL Tüp, hazırlamak, 3 dakikadır kaynatın, kısaca spin ve sonra buz 2 min için tüpler yerleştirin.
      6. Sonda ısı denatüre DNA'lar içeren hazır için DNA etiketleme boncuk tüp eklemek (-dCTP), yukarı ve aşağı mix [α32P] dCTP 5 µL ekleyin ve sonra 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya damlalıklı.
      7. G-50 microcolumns üretici tarafından sağlanan yönergelere göre kullanarak etiketli probları arındırmak ve sonra radyoaktivite tarafından bir mercek counter (isteğe bağlı) ölçmek.
    3. Membrane(s) etiketli probları ile melez.
      1. Membran prehybridize.
        1. Hibridizasyon çözüm için 30 dk. Mix 20 mL prewarmed hibridizasyon çözeltisi ile haşlanmış somon sperm DNA 50 mL tüp içinde 200 µg 42 ° C'de prewarm.
        2. Membran hibridizasyon tüp içine yerleştirin. Karışık prehybridization çözüm hibridizasyon tüp ekleyin. Hibridizasyon fırın (haddeleme kümesi ve 42 ° C sıcaklıkta) yerleştirin ve devam etmek için 30 dk prehybridization izin.
      2. Membran ile etiketli probe(s) melez.
        1. Hibridizasyon tüpü çıkarmak alır ve prehybridization solüsyonu 50 mL tüp içine dökün; (3 dk 100 ° C'de ısıtılmış) denatüre sonda--dan adım 5.1.2.7 Bu tüp ve karışımı yavaşça ekleyin.
          Not: herhangi bir ikna kabarcıklar azaltmak.
        2. Karışık çözüm hibridizasyon Metro için döndürün ve hibridizasyon 42 ° C'de gecede gerçekleştirin.
    4. Nonhybridized sondalar kaldırmak için membrane(s) yıkayın.
      1. Membrane(s) 1 x SSC + %0,1 SDS bir tepsi içine koyun ve 10 dk 55-60 ° C'de hafifçe çalkalanır.
      2. Membrane(s) 0.5 x SSC + %0,1 SDS tepsiye aktarın ve 10 dk 55-60 ° C'de hafifçe çalkalanır.
      3. Radyoaktivite membrane(s) tarihinde üçüncü bir çamaşır gerekli olup olmadığına karar vermek için taşınabilir bir Gayger sayacı kullanarak kontrol edin.
    5. Radyoaktivite röntgen filmleri için membran üzerinde maruz.
      1. Sıvı yıkanmış membrane(s) kaldırın.
      2. Membrane(s) plastik wrap ile sarmak ve pozlama kasete onları düzeltmek.
      3. Membran röntgen filmi karanlık bir odada iki levha için maruz.
      4. Gece veya daha uzun pozlama kaset-80 ° C'de yerleştirin.
    6. Sonuçları görselleştirmek için filmler geliştirmek. Karşılık gelen bir ES klon ile hedeflenen rekombinasyon veya boyutları probları tarafından algılanan DNA gruplarından göre değil, istenen bir olup olmadığını değerlendirmeniz.
    7. Aşağıdaki yordam göre kullanılan sonda kapalı sıyırma sonra başka bir robot tarafından aynı membran rehybridize: kullanılan membran al, temizle ile 1 x H2O temiz ve daha sonra şeritleme çözümde kuluçkaya (% 55 formamide, % 2 SSPE, % 1 SDS, H 2 O) 65 ° nazik için 1-2 h sallayarak ile C.
  2. PCR tanımlama
    1. PCR kimlik istenen ES klonların 10 x PCR arabellek, 50 mm MgSO4, 1 µL 10 mM dNTP 2 µL, 20 µM ileri astar 1 µL 5 µL, 20 µM ters astar 1 µL dahil olmak üzere 50 µL tepki çözeltilerine gerçekleştirmek , Yüksek-sadakat platin Taq, gDNAs 1 µL (~ 100 ng) ve H2O kadar 50 µL.
    2. Aşağıdaki PCR reaksiyon koşulları kullanın: bir ilk denatürasyon denatürasyon 94° C'de 30 çember daha 30 3 dk, 94° C'de 30 60 ° C'de tavlama s, s ve uzantı için 132 68° C'de s ve 68° c 10 min için son bir adım.
    3. PCR ürünlerinin % 1.0 özel Elektroforez tarafından analiz.
    4. PCR parçaları beklenen büyüklükleri ile T-kolay vektör ve hedef vektör kısmi bir dizi varlığını doğrulamak için sıra klonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yazıda, Southern blot ve PCR detaylı bir protokol, fare ES hücrelerde NM II genetik değiştirme fare modelleri, ES Hücre tabanlı HR-aracılı hedefleme teknolojisi kullanılarak üretimi için İK olayları tanımlamak için kullanılan açıklanmıştır. Southern blot ve PCR yanı sıra geleneksel gen hedefleme teknolojisi, birkaç on yıl için yaygın olarak kullanılmıştır rağmen onları başarılı uygulama dikkatlice planlanması gerekir. En azından bu yönleri dikkate alınması gerekmektedir: kısa ve uzun kolları, pozisyonlar ve sondalar, genomik DNA'lar ve astar PCR için Şekil 1' de, hangi yardım etmek için özetlenen kesim için uygun REs uzunluğu uzunluğu daha sonraki analiz. Southern Blot önemli bir adım hazırlanmış ve sindirilmiş genomik DNA'lar ayrılması için gerekli olan DNA jel sonda tarafından tespiti için üzerinde. Genomik DNA'lar parçaları farklı uzunlukları ile bir sürü halinde kesilmiş çünkü, Şekil 2' de gösterildiği gibi genomik DNA'lar, tam bir sindirim düşündüren DNA jel üzerinde bir karalama gibi durumu görüntüler. Southern Blot son bir adım olarak bir hedef DNA parçası ile hybridizing bir radyoaktivite etiketli sonda sinyalleri hangi, böylece bir ES klon istenen kişi olduğunu belirten ES klonlar İK olayların yansıtmak film üzerinde gösterilir. Vahşi tipi ES klonlar sadece bir grup, heterozigoz (Şekil 3) istenilen ES klonlar düşündüren bu çalışmanın predesign göre ES klonlar mutasyona uğramış alleli ile iki farklı boyutu Grup, vardır. Southern Blot sonuçlarını ve yordam için işlem ve PCR sonuçlarını basit ve doğrudan görecelidir. PCR reaksiyon PCR ürünleri analiz DNA jel üzerinde. PCR bantları özgüdür ve klonlanmış PCR ürünleri sıralama hedef vektör bir neo-direnç gen yanı sıra genomik bölgelerde Homoloji kol dışında sadece var gibi kısmi bir dizi varlığını doğruluyor, İK olayların olabilir beklenen ve (Şekil 4) doğrulandı.

Figure 1
Resim 1 : Yapıları hedefleme. Birden çok hedefleme yapıları nesil gösteren bir şemadır. Vahşi-tipi (WT) Myh9 gen alleli, gen hedefleme vektör, yedek eksojen ifade cassette(s) ve sonuç mutasyona uğramış allele(s) yanı sıra Güney leke ve PCR, astar (P1, P2) problar (LP, RP) gösterilen ve daha önce açıklanan 27. exon 2 bir ok translasyonel başlatma sitesi gösterir. İK başarılı geçtiği değiştirme ifade kaset ve paromisin direnç gen (Neor) eklendiği sadece 5' in Başlatan ATG kodon. Bu nedenle, endojen Myh9 alleli bozulur ve -knocked içinde gene(s) olduğunu/mutant hücreleri ve fareler ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Dra ı. ile genomik DNA'lar sindirilmiş II-B ile NMHC II-A yerine yapı ile hedeflenen ES klonlar üzerinden genomik DNA'lar vardır Dra ile sindirmek ve sonra bir özel jel elektroforez tarafından ayrılmış. Bir karalama benzeri sindirilmiş gDNA görülmektedir. C1 - C8 bireysel ES klonlar tasvir. GDNA tam bir sindirim DNA parçaları farklı uzunlukta, böylece bir karalama gibi görüntü görüntüleme ile bir sürü oluşturur. Bu sonuç aynı zamanda iyi bir kaliteye sahip hazır gDNAs ve hazım completeness yansıtır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Southern Blot temsilcisi sonuçları. Bu paneller genomik DNA'lar bir Güney blotting tarama NMHC II-A II-AB ile yerine yapı ile hedeflenen ES klonlar sol ve sağ problar kullanarak göstermektedir. WT 9.7 kb grup gösterirken sol sonda veya doğru sonda, sırasıyla, kullanıldığında mutasyona uğramış alleli 12.1 kb veya 6 kb şerit gösterir. M: işaret; PC1-PC5: pozitif klonlar; NC: negatif klon. Güney blotting bantları boyutları da belirtilir. Southern Blot tüm prosedürleri kesinlikle yapılmaktadır ve sondalar özgüllüğü oldukça iyi; bantları beklenen bantları için beklemek yok ettiren olmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : PCR temsilcisi sonuçlarını. Bu panel genomik DNA'lar PCR tanımlaması NMHC II-A II-BA ile yerine yapı ile hedeflenen ES klonlar P1 + P2 astar çiftini kullanarak gösterir. WT alleli hiçbir grup verir iken 2,1 kb Grup, mutasyona uğramış alleli verir. M: işaret; PC1-PC3: pozitif klonlar; NC: negatif klon. PCR Grup boyutu da belirtilir. Astar sadece mutasyona uğramış alleli algılamak için tasarlanmıştır beri bir tek ve beklenen grup görünümünü astar ve hazır gDNAs yüksek kaliteli özgüllük yansıtır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Şu anda, genom düzenlemek için tasarımcı nükleaz hala ES Hücre tabanlı gen hedefleme teknolojisi onun sorunları hedef kapalı efektleri ve uzun bir DNA parçası30,31ekleme zorluk nedeniyle yerini alamaz. Fare ES hücrelerde İK olayları tanımlamak için altın yöntemleri, bu raporu alan Southern blot ve PCR detaylı bir protokol sağlar. Biz bu yöntemler güvenilirliğini yapıları bir dizi hedef fare ES hücrelerden bireysel klonlar analiz ederek geçerliliği. Bu yöntemler tarafından tanımlanan istenen ES klonlar başarıyla karşılık gelen fare modelleri27oluşturmak için kullanılmaya başlanmış.

Bunlar ilk çünkü diğer teknikleri hedeflenen ES klonlar testi ile taranması için açıklanan19,32, Southern Blot yöntemi olmuştur ve PCR tamamen tarafından değiştirilemez olsa o bundan sonra32, kurdu teknikleri bir artık uygulanan geçmişi var ve yaygın olarak kabul edilir ve çoğu biyolojik labs tarafından gerçekleştirilen bilimsel toplum tarafından onaylandıktan ve diğer teknolojileri kökenlidir. Önemlisi, iyi bir performans Southern blot ve PCR İK olaylar tanımlaması içinde de içinde önceki iş29örneklenir. Southern Blot gelen sonuçları çeşitli benzersiz özellikler gösterir: rastgele filtrelenmiş ES klonlar arasında üzerinde bunların % 90 istenen olanlar, hiçbir spesifik olmayan bantları algılanır ve İK tercihen bir Myh9 gen alleli üzerinde oluştu. Bu arada, PCR, verileri sıralama, birlikte, İK olayların siteye özgü ve bu Southern Blot ile iyi eşleştiğini onaylayın.

Southern blot ve PCR ES hücrelerdeki İK olayları tanımlamak için böylece iyi ve beklenen sonuçları elde etmek kullanıldığında bizim uygulama göre çeşitli faktörler dikkate alınmalıdır. İlki Homoloji silah uzunluğudur; Genel olarak, Homoloji kol boyu artan İK33verimliliğini artıracaktır. Ancak, bu her zaman durum böyle değil. Bir yandan, kolların uzun manipülasyon zorluk artırmak; Öte yandan, rapor burada (4 kb için sol kol ve sağ kol için 1.7 kb) Homoloji silah uzunluğu defa benzer deneyler arasında elde edilen en yüksek insan kaynakları frekans sonuçlandı. Buna ek olarak, makul bir süre Homoloji silah PCR tarafından kimlik kolaylaştırır. İkinci isogenic DNA kullanımı Homoloji silah ve Southern Blot probları34için hazırlanıyor. Bu ilgi gen bölgesi içeren bir BAC klon sipariş veya hedef olması amacıyla hücrelerden genomik DNA kullanarak tatmin edilecek. Üçüncü genomik DNA'lar sindirerek için uygun REs seçimdir. Genel olarak, bir RE veya vahşi-türü veya mutant gen yalnızca bir veya iki kez hedefleme bölgenin çevresinde kesilmiş iki REs kombinasyonu tercih edilir; Ayrıca, elde edilen daha büyük DNA parçası 15 kb geçmemelidir ve 2 kb boyutu farktır farklı DNA parçaları arasında. Bu gereksinimleri ayrılık ve beklenen grup tanımlaması Southern Blot tarafından kolaylaştırabilir. Dördüncü sondalar ve diğer serilerini genomu ile en az benzerlik uzunluğudur. Genel olarak, sondalar 500 – 1000 bp uzunluğudur. Genom diğer serilerini ile benzerlik NCBI patlama programla analiz edilebilir. Ayrıca, Southern Blot için sonda olmuştur tasarım için kullanılan bir yazılım35nitelendirdi. Dikkate alınması gereken beşinci faktör genomik DNA artırıcı bir verim için hazırlamak için geleneksel yöntemleri kullanmaktır. 48-şey plaka konfluent bir kuyudan hazırlanan genomik DNA'lar genellikle yeterince Southern Blot analizleri en az iki tur için vardır. PCR için astar tasarlama konusunda en iyi strateji bir astar mevcut tarih seçimi işaretçi hedefleme silah dışında bir astar ile birlikte kullanmaktır. Ayrıca, PCR ürünleri sıralama İK olaylar20,36kanıtlamak için önemlidir. Özellikle, PCR tabanlı tarama tamamen etkili değerlendirilecek klonlar numaralarını azaltmak iken Southern Blot aracılığıyla elde ettiği bilgileri değiştiremez.

Sonuç olarak, Southern blot ve PCR HR-aracılı gen hedefleme olaylarda ES hücreleri tanımlamak için ES klonlar süzmek için iyi kanıtlanmış yöntemlerdir. Rağmen burada esas olarak açıklanan detaylı Protokolü istenen NM II genetik değiştirme ES klonlar tarama üzerinde duruldu, daha sonra olumlu ES klonlar kullanarak oluşturulan Genotipleme fareler için kullanılabilir. Diğer hücre tipleri, örneğin IP'leri hücreler veya somatik hücre İK olaylar tanımlaması için kolayca uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser destek genel programın Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (hibe No. 31571432), insan il doğal Bilim Vakfı Çin (Grant No. 2015JC3097) ve Araştırma Vakfı Eğitim Bürosu, Hunan aldı. Province, Çin (Grant No 15 K 054).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BAC CLONE BACPAC Resources Center (BPRC) bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct Kit QIAGEN 12462
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit QIAGEN 12963
PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Agilent 600382
T-easy vector Promega A1360
Nuclei Lysis Solution Promega A7941
Protein Precipitation Solution Promega A7951
DNA Denaturing Solution VWR 351-013-131
DNA Neutralizing Solution VWR 351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) VWR 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x Thermo Fisher 15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher 15593031
G418 Thermo Fisher 10131035
Salmon Sperm DNA Solution Thermo Fisher 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304029
Not I Thermo Scientific ER0592
Dra I Thermo Scientific ER0221
EcoR I Thermo Scientific ER0271
Ganciclovir Sigma G2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits Fisher Scientific 09-301-188
[α32P]dCTP PerkinElmer NEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution Millipore S4040
Kodak X-Ray Film Z&Z Medical 844 5702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

Tags

Genetik sayı: 141 Homolog rekombinasyon gen hedefleme Southern Blot PCR fare embriyonik kök hücre sonda astar genetik değişimi nakavt/knock-in Myh9 gene genomik DNA
Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T.,… More

Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T., Hu, Y., Li, Y., Kawamoto, S., Liu, C., Guo, S., Wang, A. Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58467, doi:10.3791/58467 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter