Summary
南しみが付くことおよび/または PCR を用いたマウス胚性幹細胞に発生した相同組換えイベントを識別するための詳しいプロトコルを紹介します。このメソッドは、伝統的な胚性幹細胞を用いた相同組換えを介したターゲット技術を使用して非ミオシン II 遺伝子交換マウス モデルの生成によって例証されます。
Abstract
オフターゲット効果の問題やゲノムの編集、萌芽期の茎のデザイナーの核酸分解酵素のアプリケーションで長い DNA 断片を挿入することの難しさに相対パス (ES) 細胞を用いた遺伝子ターゲティング技術これらの欠点を持たないし、広く動物/マウスのゲノムに至る大規模な削除/挿入単一のヌクレオチドの置換を変更するために使用。特に、比較的少数の相同組換え (HR) イベントを取得する必要を識別する希望 ES クローンです重要なステップ、正確かつ信頼性の高い方法を要求します。南しみが付くことおよび/または従来の PCR がしばしばこの目的に用いられます。ここでは、内因性 Myh9 遺伝子が中断しその他非ミオシン重鎖 IIs (NMHC IIs) をコードする Cdna を置き換え、マウス ES 細胞に発生した HR イベントを識別するためにこれらの 2 つの方法を使用しての詳細な手順について述べる。南しみが付くことの全体の手順は、vector(s)、エレクトロポレーション、医薬品の選択、拡大および ES 細胞/クローン、準備、消化のストレージをターゲットとゲノム DNA (gDNA) 交配のしみが付くことの建設を含む、渦、および x 線フィルムの放射線写真法の最後のステップの洗浄。PCR は、準備および希薄化後 gDNA を直接実行できます。理想的な結果を得るためには、プローブと制限酵素 (再) 南にしみが付くことのための切断サイトと PCR のためのプライマーを慎重に計画した必要があります。南しみが付くことおよび PCR による迅速スクリーニングによって正確に識別が説明されているこれらの方法の単独または複合アプリケーションを許可する南にしみが付くことの実行は時間のかかり、労働集約的な PCR の結果が偽陽性を持つも、本稿で広く使用され、ES 細胞の遺伝子は遺伝子型同定のほとんどの演習で相談する動物を変更しました。
Introduction
人事によるマウス ES 細胞のターゲット遺伝子の技術は、特定の遺伝の突然変異の1,2の細胞の結果を解剖するための強力なツールを提供します。この技術の意義と重要性は生理学または薬3,4の 2007 年のノーベル賞の認識に反映されます。一方、遺伝子工学5のモダンな時代の到来を表します。Hr ターゲット遺伝子は、マウス ES 細胞6、7のゲノムの大規模な染色体再配列に点突然変異に至るあらゆる変化を設計する利用できます。よく知られている遺伝子ノックアウト マウスの世代は、いわゆるゲノム編集ツールの出現前に、ES 細胞8,9,10の遺伝子ターゲティング技術の応用も必要です。過去 20 年間、5,000 以上の遺伝子をターゲットとしたマウスはヒトの病気のモデル化や遺伝子機能11を勉強してこのアプローチによって生成されました。ゲノム ノックアウト努力標的遺伝子ベクトル、目標とされた ES 細胞クローン、および科学界2,12,13,14に生きたマウスを配布するために設立されました,15. 確かに、ES 細胞を用いた人事を介した標的遺伝子技術は大きく進歩遺伝子生理学的または病理学的コンテキストで再生の機能の私達の理解。
マウス ES 細胞のターゲット遺伝子起因の突然変異で、いくつかのクローンを識別するための多数の ES 植民地を分析することです時間は哺乳類で比較的頻度の低いイベント16,17、重要な細胞し、次の次のステップターゲット ベクトル18HR。南しみが付くことおよび PCR19,20金 HR イベントを識別する方法があります。アプローチのメリットは、南しみが付くこと正しく目標とされた ES のクローンを識別することができ、コンストラクトの単一コピー挿入の確認など、遺伝子をターゲットとしたイベントの構造を解析する研究者を許可しながら、PCR に基づく戦略人事イベント21,22のより迅速なスクリーニングを許可します。これらのメソッドが、欠点など、彼らは時間がかかると、ことができますが、それらの組合せの使用の偽陽性、幅広く受け入れられ HR イベントの識別のほとんどの演習で適用、特に ES 細胞で遺伝子の生成の変更動物。
哺乳類で、それぞれ 3 つの異なる遺伝子 (名前付き Myh9、Myh10、および Myh14) と軽鎖の 2 つのペアでエンコードされた 2 つの同一の NMHC IIs で構成される非ミオシン II (NM II) の 3 つのアイソ フォームは、NM II、II B、および II C23と呼ばれます。以前研究が少なくともそれを示されている NM II、II B のアイソ フォームは、これらのアイソ フォームの生体内でアブレーションの結果胚性致死24,25,26マウスの開発のために不可欠です。採用された戦略の ES 細胞を用いた人事を介した遺伝子ターゲット技術を使用してこの問題を回避し、マウス開発、遺伝子交換の後の段階で NM II、II B のアイソ フォームに固有の機能に新しい洞察力を得るマウス モデル27のシリーズを生成します。希望の ES クローンを識別する過程で南にしみが付くことおよび PCR 法が活かされてとこれらが効率的かつ信頼性の高い27,28をあることを証明しました。
本稿は、南しみが付くことおよび PCR、vector(s)、渦、プライマー、および HR イベントの識別に代表される結果の分析だけでなく、実験の実行をターゲットのデザインなどの詳細な説明を提供するためにしようとします。ES 細胞モデルと代表的なデータ、遺伝交換 NM II マウスを作成するために発生します。ここに示す 2 つのメソッドのプロトコルは、遺伝子組み換え細胞や動物の遺伝子型を識別するためも採用できます。
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Protocol
1. ターゲットに Construct(s)、南しみ用プローブと PCR のためのプライマーの設計
- ここでレポートを選択して混乱やノックアウト ・ ノックインのアプリケーションで挿入 Myh9 遺伝子の最初のコーディング エクソン (exon 2)。
- 5 kb 上流と 5 kb 下流 DNA シーケンスgenome.ucsc.eduのウェブサイトから Myh9 エクソン 2 の周囲を取得します。
- 南しみが付くことのためのゲノム DNA を消化する適切な RE(s) を決定するための pDRAW ソフトウェアを使用してこの 10 kb の領域に 1-2 カットで酵素 (解像度) の制限消化パターンを分析します。
注: Dra 私はこの要件を満たしているしの目的の選択。 - 即時 4 kb フラグメントを選択 Myh9 エクソン左側相同アーム (LHA) として 2 と相同性を右の腕 (RHA); 1.7 kb フラグメントすぐ下流シーケンスの上流1 kb フラグメント 5' 上流南しみが付くことおよび 1.2 kb フラグメント 3' 下流右プローブ (RP)、RHA の左プローブ (LP) として LHA の上記の分析に基づくを選択します。
- Primer3 プログラムを使用すると、PCR によってそれらの 4 つの DNA のフラグメントを増幅するための前方および逆のプライマーを設計します。選択マーカー neomyocin 抵抗性遺伝子 (P1) の 3' ターミナル近く存在していた前方のプライマーとナ (P2) のすぐ外に位置する逆プライマー プライマーのペアを設計します。
注: このプライマーは目標とされた ES のクローンを識別するため PCR29によって使用されます。 - Bacpac.chori.orgのウェブサイトを訪問してマウス Myh9 遺伝子座をカバー 129Sv BAC クローンを見つける (注: 同質遺伝子 DNA が好ましい)。製造元によって提供される指示に従って DNA の大きい部分を浄化に適したキットを使用して BAC DNA を分離します。
注: BAC DNA の精製は、テンプレートとして PCR の拡大のため使用されます。 - ターゲットの構成要素、プローブ、およびこの情報を要約するプライマーの概略図を描画します。
2. ターゲットの世代 Construct(s)、サザンブロット、PCR のためのプライマーの準備用プローブ
- 上記、PCR のプライマーを注文し、それらを 20 μ M の濃度に溶解します。
- ホモロジーの腕そして 1 μ L 前後 1 μ L 逆プライマー、BAC DNA の 1 μ L を含む反応液の PCR によるプローブ増幅 (50 ng) テンプレート、Pfu のバッファーの 5 μ、1 μ L の DNA ポリメラーゼとして Pfu ウルトラ、H2O まで 50 μ L。 は次の条件で PCR マシンで PCR を行い: 95 ° C、3 分。95 ° C、30 秒。60 ° C、30 秒。72 ° C、1 kb/分。30 サイクル10 分の最後に、72 ° C。
- 製造元によって提供されるプロトコルに従って PCR クリーンアップ キットを使用して PCR の製品の浄化し、あらかじめデザインされた解像度解像度 10 x バッファーの 5 μ L を含む反応溶液中で精製 PCR 産物 H2o ・ ダイジェストの 40 μ L の DNA のフラグメントを溶出、2.5 μ L RE1 と RE2、と別のターゲット DNA バンド、UV 光の下で DNA の対象を含むゲルを消費税 1 %dna ゲルを実行 2 h. の 37 ° C で溶離された DNA の 2.5 μ L の DNA ゲル抽出キットに従ってを使用してゲルからターゲット DNA のフラグメントを浄化製造元によって提供されるプロトコルと H2O を 40 μ L の dna を溶出
- 最終ターゲットを取得する、増幅され、精製された RHA、LHA、交換式 cassette(s) 他のベクトルからリリースの順序に従って mpNTKV, ベクトルに相同性の腕と交換式 cassette(s) を複製します。construct(s)。T-簡単なベクトルに増幅され、精製されたプローブの dna を複製します。
- シーケンス27,28すべてのクローンとして作られた DNA 断片の塩基配列を確認します。
3. Construct(s)、ES 細胞のエレクトロポレーションと ES クローンの増幅をターゲットの作製
- 製造元によって提供されるプロトコルに従ってプラスミド maxiprep のキットを使用して各ターゲット構成を準備します。ない私、ない私の 10 μ L、100 μ g の DNA、10 x バッファーの 40 μ L を含む 400 μ L 反応でなかったそれの消化によって各コンストラクト プラスミドをリニア化と H2O まで 400 μ L、37 ° C で一晩します。
- 一直線に並べられたターゲット construct(s) を浄化します。
- 消化反応液 1 を抽出 x 2,000 x gの力で 10 分間遠心してフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) の等量。
- 上清を新しい 1.5 mL チューブに転送、(容積比)、エタノール、0.1 × 3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) × 2.5 を使用して DNA を沈殿させる、力 2,000 × g 10 分間遠心分離機します。
- DNA 75% エタノール 1 mL で 1 x をペレットし、2,000 x gで 5 分の力で遠心、上清洗浄を削除します。
- 上澄みを除去し、空気乾燥 5 分 DNA の餌。
- 最終濃度 1 μ g/μ L 滅菌トリス EDTA (TE) バッファーの線形 DNA のペレットを溶解します。
- 0.5 x 10 とそれぞれの線形ターゲット コンストラクトの 50 μ g の7 ES 細胞をミックスします。320 V でエレクトロポレーションを実行や 250 μ F。 ネオ耐 MEF の送り装置と料理に electroporated ES 細胞を板します。
- 24 h 後 400 μ G/ml G418 200 μ M ガンシクロビルと ES 細胞培地に切り替えて、毎日中型の変更で 4-5 日間の培養し続けます。48 ウェル プレートに薬剤耐性の ES クローンを拾います。
注: 通常、4 つの 48 ウェル プレートはコンストラクトあたりが使用します。 - 48 ウェル プレートを重複してください。
注: プレートの 1 つのセットは、凍結保存、およびゲノムの DNA の準備の他のセットが使用されます。
4. ゲノム Dna と Restriction Enzyme(s) と消化の準備
- マイナーな修正と市販キット (ゲノム DNA 精製キット) を用いた ES 細胞から gDNAs を準備します。
- ES の細胞培養からメディアを削除し、細胞を溶解する井戸に直接 RNaseA を含め、核溶解ソリューションの 500 μ L を追加します。
注: 細胞ライセートできます-80 ° C で保存またはすぐに治療します。 - 上下に数回セルを完全に溶解し、きれいな 1.5 mL チューブに転送をピペットで移しなさい。
- タンパク質沈殿物溶液 1.5 mL チューブに、積極的に 20 の渦の量の 3 分の 1 を追加 s、5 min のための氷のサンプルを寒さし、2,000 x gで 5 分間別のきれいな 1.5 mL チューブのコンテナ ボックスに転送上清の力で遠心分離寧等量のイソプロパノール;優しくソリューションをミックスします。(この時点で白い糸のような繊維を見ることができることに注意してください)。遠心力 2,000 × gで 1 分。その後、上澄みを廃棄します。
- 常温で 2,000 x gの力で 1 分間遠心する 70% エタノール 1 ml gDNA ペレットを洗って、慎重に、上清を吸引、その後、3 分間 gDNA ペレットを風乾します。
- DNA 補水液 100 μ L を gDNAs を溶解し、1 時間 65 ° c または 4 ° c を一晩インキュベートします。
- ストア 2-8 ° C で gDNAs
- ES の細胞培養からメディアを削除し、細胞を溶解する井戸に直接 RNaseA を含め、核溶解ソリューションの 500 μ L を追加します。
- ダイジェストと gDNAs は、10 倍の 3 μ L を混合することによって Dra I. 設定再 30 μ L 消化反応をあらかじめデザインされたバッファー Dra は Dra は 10 μ g gDNAs/サンプルと H2O の 30 μ L まで、37 ° C で一晩インキュベートの 3 μ L。
- DNA ゲル、消化反応の 5 μ L を分析して消化の完全性をチェックし、後続のステップのための DNA の読み込みバッファー x 10 の 3 μ L を追加します。
5. 南しみが付くことおよび PCR 検出
- 南しみが付くスクリーニング
- 電気泳動および膜への転送による消化 gDNAs を区切ります。
- エチジウム ブロマイド (EB) で 1% アガロースゲル電気泳動ゲルの準備、手順 4.3 と 1 kb の梯子からサンプルをロードし、一晩低電圧 (30-40 V) でゲルを実行します。
- ゲルを取り出し、電気泳動後、DNA ゲル イメージング システムで写真を撮る。消化と区切られた gDNAs が塗抹標本のようなイメージを表示するかどうかを確認します。
- 0.2 N 塩酸溶液とトレイにゲルを浸し、室温で 20 分間軽く振る。
- 解決の DNA 変化にゲルを転送し、室温で 20 分間ゆっくり振る。
- DNA 中和ソリューションにゲルを切り替えるし、室温で 20 分間軽く振る。
注: ゲルはこの手順の後の破損しやすいので、慎重に処理する必要があります。 - 膜にゲルから Dna を転送するのに高速の下り転送システムを使用します。TurboBlotter、製造元によって提供される指示に従ってあぶらとりスタックを組み立てます。
注: 10 x、20 x クエン酸塩ナトリウム (SSC) ソリューションは、転送バッファーとして使用されます。一般的に、転送の 3 h は膜にゲルから gDNAs の 95% を転送に十分なただし、転送の長い時間は無害ではありません。 - 膜を取り出して 2 で洗う 1 分 x SSC 組織液を吸収し、UV 架橋剤を用いる膜と DNA を架橋します。
注: 膜は 4 ° C で 1 週間保存できます。
- 放射能と DNA プローブをラベルします。
- 製造元によって提供されるプロトコルに従って miniprep のキットを使用してプローブ プラスミドを浄化します。
- EcoR によってプラスミッドのベクトルからプローブのリリース DNA フラグメント私 EcoR バッファーの 5 μ L を含む反応液の消化は 2 μ L EcoR の私 H2O 50 μ L まで、20 μ g のプラスミド DNA の酵素、2 時間。
- DNA ベクターからプローブ DNA のフラグメントを分離するゲル 1% を実行し、製造元から提供されたプロトコルに従って DNA ゲル抽出キットとプローブの DNA のフラグメントを浄化します。
- 260/280 の波長の分光光度計とプローブ DNA 断片の DNA 濃度の測定 1 μ L の DNA 溶液を使用して nm。
- TE バッファーの 45 μ L で 1.5 mL チューブにおけるプローブ Dna の 40 ng を準備、3 分煮る、簡単にスピンし、2 分間氷の上、尿管を合わせます。
- 準備ができて移動する DNA 標識ビーズを含むチューブに熱変性プローブ Dna を追加 (-dCTP)、ミックス [α32P] dCTP の 5 μ L を追加し、37 ° C、15 分間インキュベートし、上下にピペットで移しなさい。
- 製造元によって提供される指示に従って G-50 配向柱状を使用して分類されたプローブの浄化し、(省略可能) シンチレーション カウンターで放射能を測定し。
- 分類されたプローブと、membrane(s) を交配させます。
- 膜を prehybridize します。
- Prewarmed ハイブリダイゼーション溶液 50 mL チューブにゆでたサケ精子 DNA の 200 μ g に 30 分ミックス 20 mL 42 ° C で交配ソリューションを prewarm します。
- ハイブリダイゼーション チューブに膜を配置します。ハイブリダイゼーション チューブに混合の prehybridization ソリューションを追加します。(セット ローリングと温度 42 ° C で) ハイブリダイゼーション オーブンにそれを置くし、prehybridization 30 分進みます。
- ラベル付きの渦と膜を交配させます。
- ハイブリダイゼーション チューブを取り出して 50 mL のチューブに prehybridization の溶液を注ぐステップ 5.1.2.7 からの (100 ° C で 3 分間加熱) 変性プローブをこの管とミックスに優しく追加します。
注: は、誘導する任意の気泡を減らします。 - ハイブリダイゼーション チューブに混合液を戻り、一晩 42 ° C で交配を実行します。
- ハイブリダイゼーション チューブを取り出して 50 mL のチューブに prehybridization の溶液を注ぐステップ 5.1.2.7 からの (100 ° C で 3 分間加熱) 変性プローブをこの管とミックスに優しく追加します。
- 膜を prehybridize します。
- Nonhybridized プローブを削除する membrane(s) を洗ってください。
- 1 x SSC + 0.1 %sds とトレイに、membrane(s) を配置し、10 分の 55-60 ° C で軽く振る。
- 0.5 x SSC + 0.1 %sds とトレイ、membrane(s) に転送、10 分の 55-60 ° C で軽く振る。
- 3 つ目の洗濯が必要かどうかを決定するポータブル ガイガー カウンターを使用して、membrane(s) の放射能をチェックします。
- X 線フィルムに膜の放射能を公開します。
- 洗浄 membrane(s) から液体を削除します。
- プラスチック製のラップと membrane(s) を包むし、露出カセットでそれ/それらを修正します。
- 暗い部屋で x 線フィルムの 2 枚の膜を公開します。
- 一晩以上-80 ° c の露出のカセットを配置します。
- 結果を可視化するフィルムを開発します。対応する ES クローンがターゲットの再結合またはプローブによって検出された DNA バンドのサイズに従い、目的の 1 つかどうかを評価します。
- 次の手順に従って使用されるプローブを除去した後、別のプローブによる同じ膜を rehybridize: 使用膜を取り出し、それを洗う 1 x H2O をきれいにし、ストライピング ソリューションでそれを孵化させなさい (55% ホルムアミド、2% 1 %sds、SSPE H2O) で 1-2 時間穏やかな揺れで 65 ° C。
- 電気泳動および膜への転送による消化 gDNAs を区切ります。
-
PCR 検出
- 10 x PCR バッファー、10 mM dNTP の 50 mM MgSO4、1 μ L の 2 μ、1 μ L の 20 μ M 前方のプライマーの 5 μ、1 μ L の 20 μ M 逆プライマーを含む 50 μ L 反応液の PCR 検出目的の ES クローンを実行します。、忠実度の高いプラチナ Taq、gDNAs の 1 μ L (~ 100 ng)、および H2O 50 μ L まで。
- 次の PCR 反応条件を使用: 30 変性 94 ° C での 30 サイクル 3 分 94 ° C で初期変性 30 60 ° C で熱処理 s s と 132 68 ° C で拡張子 s、および 68 の ° C 10 分のための最後のステップ。
- 1.0% アガロース電気泳動で PCR の製品を分析します。
- T-簡単なベクトルと目標点のベクターの部分シーケンスの存在を確認するシーケンスに PCR のフラグメントのサイズを複製します。
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Representative Results
本稿では南しみが付くことおよび PCR の詳しいプロトコルは説明した、ES 細胞ベース人事を介したターゲット技術を使用して、NM II 遺伝子交換マウス モデルの世代のマウス ES 細胞に発生した HR イベントを識別するために利用されます。南しみが付くこと、PCR、伝統的な標的遺伝子技術は数十年間広く使用されている、しかしそれらの成功のアプリケーションは、慎重に計画する必要があります。少なくともこれらの側面が考慮される必要があります: 長い、短い腕、位置およびプローブのために有用である図 1にまとめたように、PCR のゲノム Dna とプライマーを切断するための適切な解像度の長さの長さその後の分析。南しみが付くことの重要なステップとして準備し、消化されたゲノム Dna は区切る必要 DNA ゲル、プローブによる検出のために。ゲノム Dna は、多くの異なる長さの断片にカットされため、図 2に示されているように、ゲノム Dna の完全な消化力を示唆、DNA ゲルの塗抹標本のようなステータスが表示されます。南しみが付くことの最後のステップとしてターゲット DNA フラグメントと放射能標識プローブの信号が、ES クローンが目的の 1 つであるかどうかを示すため、ES クローンの HR イベントの発生を反映するフィルムに表示されます。本研究では predesign によると変異アレルを持つ ES クローンがある 2 つの異なるサイズのバンド、野生型 ES クローンのみが目的の ES クローンがヘテロ接合体 (図 3) を示唆して、1 つのバンド南しみが付くことの結果と手順に関連して、操作と PCR の結果、シンプルで直接。次の PCR の反作用の PCR の製品を分析できる DNA ゲル。人事イベントが発生がすることができる場合は PCR バンドが特定、目標点のベクター ネオ抵抗性遺伝子と相同性腕だけ外にあるゲノム領域などの部分的なシーケンスの存在を確認 PCR の製品をクローンとして作られたシーケンス期待し、(図 4) を確認します。
図 1: ターゲット構造。これは、複数のターゲット構成の生成を示す模式図です。南しみの PCR のためのプライマー (P1、P2) プローブ (LP, RP) と同様、(WT) Myh9 遺伝子の野生型対立遺伝子、遺伝子ターゲット ベクトル、交換外因性式 cassette(s) と結果変異 allele(s) を表示され、前に説明しました。27. エクソン 2 にある矢印は、翻訳開始サイトを示します。交換式カセットとネオマイシン耐性遺伝子 (ネオr) の挿入成功した人事を発生する時に、次のわずか 5' ATG 開始コドンの。したがって、内因性 Myh9 遺伝子を破壊、ノックの遺伝子/変異細胞およびマウスで表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: I. Dra でゲノム Dna を消化II B NMHC II A に置き換える構成の対象と ES クローンのゲノム Dna は、私 Dra で消化し、その後、agarose のゲルの電気泳動によって分離します。塗抹標本のような消化された gDNA を観察します。C1 - C8 には、個々 の ES クローンが描かれています。GDNA の完全な消化力は、塗抹標本のようなイメージを表示することにより、異なる長さを持つ DNA 断片の多くを生成します。この結果は、準備された gDNAs の良い品質と消化の完全性にも反映されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 南にしみが付くことの代表の結果。これらのパネルは、左と右のプローブを用いた ES クローン II AB、NMHC II A に置き換えるの構築の対象からゲノム Dna の南しみが付くスクリーニングを表示します。左プローブまたは最適なプローブを使用する場合、それぞれ、WT 9.7 kb のバンドを示す一方、変異遺伝子は 12.1 kb または 6 kb のバンドを示しています。M: マーカー;PC1 PC5: 肯定的なクローン;NC: 否定的なクローン。南しみが付くバンドのサイズも示されます。南しみが付くことのすべての手順は、厳密に実施し、プローブの特異性は十分。非特異バンドが期待されるバンドの期待はないはずです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: PCR の代表の結果。このパネルは、P1 + P2 プライマー対を用いて ES クローン NMHC II A を置き換えて II BA の構築の対象からゲノム Dna の PCR 検出を示しています。変異遺伝子は、WT 対立遺伝子はバンド生成されません間 2.1 kb バンドを得られます。M: マーカー;PC1 PC3: 肯定的なクローン;NC: 否定的なクローン。PCR バンドのサイズはまた示されています。だけ変異遺伝子を検出するプライマーは、以来、シングル、期待されるバンドの出現はプライマーと準備 gDNAs の高品質の特異性を反映しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
現在、ゲノム編集デザイナー核酸は、オフターゲット効果の長い DNA フラグメント30,31を挿入の難しさの問題のため ES 細胞を用いた遺伝子ターゲティング技術をも置き換えることはできません。人事イベントが発生したマウス ES 細胞を識別するため黄金のメソッドとしては、このレポートは、フィールドの南にしみが付くことおよび PCR の詳細なプロトコルを提供します。個々 の構成要素のシリーズの対象にマウス ES 細胞からのクローンを分析することによってこれらのメソッドの信頼性を検証します。これらのメソッドによって識別される希望の ES クローンは、対応するマウス モデル27を生成する正常に使用されていた。
目標とされた ES クローンのスクリーニングのための他の技術は記述されていた19,32、南しみが付くことの方法をされている PCR を完全に置き換えすることはできませんが、これら設立その後32、これら初期のため技術もはや適用された歴史を持っていると広く受け入れられているとほとんどの生物研究所、科学の社会によって確認された、他の技術の起源。重要なは、人事イベントの識別に南にしみが付くことおよび PCR の良好なパフォーマンスは、以前の仕事29例示されても。南しみが付くことからの結果は、いくつかのユニークな特徴を示す: 無作為に選別された ES クローン間以上それらの 90% が必要なもの、非特異的なバンドが検出されない、HR が Myh9 遺伝子の 1 つの対立遺伝子に優先的に発生しました。一方、一緒にシーケンス、PCR からデータ確認、人事イベントの発生は特定、南しみが付くからとよく一致します。
私たちの実践によると南しみが付くことおよび PCR を ES 細胞の HR イベントを識別するために使用が良いと期待される結果を得るためにいくつかの要因が考慮必要があります。最初の 1 つが相同性の腕の長さ一般に、相同の腕の長さを増加 HR33の効率を高めます。ただし、これは常にそうではありません。長い腕が操作の難易度を高める一方、その一方で、ここで報告される相同性腕 (4 kb の左腕と右腕の 1.7 kb) の長さ同様の実験の中で、これまで得られた最高の時間周波数になったまた、ホモロジー腕の合理的な長さ PCR による同定が容易になります。2 番目は、相同性腕および南しみが付くプローブ34準備同質遺伝子 DNA の使用率です。これは、興味の遺伝子の領域を含む BAC クローンの発注によってまたは対象となるもので細胞からゲノム DNA を使用して満たすことができます。3 番目は、ゲノム Dna を消化を適切な解像度の選択です。一般に、1 つの日時またはターゲット地域の周囲野生型や突然変異対立遺伝子だけ一度か二度にカット 2 つの解像度の組み合わせが優先されます。さらに、結果のより大きい DNA のフラグメントは 15 kb を超えないようにしてください。 と異なる DNA 断片の大きさの違いが 2 kb を超える。これらの要件は、南しみが付くことによって、分離と期待されるバンドの同定を促進できます。4 番目は、プローブとゲノムの他のシーケンスに最小類似性の長さです。一般的には、プローブの長さは、500-1,000 bp です。ゲノムの他のシーケンスとの類似性は、NCBI BLAST プログラムで分析できます。さらに、南しみが付くことのためプローブがされているデザインに使用されるソフトウェアは、35をについて説明します。考慮すべき第 5 要因は強化収量のゲノム DNA を準備する従来の方法を使用します。48 ウェル プレートの合流もから調製したゲノム Dna が南しみが付く分析の少なくとも 2 つのラウンドを十分に一般に。PCR のためのプライマーを設計する最善の戦略はターゲットの腕外プライマーと組み合わせて選択マーカーの存在 1 つのプライマーを使用します。さらに、PCR の製品のシーケンスは、HR イベント20,36を証明するため重要です。特に、PCR ベースのスクリーニングは完全にそれが効果的に評価するクローンの数を削減しながら、南しみが付くこと、によって取得した情報を置き換えることはできません。
結論としては、南しみが付くことおよび PCR はスクリーニング ES クローン ES 細胞で HR を介した遺伝子を対象としたイベントを識別するために十分な方法です。ここで主に説明した詳細なプロトコルは必要な NM II 遺伝子交換 ES クローンのスクリーニングに焦点を当てて、それは肯定的な ES クローンを使用して生成された、その後マウスのジェノタイピング使用できます。IPS 細胞や体細胞などの他の細胞型の HR イベントの識別を簡単に適合できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業は、一般的なプログラム、研究財団の教育局の湖南省、人間地方自然科学基金、中国の (許可番号 2015JC3097)、国家自然科学基金、中国の (許可番号 31571432) からの支援を受けてください。中国、省 (許可第 15 号 054 K)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20x | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
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