Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58467
Automatic Translation
*1,2, *1, *3, 1, 1, 1, 4, 5, 3, 1
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at identificere homologe rekombination begivenheder, der fandt sted i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige blotting og/eller PCR. Denne metode er eksemplificeret ved generation af nonmuscle myosin II genetiske udskiftning musemodeller ved hjælp af traditionelle embryonale stamcelle-baseret homologe rekombination-medieret målretning teknologi.

Abstract

Relative spørgsmål af off-target effekter og vanskeligheden ved at indsætte en lang DNA-fragment i anvendelsen af designer nukleaser for genom redigering, embryonale stamceller (ES) celle-baserede gen-targeting teknologi har ikke disse mangler og er bredt bruges til at ændre dyr/mus genom spænder fra store sletninger/Tilføjelser til enkelt nucleotid udskiftninger. Navnlig, at identificere de relativt få homologe rekombination (HR) begivenheder nødvendig for at opnå det ønskede ES kloner er et afgørende skridt, som kræver præcise og pålidelige metoder. Sydlige blotting og/eller konventionelle PCR er ofte brugt til dette formål. Her beskriver vi de detaljerede procedurer for at bruge disse to metoder til at identificere HR begivenheder, der fandt sted i mus ES-celler, hvor det endogene Myh9 genet er bestemt til at blive forstyrret og erstattet af cDNAs kodning andre nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). Hele proceduren i det sydlige blotting omfatter opførelse af målretning vector(s), elektroporation, drug udvælgelse, ekspansion og opbevaring af ES celler/kloner, forberedelse, fordøjelsen, og duppe genomisk DNA (gDNA), hybridisering og vask af sonderne og et sidste skridt af Autoradiografi på X-ray film. PCR kan udføres direkte med rede og fortyndet gDNA. For at opnå ideelle resultater, bør sonder og begrænsning enzym (RE) skære websteder for det sydlige blotting og primere for PCR planlægges omhyggeligt. Selv om udførelsen af det sydlige blotting er tidskrævende og arbejdskrævende og PCR resultater har falske positiver, den korrekte identifikation af sydlige blotting og hurtig screening af PCR tillade alene eller kombineret anvendelse af disse metoder, der beskrives i dette papir til almindeligt anvendte og høring af de fleste labs i identifikation af genotyper af ES-celler og genetisk modificerede dyr.

Introduction

Teknologien i gen målretning af HR i murine ES-celler giver et kraftfuldt værktøj til dissekere de cellulære konsekvenser af specifikke genetiske mutationer1,2. Vigtigheden og betydningen af denne teknologi er afspejlet i sin anerkendelse af 2007 Nobelprisen i fysiologi eller medicin3,4; i mellemtiden, repræsenterer det fremkomsten af den moderne æra af genet engineering5. Gen målretning gennem HR kan udnyttes til at ingeniør stort set enhver ændring lige fra punktmutationer til store kromosomale rearrangementer i genomet af musen ES celler6,7. Det er velkendt, at generation af et gen knockout mus før fremkomsten af såkaldte genom redigeringsværktøjer, kræves anvendelse af gen-targeting teknologi i ES celler8,9,10. I løbet af de seneste to årtier, blev mere end 5.000 gen-målrettet mus produceret af denne tilgang til modellering menneskelige sygdomme eller studerer genet funktioner11. En genome-wide knockout indsats er blevet etableret til at distribuere gen-targeting vektorer, målrettede ES celle kloner og levende mus til forskersamfundet2,12,13,14 , 15. uden tvivl ES cellebaserede HR-medieret gen-targeting teknologi er meget avanceret vores forståelse af funktionerne af gener spillede i fysiologiske eller patologiske sammenhæng.

Fordi HR er en forholdsvis sjælden begivenhed i pattedyr celler16,17, den vigtige og næste skridt efter er gen målretning i murine ES-celler at analysere talrige ES kolonier til at identificere et par kloner med mutationer som følge af HR med målrettet vektor18. Guld metoderne til identifikation HR begivenheder omfatter sydlige blotting og PCR19,20. Fordele ved metoderne omfatter at sydlige blotting kan identificere korrekt målrettet ES kloner og gør det muligt for forskere at analysere strukturen i den gen-målrettet begivenhed, som en bekræftelse af en enkelt kopi indsættelse af konstruktion, mens en PCR-baseret strategi tillader hurtig screening for HR begivenheder21,22. Selv om disse metoder har ulemper, som at de er tidskrævende og kan have falske positiver, den multikombinerbare brugen af dem er bredt accepteret og anvendt af de fleste labs i at identificere HR begivenheder, især i ES-celler, for generering af genetisk modificerede dyr.

Tre isoformer af nonmuscle myosin II (NM II) i pattedyr, hver bestående af to identiske NMHC IIs, der er kodet ved tre forskellige gener (opkaldt Myh9, Myh10 og Myh14) og to par Lyskæder, omtales som NM II-A, II-B og C II23. Tidligere undersøgelser har vist at mindst isoformer af NM II-A og II-B er afgørende for musen udvikling, fordi i vivo ablation af disse isoformer resulterer i embryonale dødelighed24,25,26. At omgå dette problem og få nye indsigter i isoform-specifikke funktioner NM II-A og II B i de senere stadier af udvikling af mus, en genetisk udskiftning strategi ved hjælp af ES cellebaserede HR-medieret gen-targeting teknologi blev vedtaget for at generere en serie af mus modeller27. I forbindelse med at identificere de ønskede ES kloner, både det sydlige blotting og PCR metoder blev udnyttet, og disse viste sig for at være effektive og pålidelige27,28.

Dette papir har til hensigt at give en detaljeret beskrivelse af det sydlige blotting og PCR, herunder design af målretning vector(s), sonderne, og primere og udførelsen af eksperimenter, samt analyse af resultater eksemplificeret ved at identificere HR begivenhed forekomst i ES-celler til at skabe genetisk udskiftning NM II mus modeller og repræsentative data. Protokoller af disse to metoder præsenteres her kan også vedtages for at identificere genotyper af genetisk modificerede celler eller dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design af målretning Construct(s), sonder til sydlige skamplet, og primere for PCR

  1. Vælg den første kodning exon (exon 2) af Myh9-genet for forstyrrelser eller indsættelse i anvendelsen af knockout/knock-i rapporteret her.
  2. Hente de 5-kb opstrøms og 5-kb downstream DNA-sekvenser omkring Myh9 exon 2 fra webstedet genome.ucsc.edu .
  3. Analysere begrænsning fordøjelsen mønstre af enzymer (REs) med 1 – 2 nedskæringer i denne 10-kb region ved hjælp af pDRAW software til at bestemme egnet RE(s) at fordøje den genomisk DNA til sydlige blotting.
    Bemærk: Dra jeg opfylder dette krav og er valgt til formålet.
  4. Vælg en 4 kb fragment umiddelbart opstrøms af Myh9 exon 2 som venstre homologi arm (LHA) og en 1,7 kb fragment umiddelbare downstream sekvens som rigtige homologi arm (RHA); Vælg et 1 kb fragment 5' opstrøms af LHA som venstre sonden (LP) for det sydlige blotting og en 1,2 kb fragment 3' nedstrøms af RHA som rigtige sonden (RP), baseret på ovenstående analyse.
  5. Brug et primer3 program til at designe de frem og bak primere for forstærke disse fire DNA fragmenter af PCR. Designe et par af primere med den fremad primer opholdt sig nær 3' terminalen af et udvalg markør neomyocin resistens gen (P1) og den omvendte primer ligger lige uden for RHA (P2).
    Bemærk: Denne primer par vil blive brugt til at identificere målrettede ES kloner af PCR29.
  6. Finde en 129Sv BAC klon dækker mus Myh9 gen locus ved at besøge webstedet bacpac.chori.org (Bemærk: isogene DNA er at foretrække). Isolere BAC DNA ved hjælp af et babysæt egnet til rensning af store stykker af DNA følge anvisningerne fra producenten.
    Bemærk: Renset BAC DNA skal bruges som skabelon for PCR-amplifikation.
  7. Tegne en skematisk fremstilling af målretning konstruktioner, sonder og primere til at sammenfatte disse oplysninger.

2. generation af målrettet Construct(s) og sonder til sydlige skamplet, og forberedelse af primere til PCR

  1. Bestil PCR primere beskrevet ovenfor og opløse dem ind i en koncentration på 20 µM.
  2. Forstærke homologi arme og sonder ved PCR i en reaktion løsning herunder 1 µL frem og 1 µL omvendt primere, 1 µL af BAC DNA (50 ng) som skabelonen, 5 µL af buffer for Pfu og 1 µL af Pfu ultra som DNA polymerase , og H2O op til 50 µL. udføre PCR i en PCR-maskine på følgende betingelser: 95 ° C i 3 min. 95 ° C til 30 s; 60 ° C i 30 s; 72 ° C og 1 kb/min. 30 cykler; Endelig, 72 ° C i 10 min.
  3. Rense PCR produkter ved hjælp af en PCR oprydning kit i henhold til protokollen fastsat af fabrikanten og elueres DNA-fragmenter med 40 µL af H2O. fordøje de renset PCR produkter med foruddesignede REs i en reaktion løsning indeholdende 5 µL af 10 x buffer for REs , 2,5 µL af RE1 og 2,5 µL af RE2, og den eluted DNA ved 37 ° C i 2 h. køre en 1% DNA gel til at adskille DNA målzoner, punktafgifter gel med target-DNA i UV-lys, rense target DNA fragmenter fra gel ved hjælp af en DNA gel udvinding kit ifølge til protokollen fastsat af fabrikanten, og elueres DNA-fragmenter med 40 µL af H2O.
  4. Klon homologi arme og udskiftning udtryk cassette(s) i mpNTKV-LoxP vektor ifølge den forstærkede og renset RHA, LHA og udskiftning udtryk cassette(s) frigivet fra andre vektorer for at opnå den endelige målretning Construct(s). Klon DNA fragmenter af de forstærkede og renset sonder til T-let vektoren.
  5. Bekræfte nukleotidsekvenser af alle klonede DNA fragmenter af sekventering27,28.

3. forberedelse af rettet mod Construct(s), elektroporation af ES-celler og forstærkningen af ES kloner

  1. Forberede hver målretning konstruktion ved hjælp af en plasmid maxiprep kit i henhold til protokollen fastsat af fabrikanten. Linearize hver konstruere plasmid af fordøje det med jeg ikke en 400 µL reaktion herunder 40 µL af 10 x buffer for ikke I, 10 µL af ikke jeg, 100 µg af DNA, og H2O op til 400 µL ved 37 ° C natten over.
  2. Rense af lineært rettet mod construct(s).
    1. Uddrag den fordøjede reaktion løsning 1 x med et lige saa stort volumen af Phenol: Chloroform: Isoamyl alkohol (25:24:1) og centrifugeres ved en kraft af 2.000 x g i 10 min.
    2. Overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube, udfældes DNA ved hjælp af 2,5 x ethanol og 0,1 x 3M natriumacetat (pH 5,2) (volumen ratio) og centrifugeres ved en styrke på 2.000 x g i 10 min.
    3. Fjern supernatanten, vask DNA pellet 1 x med 1 mL af 75% ethanol, og der centrifugeres ved en styrke på 2.000 x g i 5 min.
    4. Fjern supernatanten og lufttørre DNA pellet i 5 min.
    5. Opløse den lineariseret DNA pellet i sterile Tris-EDTA (TE) buffer i en endelig koncentration på 1 µg/µL.
  3. Bland 50 µg for hver lineariseret målretning konstruktion med 0,5 x 107 ES celler. Udføre elektroporation på 320 V og 250 µF. plade electroporated ES-celler på retter med neo-resistente MEF foderautomater.
  4. Efter 24 h, skifte til ES celle medium med 400 µg/mL G418 og 200 µM ganciclovir og fortsat kultur for 4-5 dage med en daglig medium forandring. Afhente resistente ES kloner i 48-godt plader.
    Bemærk: Normalt, fire 48-godt plader anvendes pr. konstruktion.
  5. Duplikere 48-godt plader.
    Bemærk: Et sæt af pladerne er befrugtede, og andet sæt bruges for genomisk DNA forberedelse.

4. forberedelse af genomisk DNAs og fordøjelse med Restriction Enzyme(s)

  1. Forberede gDNAs fra ES-celler ved hjælp af en kommerciel kit (genomisk DNA rensning kit) med mindre ændringer.
    1. Fjerne medier fra ES cellekultur og tilsættes 500 µL af kerner lysis løsning, herunder RNaseA, direkte til brønde til lyse celler.
      Bemærk: Cellen lysate kan opbevares ved-80 ° C eller behandlet straks.
    2. Med pipette overfoeres op og ned flere gange for at lyse celler fuldt og overføre dem til en ren 1,5 mL tube.
    3. Tilføje en tredjedel af mængden af protein nedbør løsning til 1,5 mL tube, vortex kraftigt i 20 s, chill prøver på is i 5 min, og derefter centrifugeres ved en styrke på 2.000 x g i 5 min. overførsel supernatanten til en anden ren 1,5 mL tube indeholde ning et lige saa stort volumen af isopropanol; forsigtigt blandes løsningen. (Bemærk, at hvid tråd-lignende tråde kan ses på dette tidspunkt.) Der centrifugeres ved en styrke på 2.000 x g i 1 min; derefter, supernatanten.
    4. Vaske gDNA toerstoffet med 1 mL af 70% ethanol ved stuetemperatur, centrifugeres ved en kraft af 2.000 x g i 1 min, Aspirér supernatanten omhyggeligt, og derefter, lufttørre gDNA pellet i 3 min.
    5. Opløse gDNAs med 100 µL DNA rehydrering løsning, og derefter inkuberes ved 65 ° C i 1 time eller ved 4 ° C natten over.
    6. Butik gDNAs ved 2 – 8 ° C.
  2. Fordøje gDNAs med foruddesignede RE Dra I. sæt op en 30-µL fordøjelsen reaktion ved at blande 3 µL af 10 x buffer for Dra jeg, 3 µL af Dra jeg, 10 µg for gDNAs/prøve og H2O op til 30 µL, og der inkuberes ved 37 ° C natten over.
  3. Kontrollere fuldstændigheden af fordøjelsen af DNA gel, analysere 5 µL af den fordøjede reaktion, og derefter tilføje de 3 µL af 10 x DNA-loading bufferen for de efterfølgende skridt.

5. sydlige Blotting og PCR identifikation

  1. Sydlige blotting screening
    1. Adskille de nedbrudte gDNAs af elektroforese og overføres til en membran.
      1. Forberede en 1% elektroforese agarosegel med ethidiumbromid (EB), indlæse prøverne fra trin 4.3 og et 1 kb stigen, og køre gel med en lav spænding (30-40 V) natten over.
      2. Tag gelen og tage et billede med en DNA gel-imaging system efter elektroforese. Kontrollere, om de fordøjet og adskilte gDNAs viser en smear-lignende billede.
      3. Blød gel i en bakke med 0,2 N HCl løsning og ryst den forsigtigt i 20 min. ved stuetemperatur.
      4. Overføre gel til DNA-denatureringen løsning og ryst den forsigtigt i 20 min. ved stuetemperatur.
      5. Skift gel i DNA-neutraliserende løsning og ryst den forsigtigt i 20 min. ved stuetemperatur.
        Bemærk: Gelen er tilbøjelig til brud efter dette trin, så det skal håndteres forsigtigt.
      6. Bruge det hurtige nedadgående transfersystemet for at overføre de udpegede nationale myndigheder fra gel til membranen. Saml TurboBlotter og blotting stak ifølge vejledningen fra fabrikanten.
        Bemærk: 10 x eller 20 x saltvand-natrium citrat (SSC) løsning bruges som en overførsel buffer. I almindelighed, er 3 h for overførsel nok til at overføre 95% af gDNAs fra gel til membran; men en længere tid af overdragelsen er uskadelige.
      7. Tag membranen og vaske det med 2 x SSC for 1 min, absorbere væske med væv, og derefter krydse-link DNA med membranen ved hjælp af en UV-crosslinker.
        Bemærk: Membranen kan opbevares ved 4 ° C for en uge.
    2. Label DNA-sonder med radioaktivitet.
      1. Rense sonde plasmider ved hjælp af en miniprep kit i henhold til protokollen fastsat af fabrikanten.
      2. Release DNA fragmenter af sonder fra plasmid vektor af EcoR fordøjelsen i en reaktion løsning herunder 5 µL af buffer for EcoR I, 2 µL af EcoR jeg enzym, 20 µg af plasmid DNA og H2O op til 50 µL , for 2 h.
      3. Køre en 1% DNA gel til at adskille sonde DNA fragmenter fra vektor og rense DNA fragmenter af sonder med en DNA gel udvinding kit i henhold til protokollen fastsat af fabrikanten.
      4. Ved hjælp af 1 µL af DNA løsning, måle DNA koncentrationen af sonden DNA fragmenter med et spektrofotometer ved en bølgelængde på 260/280 nm.
      5. Forberede 40-ng af sonden DNAs i 1,5 mL rør med 45 µL af TE buffer, kog i 3 min., spin kortvarigt, og derefter placere røret på is i 2 min.
      6. Tilføje varme-denatureret sonde DNAs til røret med klar-til-go DNA-mærkning perler (-dCTP), afpipetteres op og ned for at blandes, tilsæt 5 µL af [α32P] dCTP, og derefter inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
      7. Rense de mærkede sonder ved hjælp af G-50 microcolumns ifølge vejledningen fra fabrikanten, og derefter måle radioaktivitet af en scintillation counter (valgfrit).
    3. Krydse membrane(s) med mærket sonder.
      1. Prehybridize membranen.
        1. Prewarm hybridisering løsning på 42 ° C i 30 min. Bland 20 mL af forvarmet hybridisering løsning med 200 µg af kogt laks sæd DNA i en 50 mL tube.
        2. Sted membran ind i hybridisering rør. Tilføje den blandede prehybridization løsning til hybridisering tube. Læg det i hybridisering ovn (sæt rullende og temperatur på 42 ° C) og lad prehybridization gå videre i 30 min.
      2. Krydse membranen med den mærket sonderne.
        1. Tag hybridisering tube og hæld den prehybridization løsning i en 50 mL tube; tilføje denatureret sonden (opvarmet ved 100 ° C i 3 min) fra trin 5.1.2.7 til dette rør og bland forsigtigt.
          Bemærk: Reducere nogen overtalelse bobler.
        2. Vende tilbage til blandet løsning til hybridisering tube og udføre hybridisering på 42 ° C natten over.
    4. Vask membrane(s) for at fjerne nonhybridized sonder.
      1. Opstille membrane(s) i en bakke med 1 x VSK + 0,1% SDS og Ryst forsigtigt på 55-60 ° C i 10 min.
      2. Overførsel af membrane(s) til en bakke med 0,5 x VSK + 0,1% SDS og Ryst forsigtigt på 55-60 ° C i 10 min.
      3. Kontrollere radioaktivitet på membrane(s) ved hjælp af en bærbar geigertæller for at afgøre om en tredje vask er påkrævet.
    5. Udsætte radioaktivitet på membran til X-ray film.
      1. Fjern væsken fra den vasket membrane(s).
      2. Omslutte membrane(s) med plastfolie og lave det/dem i eksponering kassette.
      3. Udsætte membran til to plader af X-ray film i et mørkt rum.
      4. Placere eksponering kassette på-80 ° C natten over eller længere.
    6. Udvikle film for at visualisere resultatet. Vurdere, om en tilsvarende ES klon er den ønskede med den målrettede rekombination eller ikke, ifølge størrelser af DNA bands opdaget af sonderne.
    7. Rehybridize den samme membran af en anden sonden efter stripning off de anvendte sonden efter følgende procedure: tegne den anvendte membran, vaske det 1 x med ren H2O og derefter inkuberes det i striping løsning (55% formamid, 2% SSPE, 1% SDS, H 2 O) på 65 ° C med blid ryster for 1-2 h.
  2. PCR identifikation
    1. Udføre PCR identifikation af de ønskede ES kloner i en 50 µL reaktion løsning herunder 5 µL af 10 x PCR buffer, 2 µL af 50 mM MgSO4, 1 µL af 10 mM dNTP, 1 µL af 20 µM fremad primer, 1 µL af 20 µM omvendt primer , 1 µL af high-fidelity platin Taq, gDNAs (~ 100 ng), og H2O op til 50 µL.
    2. Brug følgende PCR reaktionsbetingelser: en indledende denaturering på 94° C i 3 min, 30 cyklusser af denaturering på 94° C til 30 s, udglødning ved 60° C i 30 s og en forlængelse på 68° C for 132 s, og et sidste skridt af 68° C i 10 min.
    3. Analysere PCR-produkter af elektroforese i 1,0% agarosegelelektroforese.
    4. Klon PCR fragmenter med deres forventede størrelse ind i T-let vektor og rækkefølge for at bekræfte tilstedeværelsen af en delsekvens af target vektor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette papir, er en detaljeret protokol sydlige blotting og PCR beskrevet, som er udnyttet til at identificere HR begivenheder, der fandt sted i mus ES-celler for generation af NM II genetiske udskiftning musemodeller, ved hjælp af ES celler-baserede HR-medieret målretning teknologi. Selvom det sydlige blotting og PCR, samt traditionelle gen-targeting teknologi, har været meget anvendt i flere årtier, skal vellykket anvendelse af dem planlægges omhyggeligt. Mindst disse aspekter skal tages i betragtning: længden af de lange og korte arme, holdninger og længden af sonder, passende REs til at skære de genomisk DNAs og primere for PCR, som sammenfattet i figur 1, som er nyttige for efterfølgende analyse. Som et vigtigt skridt i det sydlige blotting, forberedt og fordøjet genomisk DNAs skal adskilles på DNA gel til påvisning af sonden. Fordi genomisk DNAs er skåret ind i en masse fragmenter med forskellige længder, viser de en smear-lignende status på DNA gel, tyder på en komplet foraskning af de genomiske DNAs, som angivet i figur 2. Som et sidste skridt af sydlige blotting, er signaler om en radioaktivitet-mærket sonden hybridizing med en target DNA fragment vist på filmen, som afspejler forekomsten af HR begivenheder i ES kloner, derved med angivelse af om en ES klon er den ønskede. Ifølge predesign i denne undersøgelse har ES kloner med muterede allel to forskellige størrelse bands, mens vildtype ES kloner kun har ét band, tyder på de ønskede ES kloner er heterozygous (figur 3). I forhold til proceduren og resultaterne af det sydlige blotting, drift og resultaterne af PCR er enkle og direkte. Efter PCR reaktionen, PCR produkter kan analyseres på DNA-gel. Hvis PCR bands er specifikke og sekventering af klonede PCR produkter bekræfter tilstedeværelsen af delsekvens af target vektor som en neo-resistens gen samt genomisk regioner, der er lige uden for homologi arm, kan forekomsten af HR begivenheder være forventet og kontrolleret (figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Målretning konstruktioner. Dette er en skematisk demonstrerer generation af flere målretning konstruktioner. Wild-type (WT) Myh9 gen allel, gen-targeting vektor, udskiftning eksogene udtryk cassette(s), og den deraf følgende muterede allele(s) samt sonder (LP, RP) for det sydlige skamplet og primere (P1, P2) for PCR, er vist og beskrevet tidligere 27. en pil på exon 2 angiver webstedet translationel indledning. Efter den vellykkede forekomst af HR, udskiftning udtryk kassette og neomycin resistens gen (Neor) indsættes kun 5' af den igangsættende ATG codon. Derfor, den endogene Myh9 allel er forstyrret og bankede i molekylærgenetisk er/er udtrykt i de muterede celler og mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Fordøjet genomisk DNAs med Dra I. Genomisk DNAs fra ES kloner målrettet med konstruktionen erstatter NMHC II-A med II-B er fordøjet med Dra og derefter adskilt på en agarosegel af elektroforese. En smear-lignende fordøjet gDNA er observeret. C1 - C8 skildrer enkelte ES kloner. En komplet foraskning af gDNA producerer en masse DNA fragmenter med en anden længde, hvorved viser en smear-lignende billede. Dette resultat afspejler også den gode kvalitet af rede gDNAs og fuldstændigheden af fordøjelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentative resultater af det sydlige blotting. Disse paneler viser en sydlige blotting screening af de genomiske DNAs fra ES kloner målrettet med konstruktionen af erstatter NMHC II-A II-AB, ved hjælp af de venstre og højre sonder. Den muterede allel viser en 12,1 kb eller 6 kb band når venstre sonde eller højre sonde anvendes, henholdsvis, mens WT viser en 9,7 kb band. M: markør; PC1-PC5: positiv kloner; NC: negative klon. Størrelser af de sydlige blotting bands er også angivet. Alle procedurer i det sydlige blotting gennemføres strengt og specificitet af sonderne er god nok; der bør være nogen uspecifik bands forventer for de forventede bands. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Repræsentative resultater af PCR. Dette panel viser PCR identifikation af de genomiske DNAs fra ES kloner målrettet med konstruktionen af erstatter NMHC II-A med II-BA ved hjælp af primer par P1 + P2. Den muterede allel udbytter en 2.1 kb band, mens WT-allel udbytter ingen bånd. M: markør; PC1-PC3: positiv kloner; NC: negative klon. Størrelsen af PCR band er også angivet. Da primere er designet til kun opdage den muterede allel, afspejler udseendet af en enkelt og forventede band specificiteten af primere og den høje kvalitet af de forberedte gDNAs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I øjeblikket, ikke kan designer nukleaser for genom-redigering stadig erstatte ES cellebaserede gen-targeting teknologi på grund af dens problemer af off-target effekter, og svært ved at indsætte en lang DNA fragment30,31. Som de gyldne metoder til at identificere HR begivenheder, der fandt sted i mus ES celler, indeholder denne rapport en detaljeret protokol sydlige blotting og PCR for feltet. Vi valideret pålideligheden af disse metoder ved at analysere enkelte kloner fra mus ES-celler rettet med en serie af konstruktioner. De ønskede ES kloner identificeret ved disse metoder havde held været anvendt til at generere tilsvarende mus modeller27.

Selvom andre teknikker til screening af målrettede ES kloner har været beskrevet19,32, metoder til sydlige blotting og PCR kan ikke erstattes helt af etableret dem derefter32, fordi disse indledende teknikker har en længere anvendt historie og er almindeligt accepteret og bekræftet af det videnskabelige samfund, udført af de fleste biologiske labs, og er oprindelsen af andre teknologier. Vigtigere, er de gode resultater i det sydlige blotting og PCR for identifikationen af HR begivenheder godt eksemplificeret i tidligere arbejde29. Resultaterne fra det sydlige blotting angiver flere unikke features: blandt de tilfældigt screenede ES kloner, over 90% af dem er ønskede dem, ingen uspecifik bands er opdaget og HR opstod fortrinsvis på én allel af Myh9-genet. I mellemtiden, bekræfter dataene fra PCR, sammen med sekventering, at forekomsten af HR begivenheder er lokationsspecifikke og passer godt med dem fra det sydlige blotting.

Ifølge vores praksis, bør flere faktorer overvejes, når det sydlige blotting og PCR bruges til at identificere HR begivenheder i ES-celler, derved at opnå god og forventede resultater. Den første er længden af homologi våben; generelt vil stigende homologi arm længde øge effektiviteten af HR33. Dette er imidlertid ikke altid tilfældet. På den ene side gøre længere arme sværere for manipulation; på den anden side resulterede længden af homologi våben (4 kb for venstre arm og 1,7 kb for højre arm) rapporteret her i den højeste HR frekvens opnået hidtil blandt lignende eksperimenter. Derudover letter en rimelig længde af homologi arme identifikation af PCR. Anden er udnyttelsen af isogene DNA for at forberede homologi arme og sydlige blotting sonder34. Dette kan opfyldes ved at bestille en BAC klon der indeholder regionen af genet af interesse eller ved hjælp af genomisk DNA fra celler skal være målrettet. Tredje er udvælgelsen af egnede REs for fordøje genomisk DNAs. Generelt, er en RE eller en kombination af to REs, at skære den wild-type eller mutant allel kun én eller to gange rundt om regionen målretning at foretrække; Desuden, den deraf følgende større DNA-fragment bør ikke overstige 15 kb og størrelse forskellen mellem de forskellige DNA-fragmenter er over 2 kb. Disse krav kan lette adskillelse og identifikation af forventede bands af sydlige blotting. Fjerde er længden af sonderne og mindst ligheden med andre sekvenser i genomet. Generelt, længden af sonderne er 500-1.000 bp. Ligheden med andre sekvenser i genomet kan analyseres med programmet NCBI BLAST. Derudover beskrevet en software, der anvendes til design sonder til sydlige blotting har været35. Den femte faktor overvejes er at bruge de konventionelle metoder til at forberede et bedre udbytte genomisk DNA. Genomisk DNAs forberedt fra en sammenflydende godt af en 48-godt plade er generelt nok for mindst to runder af det sydlige blotting analyser. At designe primere til PCR, er den bedste strategi at bruge en primer til stede på udvalg markør sammenholdt med en primer uden for målretning armene. Derudover er sekventering af PCR produkter vigtige for at bevise HR begivenheder20,36. Navnlig, kan ikke PCR-baseret screening helt erstatte oplysningerne gennem det sydlige blotting, mens det effektivt kan reducere antallet af kloner skal evalueres.

Afslutningsvis er sydlige blotting og PCR godt dokumenteret metoder til screening ES kloner til at identificere HR-medieret gen-targeting begivenheder i ES-celler. Selvom detaljerede protokollen beskrevet her hovedsagelig fokuserer på screening af ønskede NM II genetiske udskiftning ES kloner, kan det bruges til genotypebestemmelse mus, der efterfølgende oprettes ved hjælp af de positive ES kloner. Det kan tilpasses nemt til identifikation af HR begivenheder i andre celletyper såsom iPS-celler eller somatiske celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde fik støtte fra programmet General National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 31571432), den menneskelige Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 2015JC3097) og den forskning fundament af uddannelse Præsidiet af Hunan (Grant No. 15 K 054)-provinsen, Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BAC CLONE BACPAC Resources Center (BPRC) bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct Kit QIAGEN 12462
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit QIAGEN 12963
PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase Agilent 600382
T-easy vector Promega A1360
Nuclei Lysis Solution Promega A7941
Protein Precipitation Solution Promega A7951
DNA Denaturing Solution VWR 351-013-131
DNA Neutralizing Solution VWR 351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) VWR 27-9240-01
UltraPure SSC, 20x Thermo Fisher 15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Thermo Fisher 15593031
G418 Thermo Fisher 10131035
Salmon Sperm DNA Solution Thermo Fisher 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher 11304029
Not I Thermo Scientific ER0592
Dra I Thermo Scientific ER0221
EcoR I Thermo Scientific ER0271
Ganciclovir Sigma G2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits Fisher Scientific 09-301-188
[α32P]dCTP PerkinElmer NEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro Columns GE Healthcare 28-9034-08
Hybrisol I Hybridization Solution Millipore S4040
Kodak X-Ray Film Z&Z Medical 844 5702

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

Tags

Genetik sag 141 homologe rekombination gen målretning sydlige blotting PCR mus embryonale stamceller sonde primer genetiske udskiftning knockout/knock-i Myh9 gen genomisk DNA
Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T.,… More

Zhou, D., Tan, L., Li, J., Liu, T., Hu, Y., Li, Y., Kawamoto, S., Liu, C., Guo, S., Wang, A. Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (141), e58467, doi:10.3791/58467 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter